Diabetická retinopatie a změny nervových vláken hodnocené konfokální mikroskopií rohovky

Cíl:
Testovat korelaci změn subbazálního nervového plexu rohovky a stupně diabetické retinopatie u pacientů s diabetes mellitus 1. typu (DM 1).

Metodika:
Konfokální mikroskopií rohovky bylo vyšetřeno 38 pacientů rozdělených do tří skupin podle stupně diabetické retinopatie (DR) a 12 zdravých dobrovolníků. Byl hodnocen počet všech nervových vláken a počet hlavních vláken (t-CNFD, CNFD), celková délka (CNFL) a jejich tortuozita (CNFT).

Výsledky:
CNFD byla u pacientů bez diabetické retinopatie, s lehkým a těžkým stupněm DR nižší než u zdravých jedinců (p < 0,0001; p = 0,004; p < 0,0001). CNFD byla nižší ve skupině s těžkým než s lehkým stupněm DR (p = 0,036). T-CNFD byla nižší ve skupině bez DR a s těžkým stupněm DR než u zdravých jedinců (p = 0,024; p < 0,0001). CNFL byla nižší ve skupině bez DR a s těžkým stupněm DR než u zdravých jedinců (p = 0,007; p < 0,0001) a u pacientů s těžkým stupněm oproti lehkému stupni DR (p = 0,028). CNFT byla vyšší ve skupině s těžkým stupněm DR oproti zdravým jedincům i skupině bez DR (p < 0,0001; p = 0,001).

Závěr:
Prokázali jsme postižení nervových vláken rohovky ve všech skupinách pacientů s DM 1. Změny byly výraznější u pacientů bez DR než s lehkým stupněm DR. To naznačuje, že míra postižení nervových vláken rohovky a stupeň DR neprobíhají paralelně.

Klíčová slova:
konfokální mikroskopie – rohovka – neuropatie tenkých vláken – diabetes mellitus 1. typu – diabetická retinopatie

Úvod

Počet pacientů s diabetes mellitus (DM) v posledních letech celosvětově značně narůstá. Od počátku 21. století se hovoří již o epidemii diabetu [1]. Diabetická retinopatie (DR) a neuropatie (DN) jsou spolu s diabetickou nefropatií nejvážnější mikroangiopatické komplikace DM.

Z hlediska oftalmologie je v popředí zájmu především DR, která je vedoucí příčinou slepoty ve vyspělých zemích ve věkové kategorii 25–65 let. Prevalence u pacientů s DM 1. typu (DM 1) je až 71 % [2]. Její výskyt stoupá s délkou trvání DM 1 a po 20 letech má alespoň lehký stupeň DR až 92 % pacientů [3] .

Vedle DR se v oftalmologii v současné době věnuje značná pozornost změnám v rohovce a ostatních tkáních povrchu oka [4]. Rohovka patří mezi tkáně s nejhustší inervací v lidském těle. Hustota nervového zakončení je 300–400× větší než v lidské pokožce. Nervové zásobení rohovky je tvořeno volnými terminálními zakončeními senzitivních nervových vláken nn. ciliares longi (n. ophthalmicus via n. nasociliaris). Vstupují do rohovky skrz skléru v oblasti limbu rohovky a vytvářejí stromální plexus (stromální nervová vlákna). Před průchodem Bowmanovou membránou se vlákna větví do subbazálního nervového plexu, poté se otáčí o 90 stupňů směrem k povrchu rohovky, prochází Bowmanovou membránou a končí jako volná subepiteliální nervová zakončení [5–7]. Vlákna subbazálního nervového plexu probíhají paralelně s povrchem rohovky, proto jsou velmi dobře hodnotitelná ve svém průběhu pomocí nově se rozvíjející zobrazovací metody – in vivo konfokální mikroskopie rohovky (Corneal Confocal Microscopy; CCM) [8]. Termín konfokální (confocal) znamená „mající společné ohnisko“ a označuje se jím optické uspořádání, ve kterém jsou objektiv a kondenzor mikroskopu zaostřeny na stejný bod neboli ohnisko. U CCM je světlo bodového zdroje zaostřeno na vybraný bod do roviny objektu a světlo odražené je zaostřeno na bodovou clonu, která zachytí světlo přicházející z okolí, tzn. ze stran a z míst nad ohniskovou rovinou i pod ní. Tato clona tedy působí jako prostorový filtr a světlo nenesoucí informaci ze zvoleného bodu je z tvorby výsledného obrazu vyloučeno. Konfokální obrazy jsou vždy zaostřené a představují optické řezy vzorkem. Výsledná zobrazovací soustava má malou hloubku ostrosti a vysokou rozlišovací schopnost [9]. Díky tomuto uspořádání získáme obraz jednotlivých vrstev rohovky ve frontální rovině. In vivo tak lze hodnotit změny struktury všech vrstev rohovky na mikroskopické úrovni, vč. nervových vláken subbazálního nervového plexu rohovky [10,11].

