Svalová biopsie u myotonické dystrofie v éře molekulární genetiky

Overview

Histopatologické rysy obou v současnosti definovaných forem myotonické dystrofie (MD1 i MD2) jsou velmi podobné, vykazují charakteristický komplex změn. Vyšetření svalových biopsií in situ může kromě toho přinést i zjištění přítomnosti expanzí repetic CUG resp. CCUG v transkriptu mutované DNA, která tvoří genetický základ onemocnění. Expandované úseky lze znázornit ve tkáňových řezech metodou fluorescenční in situ hybridizace (FISH) jako fokální intranukleární inkluze. Pro posouzení významu svalové biopsie v době, kdy je diagnostika MD1 a MD2 založena na DNA analýze lymfocytů z periferní krve, jsme analyzovali výsledky histopatologického vyšetření souboru 34 nemocných, u kterých byla biopsie provedena na základě klinického podezření na myotonickou dystrofii. Diagnóza MD byla potvrzena analýzou DNA pro oba typy onemocnění. FISH byla provedena u 27 z nich. Mutační analýzou DNA byla potvrzena MD1 v 13 případech, MD2 v 10 případech, u 11 pacientů nebyla diagnóza MD1 či MD2 potvrzena. Ve většině případů byl bioptický histopatologický nález u prokázané MD hodnocen buď jako typický pro MD1 či MD2, anebo nález kompatibilní s touto diagnózou. Bioptické nálezy u některých pacientů s MD byly atypické: ve 2 případech byla přítomna zánětlivá infiltrace, v jednom případě obraz připomínající kongenitální myopatii. Naproti tomu histopatologické rysy MD byly zjištěny v některých biopsiích, u nichž diagnóza MD1 ani MD2 nebyla potvrzena. Fokální intranukleární inkluze prokazované FISH byly prokázány u 23 pacientů – ve shodě s výsledky analýzy DNA – u 13 s MD1 a u 10 s MD2. Metodou volby při podezření na myotonickou dystrofii je mutační analýza DNA z periferní krve. V případě provedené svalové biopsie z důvodu atypického klinického obrazu, který nevedl k podezření na MD, však může zhodnocení biopsie vést k dodatečnému molekulárně-genetickému vyšetření pacienta. Metoda FISH v biopsii je zajímavá z teoretického pohledu, neboť umožňuje zkoumat retinovanou RNA v jádrech jednotlivých buněk a tkání postižených pacientů, a tak může napovědět o jejich možné účasti v patogenezi onemocnění.

Klíčová slova:
myotonická dystrofie – biopsie – molekulární genetika – diagnóza

Úvod

Myotonická dystrofie (MD) je autosomálně dominantní neuromuskulární onemocnění s incidencí asi 1/8000. Je to nejčastější forma svalové dystrofie postihující dospělou populaci [1].

Příčinou „klasické“ myotonické dystrofie (DM1) je na molekulárně-genetické úrovni nestabilní trinukleotidová repetitivní sekvence (CTG)n v genu kódujícím protein-kinázu (DMPK - dystrophia myotonica protein-kinase) na chromozomu 19q13.3 [2,3]. Expanze trinukleotidové sekvence má za následek retenci transkriptu genu DMPK v jádře [ 4], která generuje fenotyp MD [5]. Molekulárně genetická diagnostika CTG expanzí na úrovni DNA je možná Southern blot analýzou [2,6] nebo pomocí PCR [7,8]. Retinovanou RNA v jádrech lze prokázat i ve tkáňových řezech hybridizací in situ, fluorescenční (FISH) či chromogenní [5,9,10]. FISH se zakládá na afinitě fluorochromem označené próby ke komplementárním sekvencím DNA či RNA ve tkáních (buňkách, kulturách).

V 90. letech byla studována a postupně rozpoznávána varianta myotonické dystrofie postihující zejména proximální svalové skupiny (MD druhého typu, MD2, PROMM), u níž nebyla prokázána expanze na 19q13.3 [11,12], avšak byla zjištěna repetice (CCTG)n nukleotidů v genu ZNF9 na chromozomu 3q21 [13]. Také tuto repetitivní sekvenci lze prokázat DNA analýzou, a stejně jako u prvního typu byla vypracována i varianta detekce retinované RNA intranukleárně in situ [14,15].