Abnormality rohovky u pacientů s DM jsou označovány termínem diabetická keratopatie, která zahrnuje i rohovkovou neuropatii. Ta je důsledkem narušení celistvosti nervové pleteně rohovky [1,12]. Dosavadní studie naznačují velmi dobrou korelaci úbytku nervových vláken subbazálního nervového plexu rohovky hodnoceného pomocí CCM s DN zjištěnou v současnosti používanými klinickými a paraklinickými vyšetřovacími postupy [13]. Obdobně jako u DR výskyt DN stoupá s délkou trvání diabetu, přičemž její prevalence je až 50 % [14]. Společný patofyziologický podklad uváděný v patofyziologických, epidemiologických a některých genetických studiích naznačuje závislost výskytu DR (zejména těžších stupňů) a DN [15].

Cílem naší prospektivní studie bylo porovnat stav nervových vláken subbazálního nervového plexu rohovky u pacientů s DM 1 s různým stupněm DR a kontrolní skupinou jedinců bez DM.

Materiál a metodika

Do studie byli zařazeni dospělí pacienti Oční kliniky dětí a dospělých 2. LF UK a FN Motol a dobrovolníci z řad zdravých pacientů, personálu a studentů 2. LF UK. Všichni účastníci studie podepsali informovaný souhlas schválený etickou komisí FN Motol. V rámci očního vyšetření byla odebrána celková a oční anamnéza a zároveň bylo provedeno zhodnocení předního a zadního segmentu oka. Do studie byly zařazeny jen subjekty s normálním nálezem na předním segmentu oka. Ze studie byli vyřazeni nositelé kontaktních čoček a pacienti s onemocněním nebo po operaci předního segmentu oka, glaukomem a ostatní pacienti užívající chronickou lokální terapii s obsahem konzervačních látek. Pacienti s DM 1 byli dle Early Treatment of Diabetic Retinopathy Study (ETDRS) rozděleni na tři skupiny dle stupně DR [16,17]. První skupinu tvořili pacienti bez DR. Druhá skupina obsahovala pacienty s nálezem neproliferativní diabetické retinopatie (NPDR) maximálně do stupně modica (NPDR levis + modica) označované jako lehký stupeň DR nevyžadující laserové ošetření sítnice v rozsahu panretinální fotokoagulace sítnice (PRP). Třetí skupinu tvořili pacienti s proliferativní diabetickou retinopatií (PDR) a těžkou NPDR (NPDR gravis + PDR) označovanou jako těžký stupeň DR, u kterých již pro pokročilost ischemických změn sítnice je zahájení laserového ošetření sítnice v rozsahu PRP dle ETDRS indikováno. Následně byly vzájemně porovnány nálezy u skupiny zdravých jedinců a jednotlivých skupin s DM 1 rozdělených dle stupně DR.

Bylo provedeno vyšetření rohovky pomocí in vivo konfokálního mikroskopu (Confoscan 3.0, NIDEK Technologies, Itálie). Tento typ konfokálního mikroskopu používá pro osvětlení i pozorování aperturu ve formě úzké vertikální štěrbiny (Slit-Scanning Confocal Microscopy; SSCM). Zdrojem světla je 12V halogenová lampa. Mikroskop je vybaven 40× zvětšujícím, bezkontaktním, imerzním objektivem (Achroplan, Zeiss, Oberkochen, Germany). Laterální rozlišení je udáváno 1–2 µm, axiální rozlišení přibližně 26 µm. V souladu s návodem k použití byla po lokální aplikaci 0,4% oxybuprokainu (Benoxi, Unimed Pharma) a nanesení imerzního gelu (carbomerum, Vidisic gel, Bausch & Lomb) skenována centrální oblast rohovky (450 × 335 µm) v celé její tloušťce (v automatickém nebo semiautomatickém modu, 350 snímků na jeden cyklus). Předozadní posun objektivu byl nastaven na 5 µm. U každého oka bylo snímání provedeno nejméně dvakrát, sledovaná oblast rohovky byla zachycena min. 4–6krát. Následně byl vybrán nejkvalitnější snímek subbazálního nervového plexu z pravého i levého oka a průměr těchto hodnot použit k dalšímu hodnocení [18]. Confoscan 3 produkuje snímky s horší kvalitou v okrajových částech [19], proto byla hodnocena nervová vlákna pouze v centrální ostré části skenu o ploše 0,10 mm². Byla posuzována denzita nervových vláken na mm² (CNFD = počet hlavních vláken, t-CNFD = počet všech zachycených vláken; počet/mm²), celková délka nervových vláken na mm² (CNFL; mm/mm²) a tortuozita nervových vláken (CNFT; bezrozměrné číslo, poměr absolutní délky zachyceného nervového vlákna k délce spojnice krajních bodů) [20]. Vyšetření konfokálním mikroskopem a následné hodnocení snímků prováděl u všech sledovaných subjektů pouze jeden vyšetřující (GM) bez znalosti celkového a očního nálezu.

Statistické vyhodnocení výsledků bylo provedeno pomocí IBM softwaru SPSS v.23 (Shapirův-Wilkův test pro ověření normality dat, ANOVA a Bonferroni post-hoc test pro testování rozdílů mezi skupinami) a IBM SamplePower v.23 software byl použit pro zhodnocení statistické síly použitých testů. Výsledky jsou uváděny jako průměr ± směrodatná odchylka. Hodnota p ≤ 0,05 byla považována za statisticky významnou.

Výsledky

Celkem bylo vyšetřeno 50 subjektů (23 mužů a 27 žen) – 38 pacientů s DM 1 a 12 zdravých jedinců. Průměrná úroveň kompenzace hodnocená na základě hodnoty glykovaného hemoglobinu (HbA_1C) se mezi jednotlivými skupinami DR statisticky významně nelišila (p = 0,86) (tab. 1). Rovněž průměrný věk se mezi jednotlivými skupinami pacientů ani kontrolní skupinou statisticky významně nelišil (p = 0,80). Doba trvání diabetu byla u pacientů s těžkým stupněm DR statisticky významně delší než u pacientů bez DR a s lehkým stupněm DR (p = 0,009). U všech vyšetřovaných očí byly získány kvalitní a dobře hodnotitelné snímky subbazálního nervového plexu rohovky.

Ve všech sledovaných parametrech nervových vláken byly prokázány testem ANOVA statisticky významné rozdíly mezi skupinami (p < 0,0001) při statistické síle testu > 99 %. Při hodnocení CNFD byl ve všech skupinách pacientů s DM 1 (bez DR, s lehkým stupněm DR a těžkým stupněm DR) prokázán úbytek počtu nervových vláken ve srovnání se zdravými jedinci (p < 0,0001; p = 0,004, resp. p < 0,0001) (graf 1). Rovněž počet nervových vláken byl statisticky významně nižší ve skupině s těžkým stupněm DR než ve skupině s lehkým stupněm DR (p = 0,036) (graf 1). Při srovnání počtu všech zastižených vláken (t-CNFD) byl prokázán statisticky významně nižší počet nervových vláken u pacientů ve skupině bez DR a ve skupině s těžkým stupněm DR než u zdravých jedinců (p = 0,024; resp. p < 0,0001) (graf 2). Obdobně při srovnání CNFL byl prokázán statisticky signifikantní pokles celkové délky vláken ve skupině bez DR a s těžkým stupněm DR oproti hodnotám zdravých jedinců (p = 0,007; resp. p < 0,0001) (graf 3). Zároveň byla prokázána nižší hodnota CNFL u pacientů s těžkým stupněm DR i oproti pacientům s lehkým stupněm DR (p = 0,028). Při zhodnocení CNFT byl naopak patrný nárůst tortuozity ve skupině s těžkým stupněm DR ve srovnání se skupinou zdravých jedinců i skupinou bez DR (p < 0,0001; resp. p = 0,001) (graf 4).

Podrobně jsou výsledky pro CNFD, t-CNFD; CNFL a CNFT pro jednotlivé sledované skupiny uvedeny v tab. 2.

Diskuze

U pacientů s DM bylo opakovaně prokázáno poškození nervových vláken subbazálního nervového plexu rohovky pomocí CCM. Změny korelují s výskytem a progresí DN [13,21]. Studie naznačují, že poškození nervových vláken rohovky může předcházet diagnóze DN stanovené běžnými klinickými a elektrofyziologickými testy [22–24]. Dokonce bylo prokázáno poškození nervových vláken u subjektů pouze s diagnózou poruchy glukózové tolerance [25].

Mezi mikroangiopatické komplikace diabetu patří DN stejně jako DR. Jen omezené množství studií, převážně u pacientů s DM 2. typu nebo v souborech obsahujících současně pacienty s DM 1. a 2. typu, se dosud zabývalo možným vztahem stupně DR a rozsahem poškození vláken subbazálního nervového plexu rohovky, přestože se jedná o hlavní oční komplikaci DM [17,26– 30]. Hodnocení úbytku nervových vláken subbazálního nervového plexu rohovky na souboru dospělých pacientů pouze s DM 1, ve vztahu k stupni DR, nebyla zatím věnována dostatečná pozornost.