Bylo prokázáno, že je to RNA obsahující zmíněné tri- či tetranukleotidové expanze, která odpovídá za klinické rysy obou forem onemocnění. Expanze jsou inkorporované do ribonukleárních inkluzí, přitom dojde k dysregulaci RNA-vazebných proteinů: ke snížené regulaci rodiny muscleblind proteinů (MBNL) a ke zvýšené regulaci CUG-vazebných proteinů (CUG-BP). Obě tyto dysregulované skupiny proteinů pozměňují či poškozují sestřih transkriptů, které se uplatní v patogenezi MD, zejména transkript chloridového kanálu, receptoru pro inzulin a další [16].

Klinický obraz MD je dobře vymezen, vyznačuje se však mimořádnou variabilitou. I když je MD pokládána za onemocnění kosterního svalstva zahrnující distální myotonii, progresivní slabost a dystrofii, postihuje i další systémy. Postižení často trpí alterací srdečního a hladkého svalstva, dále bývají přítomny katarakta, hypersomnie, abnormální odezva na aplikaci glukózy a u mužů navíc předčasná plešatost a testikulární atrofie. Poruchy srdeční vodivosti mohou mít za následek fatální arytmii, a tak ovlivnit prognózu onemocnění. Nápadným rysem je variabilita fenotypu jak mezi, tak uvnitř postižených rodin [16]. Mnozí pacienti s MD mají příznaky onemocnění již od dětství, zatímco v jiných případech mohou být časné symptomy zjištěny dříve u pacientových dětí než u pacienta samotného. Velmi charakteristická forma onemocnění počínající in utero je pozoruhodná a málo obvyklá [17]. Zatím však byla popsána jen u prvního typu – MD1.

Elektromyografický nález (EMG) není pro diagnostiku rozhodující, jsou-li přítomny jasné klinické symptomy případně rodinná anamnéza. EMG vyšetření je však nezbytné pokud myotonie není zřetelná nebo chybí. V klinicky vyvinutých případech jsou nejčastější několik sekund trvající serie výbojů se snižující se frekvencí a amplitud, provokované inzercí či pohybem jehlové elektrody – myotonické výboje. Volní EMG vykazuje myopatický vzorec [17].

Charakteristické histopatologické rysy onemocnění u MD1 i MD2 jsou velmi podobné. Zahrnují směs neurogenních i myogenních změn. Neexistuje však jediný znak, který by byl typický a charakteristický pro MD, avšak jen seskupení určitých znaků může přinést podporu klinickému podezření na toto onemocnění. Mezi tyto znaky patří zejména zvýšená frekvence a zřetězení vniřních i sarkolematických jader. Častá je i přítomnost atrofických angulárních vláken nebo jaderných shluků s minimem sarkoplazmy, dále prstenčitá vlákna (ring fibres, Ringbinden), přítomnost sarkoplazmatických mas a velikostně-typová dysproporce s nižšími hodnotami průměrů vláken 1 a endo-perimyziální fibróza. V některých případech byla popsána přítomnost degenerativních strukturálních změn až nekróz a známek regenerace [18]. Tyto znaky jsou patrně společné pro MD1 i MD2, i když některé sestavy v recentních sděleních ukazují na rozdíly v typu atrofických vláken (viz níže).

Na naších pracovištích jsme v 90. letech a dříve neměli k dispozici molekulárně genetické diagnostické metody rozlišující oba typy MD a diagnostka spočívala na elektrofyziologických a klinických nálezech většinou doplněných svalovou biopsií. Později byly u nás vypracovány metody mutační analýzy DNA pacientů postižených MD1 i MD2 [19,20] a v minulých letech jsme postupně zaváděli do diagnostické praxe fluorescenční in situ hybridizaci. Vyšetření svalových biopsií in situ (vyšetření in situ znamená vyšetření přítomnosti určitých tkání a orgánů v topografické návaznosti na struktury okolní (situs viscerum), na úrovni tkáně nebo i buňky je to přítomnost a poloha jádra, organel, či sloučenin (glykogen, železo, enzym, protein), a to v kontextu přítomných struktur, na rozdíl od vyšetření extra situm, třeba v homogenátech nebo v extraktech. Patří sem tedy jak histopatologické vyšetření, tak i molekulárně genetické vyšetření: může kromě histopatologické analýzy přinést i zjištění přítomnosti expanzí repetic CUG resp. CCUG v transkriptu mutované DNA, která tvoří genetický základ onemocnění. Expandované úseky RNA lze znázornit ve tkáňových řezech metodou fluorescenční in situ hybridizace (FISH) jako fokální intranukleární inkluze.