Porovnávání jednotlivých výsledků ze studií je komplikováno nejednotností používaných přístrojů a používáním různé metodiky hodnocení snímků a následné analýzy získaných dat [21]. Tavakoli et al publikovali normativní hodnoty sledovaných parametrů nervových vláken rohovky u zdravých jedinců za použití přístroje Heidelberg Retina Tomograph (HRT III) Rostock Cornea module (RCM) využívající na rozdíl od našeho přístroje laser skenovací systém (CLSM) [31]. Tento systém dosahuje axiálního rozlišení až 4 µm, a umožňuje tím lepší detekci nervových vláken rohovky [21]. Pro ostatní dostupné konfokální mikroskopy jednotná normativní databáze chybí.

Hodnoty získané z různých typů přístrojů tak nejsou přímo porovnatelné [19,32] a průměrné hodnoty CNFD a CNFL se liší dle použitého vyšetřovacího přístroje či použité metodiky, která je v jednotlivých studiích rovněž rozdílná.

Hodnoty počtu nervových vláken (CNFD) jsou obecně při použití přístroje typu SSCM vyšší než při použití LCSM. CNFD se obvykle definuje jako počet hlavních nervových vláken. Právě nižší rozlišovací schopnost SSCM přístroje může být důvod, že rozpoznání „hlavních“ vláken (CNFD) je obtížnější a počet je nadhodnocován oproti studiím s LSCM [29,31,33]. V naší práci jsme proto sledovali i počet všech zachycených vláken (t-CNFT). Tento parametr se však nezdá být přesnější a přínosný. Hodnota celkové délky nervových vláken je naopak při použití SSCM nižší [32,34].

V naší studii jsme v souladu s předchozími pracemi prokázali pokles hodnot CNFD a CNFL u pacientů s DM 1 při srovnání se zdravými subjekty [17,27–30]. Při hodnocení nervových vláken subbazálního nervového plexu u pacientů rozdělených dle stupně DR jsme prokázali signifikantně nižší průměrné hodnoty CNFD ve všech třech skupinách pacientů s DM 1 oproti kontrolní skupině. Důvodem může být i poměrně dlouhá průměrná doba trvání DM ve všech našich skupinách pacientů, která je delší než 15 let. Zároveň jsme prokázali ve shodě s předešlými pracemi nižší hodnoty CNFD i CNFL u pacientů s těžkým stupněm DR vzhledem k lehkému stupni DR [17,29], a také u pacientů bez DR oproti zdravým jedincům. Naopak mezi zdravými jedinci a pacienty s lehkým stupněm DR se CNFL nelišila.

Tento výsledek může naznačovat nelineárnost výskytu jednotlivých orgánových komplikací u pacientů s DM 1. Zhivov et al v souladu s našimi výsledky uvádějí rovněž statisticky významně nižší hodnoty CNFD i CNFL již u pacientů s DM 1 bez klinicky prokazatelné DR ve srovnání se zdravými jedinci [30]. Ve studii Utsunomiya et al se obdobně jako v našem souboru počet nervových vláken i jejich celková délka u pacientů bez DR statisticky významně nelišily od skupiny pacientů s lehkou DR či těžkou DR a jejich průměrná hodnota se dokonce spíše blížila hodnotě pacientů s těžkou DR [17].

Vysvětlením může být polymorfizmus mikrovaskulárních komplikací vedoucích k DR a rohovkové neuropatii [15]. Jiným možným vysvětlením může být fakt, že diagnostika počínající DR vede u pacientů s DM 1 k intenzifikaci terapie a/ nebo k odpovědnějšímu přístupu pacienta k léčbě, a tím ke zlepšení kompenzace, což může umožnit i částečnou regeneraci nervových vláken [35,36]. V našem souboru ovšem této hypotéze neodpovídají aktuální hodnoty glykovaného hemoglobinu, i když tento nezobrazuje dynamiku vývoje onemocnění v delším časovém úseku, jenž je zásadní pro pomalý rozvoj orgánových komplikací, vč. neuropatie [37]. Dalším prokázaným významným faktorem pro rozvoj orgánových komplikací je délka trvání DM 1 [3]. Ta se v našem souboru ve skupině bez DR a lehkým stupněm DR nelišila.