V tomto sdělení uvedeme výsledky diagnostiky obou forem MD ze svalových excizí pacientů na základě klinické indikace. Výsledky histopatologické analýzy biopsie a výsledky RNA hybridizace in situ jsou srovnány s výsledky vyšetření DNA metodou PCR.

Materiál a metodika

Analyzovali jsme soubor 34 pacientů (17 mužů od 15 do 64 let a 17 žen od 16 měsíců do 75 let), u kterých byla provedena svalová biopsie na základě klinického podezření z diagnózy myotonické dystrofie. Diagnóza MD1 nebo MD2 byla potvrzena či vyloučena pomocí DNA analýzy u 34 pacientů (tab. 1). V tabulce není zařazeno 13 předchozích bioptických vyšetření z doby, kdy vyšetření MD pomocí molekulárně genetických metod ještě nebylo zavedeno.

Svalové biopsie byly hluboce zmrazeny a kryostatové řezy zpracovány konvenčními histologickými a histochemickými metodami [21,22] doplněnými u 27 nemocných o RNA FISH. V každém vzorku byly hodnoceny tyto parametry: přítomnost vnitřních jader (normálně do 3 %, u myogenních lézí více než 5 %, u MD a centronukleární myopatie dosahuje frekvence až 65–100 %). Dále je to přítomnost atrofických vláken (v normě jen ojedinělá, jako dolní konec Gaussovy křivky), přítomnost prstenčitých vláken a sarkoplazmatických mas (v normě nepřítomna), velikostně-typová dysproporce s nižšími hodnotami průměrů vláken 1, a endo-perimyziální fibróza (v normě se též nevyskytují). Na základě těchto parametrů byla míra pravděpodobnosti dg. MD odstupňována takto: typický nález (v tabulce MD typ) obsahuje nad 65 % vnitřních jader, atrofie, případně ještě další znaky; nález kompatibilní s dg. MD (v tabulce MD?) znamená nález mírně zvýšeného počtu (nad 5 %) vnitřních jader a přítomnost atrofií.

In situ hybridizace vycházela z citovaných prací [8,9], upravená podle Thorntona (osobní sdělení). Řezy (6mm) byly napjaty na skla (SuperFrost Plus slides Menzel-Glaser), vysušeny při pokojové teplotě 30 minut, fixovány v modifikované Carnoyově tekutině (73% etanol; 25% kyselina octová; 2% formalin) 30 minut při 4 °C a promyty v PBS. Následovala inkubace v prehybridizačním pufru (30% formamid a 2x SSC) a hybridizace s probou (1 ng/ml) 2 hodiny při 37 °C v hybridizačním pufru (30% formamid, 2x SSC, 0,02% BSA, 66 mg/ml yeast tRNA, 2 mM vanadyl komplex). Sekvence próby pro MD1: (5’-CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG-3’2’ –O-Me-RNA5’Fl), sekvence próby pro MD2 (5’-CAG GCA GGC AGG CAG GCA GG-3’2’ –O-Me-RNA5’Fl, ). Po hybridizaci byly řezy oprány ve 30% formamidu a 2x SSC po 30 minut při 45 °C, a 40 min při pokojové teplotě. Nakonec zamontovány ve směsi s DAPI (Vectashield Mountaing Medium with DAPI, Vector Laboratories, USA) a hodnoceny ve fluorescenčním mikroskopu Leica DMRXA2.

Hodnocení výsledků RNA-FISH: jediným parametrem je přítomnost tečkovitých signálů retinované RNA v subsarkolematických i vnitřních jádrech svalových vláken. V pozitivních jádrech jsou většinou přítomny 1-4 jednotlivé signály. Z technických důvodů (tloušťka řezu) nemusejí být v každém nákroji jádra přítomné RNA signály zastiženy, proto hodnotíme biopsie jako MD-pozitivní, je-li přítomno aslepoň 30 % pozitivních jader. Dalším problémem je možná nespecifická pozitivita, vysvětlitelná interferencí autofluoreskujícího lipopigmentu, který emituje široké spektrum vlnových délek [9]. Tato autofluorescence je někdy obtížně odlišitelná od specifické fluorescence užitého fluorochromu.

Pro hodnocení validity klinických i histopatologických nálezů a FISH byly výsledky molekulárně genetického vyšetření pacientů brány jako kritérium správné diagnózy.