Nejednotnost v metodice je ještě výraznější při stanovení tortuozity. Ve starších studiích je tortuozita hodnocena subjektivně na stupnici 1– 4 [27,28]. Některé další studie se pokoušely zavést automatizované či semiautomatizované hodnocení tortuozity za asistence individuálně zhotoveného softwaru, ale výsledky jsou nejednoznačné [21]. Messmer et al upozorňují na fakt, že při současném úbytku nervových vláken (pokles CNFD a CNFL) nemusí být nárůst tortuozity prokázán [28].

V našem souboru jsme proto testovali hodnocení tortuozity dle metodiky, jež byla použita při posuzování tortuozity drobných tepen v kardiologii [20]. Při použití této techniky jsme v souladu s výsledky některých předešlých studií [27,29] potvrdili nárůst tortuozity vláken subbazálního nervového plexu u pacientů s těžkým stupněm DR oproti zdravým jedincům. Přestože průměrné hodnoty tortuozity se zvyšovaly paralelně s progresí DR, statisticky se CNFT u pacientů bez DR a s lehkým stupněm DR významně nelišila od zdravých kontrol. Ve shodě s De Cilia et al jsme prokázali statisticky významný nárůst tortuozity mezi skupinami bez DR a s těžkým stupněm DR [27]. Použitou metodiku je třeba ještě dále ověřit a posoudit její vhodnost v návaznosti na další práce zaměřené na postupy k hodnocení tortuozity nervových vláken rohovky [38,39].

Ačkoli je DR považována za mikroangiopatickou komplikaci, nemůže být považována jen za izolovanou vaskulární patologii. Obecněji je možné DR posuzovat jako neurosenzorické postižení odrážející systémové a lokální metabolické procesy při DM, které zahrnují nejen změny cév sítnice. Obdobně jako u DN může docházet k postižení cévního zásobení jednotlivých nervových vláken [40]. Pravděpodobné buněčné neurodegenerativní změny v oku, vč. rohovky, by tak mohly předcházet změnám sítnice [30].

Limitem naší studie je poměrně malý soubor pacientů. Výsledky je tak nutno ověřit na větším souboru. Dle dostupných publikací je počet pracovních týmů zabývajících se touto problematikou dosud jen velmi omezený. Tato pracoviště převážně využívají konfokální mikroskop typu LSCM. Naše studie však demonstruje, že přes určitá omezení v zobrazování nervových vláken systémem SSCM, která neumožňují přímo srovnávat výsledky se studiemi na LSCM, jsou výsledné závěry ohledně vlivu DM na nervová vlákna rohovky srovnatelné. Bez ohledu na absolutní hodnoty lze jednoznačně prokázat úbytek nervových vláken u diabetických pacientů. Je však třeba si uvědomit, že pro případné sledování změn v čase jsou použitelné pouze snímky získané na stejném typu přístroje.

Seznam použitých zkratek

CCM – konfokální mikroskopie rohovky (Corneal Confocal Microscopy)
CLSM – laser-scanning konfokální mikroskopie (Laser-Scanning Confocal Microscopy)
CNFD – počet hlavních nervových vláken rohovky (Corneal Main Nerve Fiber Density)
CNFL – celková délka nervových vláken rohovky (Corneal Nerve Fiber Lenght)
CNFT – tortuozita nervových vláken rohovky (Corneal Nerve Fiber Tortuosity)
DM – diabetes mellitus
DM 1 – diabetes mellitus 1. typu
DR – diabetická retinopatie
ETDRS – Early Treatment of Diabetic Retinopathy Study
SSCM – slit-scanning konfokální mikroskopie (Slit-Scanning Confocal Microscopy)
t-CNFD – počet všech nervových vláken rohovky(Corneal Total Nerve Fiber Density)
DN – diabetická neuropatie
PDR – proliferativní diabetická retinopatie (Proliferative Diabetic Retinopathy)
NPDR – neproliferativní diabetická retinopatie (Non-Proliferative Diabetic Retinopathy)
PRP – panretinální fotokoagulace (Panretinal Photocoagulation)
HbA_1C – glykovaný hemoglobin

Podpořeno projektem (Ministerstvo zdravotnictví České republiky) koncepčního rozvoje výzkumné organizace 00064203 a projektem CZ.2.16/ 3.1.00/ 24022.

Poděkování Ing. Veronice Konrádové za pomoc při statistickém zpracování dat.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

MUDr. Marie Česká Burdová

Oční klinika dětí a dospělých

2. LF UK a FN Motol

V Úvalu 84

150 06 Praha 5

e-mail: marie.ceska-burdova@fnmotol.cz

Přijato k recenzi: 11. 4. 2016

Přijato do tisku: 14. 10. 2016