Výsledky

Histopatologické parametry

Jednotlivé parametry a výsledky histopatologického nálezu, RNA-FISH, DNA analýzy na základě klinické indikace biopsie jsou shrnuty v tab. 1. Z tabelárních údajů vyplývá, že vysoká či zvýšená frekvence vnitřních jader (obr. 1) byla v naší sestavě zjištěna s jedinou výjimkou ve všech pozitivních biopsiích obou skupin pacientů. Přítomnost atrofií (obr. 1) byla zjištěna ve všech biopsiích obou skupin. Atrofie vláken 1 převažovala v biopsiích pacientů s MD1, zatímco u MD2 nebyla zjištěna ani v jediném případě. U MD2 byla přítomna jen atrofie typu 2 nebo obou typů vláken. Velikostně typová dysproporce základních typů s vyššími hodnotami vláken 1 (obr. 2) byla nalezena u 30-60 % případů MD1, MD2 i MD nerozlišené. Prstenčitá vlákna a sarkoplazmatické masy (obr. 3 a 4) byly v našich pozitivních biopsiích zjištěny celkem v 18 % všech pacientů obou skupin, ve 20 % u pacientů s MD1 a 30 % u pacientů s MD2. Fibróza byla zjištěna asi v polovině vyšetřených případů, 2krát dokonce i zánětlivá infitrace (jednou s pozitivní reakcí MAC v cévní stěně a HLA1 v sarkolemě).

V několika případech byly histopatologické nálezy netypické. U pacienta 12 byla DNA analýzou prokázána MD 1 a bioptická diagnóza zněla kongenitální typová disproporce svalových vláken (CFTD). U pacienta 19 byla zjištěna tak pokročilá léze, že histopatologická diagnóza nebyla možná, zatím co DNA analýza prokázala repetici CTG svědčící pro MD 1. Pacient 24 s prokázanou SMA měl v biopsii obraz neodlišitelný od MD. U pacientů 21 a 22 byla přítomna již zmíněná zánětlivá infiltrace, u MD velmi vzácná.

RNA fluorescenční in situ hybridizace

V pozitivních jádrech byly většinou přítomny 1-4 jednotlivé signály (obr. 5 a 6 pro DM1 a DM2). Pozitivní signály byly zjištěny i v některých jádrech intramuskulárních cév. V těchto jádrech však byly většinou jen 1-2 signály. Kromě toho, několik pozitivních signálů bylo nalezeno i v jádrech cévních endotelií (nedemonstrováno). Biopsie, v nichž bylo nalezeno více než 30 % pozitivních jader svalových vláken, byly hodnoceny jako pozitivní pro zkoumaný typ MD. Ve většině případů, kdy byla provedena FISH (34 ze 36), odpovídaly její výsledky nálezům DNA analýzy z periferní krve. V jádrech u pacientů 13 a 30, kde diagnóza MD2 nebyla mutační analýzou DNA potvrzena, byly pozitivní signály přítomny. Nespecifické pozitivní signály snad mohou být způsobeny interferencí autofluoreskujícího lipopigmentu, která při hodnocení výsledků FISH často působí komplikace [9]. Lipofuscin excituje a emituje široké spektrum vlnových délek, takže generuje signál prakticky v každém z užívaných kanálů, zatímco specifický signál fluoresceinu – FITC (495/520) resp Texaské červeně (596/620) je vidět pouze s filtrem odpovídajících vlnových délek. Při nejasnostech v topografii vysílaného signálu pomůže vyšetření laserovým konfokálním mikroskopem.

Diskuse a závěry

Klinická indikace biopsie zahrnuje samozřejmě jen část případů MD diagnostikovaných v našem regionu, protože u většiny pacientů byla a je diagnostikována na základě klinického a elektrofyziologického nálezu doplněného DNA analýzou [20].

Porovnáme-li jednotlivé parametry histopatologického vyšetření vedoucího k diagnóze MD (tab. 1), zjišťujeme, že nejčastějším a patrně nejspecifičtějším histopatologickým parametrem je zvýšená frekvence vnitřních jader [18,21,22]. Přítomnost atrofií, ať ve formě jaderných shluků (nuclear clumps) s minimem sarkoplazmy nebo jako malá angulární vlákna, je dalším znakem přítomným prakticky ve všech našich pozitivních biopsiích. U MD1 je udávána atrofie vláken 1 [17,18], avšak u MD2 nacházejí Schoser et al [23] a Vihola et al [24] převážně atrofii typu 2. Naproti tomu autoři Day et al [25] popisují u MD2 atrofii vláken bez udání typů. Tento parametr však má cenu jen ve spojení s dalšími, protože atrofie vláken typu 2 je znakem inaktivity, vyskytujícím se u celého spektra neuro- i myopatií včetně myozitid a dalších onemocnění pohybového aparátu. Atrofie svalových vláken je však i základním znakem neurogenních (i některých dalších myogenních) lézí, takže její specificita je tím pro histopatologickou diagnostiku MD limitovaná. Nicméně, naše výsledky podporují údaje citovaných autorů o převaze atrofie vláken typu 1 u MD1 a atrofie vláken typu 2 u MD2.

Velikostně-typová dysproporce základních typů vláken [26] je však odlišným znakem, který nemusí nutně znamenat atrofii některého typu, pouze vyšší průměrné hodnoty velikosti (průměrů) vláken typu 2 než má typ 1. Prstenčitá vlákna [27] jsou dosti specifickým nálezem u MD, ale jejich frekvence v našich pozitivních biopsiích je nevysoká, stejně jako v publikovaných větších sestavách [17]. Oba jmenované parametry jsou přítomny jen v části biopsií s průkazem obou typů MD.

Naše nálezy ukazují, že histopatologický obraz u MD1 i 2 je poměrně charakteristický a před érou molekulárně-genetické diagnostiky podpořil diagnózu myotonické dystrofie.V několika případech histopatologické vyšetření nevedlo ke správnému diagnostickému závěru: u 2 pacientů s DNA analýzou potvrzenou diagnózou DM skýtal bioptický nález obraz myozitidy, u dalšího pacienta bioptická diagnóza zněla kongenitální typová disproporce svalových vláken (CFTD). Nález zánětlivé infiltrace je u DM vskutku ojedinělý, její přítomnost u svalových dystrofií jako DMD, či FSHMD, nebo i u neurogenních atrofií však byla popsána opakovaně [21]. Velikostní typová dysproporce je ovšem znak nespecifický a bývá přítomen nejen u CFTD, ale i u myotonické dystrofie, u dalších kongenitálních myopatií (nemaline myopathy), ale i u spinální svalové atrofie. V naší sestavě byl tento případ ojedinělým bioptickým nálezem MD bez přítomnosti vnitřních jader.

V éře molekulárně-genetické diagnostiky MD1 a MD2 však diagnostika myotonické dystrofie pomocí histopatologických změn pozbývá významu a metodou volby při typickém klinickém a elektrofyziologickém nálezu (který se u obou geneticky definovaných chorob poněkud liší [20] je jednoznačně DNA diagnostika z periferní krve. Pozitivita FISH nálezů však těsně koreluje s nálezy DNA analýzy. Znalost histopatologického obrazu charakteristického pro MD však může být přínosná v případě, že svalová biopsie byla provedena z výše uvedených důvodů: histologický nález známek typických pro MD může vést k dodatečnému vyšetření DNA z lymfocytů periferní krve, nebo i ze zbytku bioptického materiálu. DNA analýza z lymfocytů je samozřejmě jednodušší, protože obsahuje daleko víc jaderné DNA na hmotnostní či objemovou jednotku než sval. A konečně, na zbytku biopsie lze pomocí FISH odhalit i přítomnost intranukeárních fokusů s expandovanou RNA (viz výše).

Metoda FISH v biopsii je zajímavá z teoretického pohledu, neboť umožňuje zkoumat retinovanou RNA v jádrech jednotlivých buněk a tkání u postižených pacientů, a tím i mechanizmus rozvoje klinické manifestace. Je nutné dořešit i metodické aspekty jako prezervace či fixace tkání, upřesnit vyhodnocení pozitivních nálezů a vztah k výsledkům DNA analýzy. Nejsou dosud známy rozdíly v expanzi DNA v jednotlivých tkáních a orgánech postižených pacientů; zřejmě však takové variace existují [28]. Také zmapování RNA inkluzí v tkáních pacientů s MD a jejich případný vztah k velikosti expanze nejsou v současné době dostatečně prozkoumány.

Přijetí k recenzi: 25. 1. 2007

Přijetí do tisku: 8. 2. 2007

prof. MUDr. Zdeněk Lukáš, CSc.

Ústav patologie FN Brno,

Jihlavská 20, 625 00 Brno

e-mail: zlukas @fnbrno.cz