Sekvenování mikroRNA v mozkových metastázách jako nový diagnostický nástroj

Download PDF English version

Authors: M. Večeřa ¹; L. Radová ¹; F. Siegl ¹; M. Smrčka ²; R. Jančálek ³; M. Hermanová ⁴; M. Hendrych ⁴; L. Křen ⁵; J. Šána ^1,6; O. Slabý ^1,7
Authors‘ workplace: CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno ¹; Neurochirurgická klinika LF MU a FN Brno ²; Neurochirurgická klinika LF MU a FN U sv. Anny v Brně ³; I. ústav patologie, LF MU a FN u sv. Anny v Brně ⁴; Ústav patologie, LF MU a FN Brno ⁵; Klinika komplexní onkologické péče LF MU a MOÚ, Brno ⁶; Biologický ústav, LF MU, Brno ⁷
Published in: Klin Onkol 2022; 35(Supplementum 1): 145-147
Category: Article

Overview

Východiska: Mozkové metastázy (BM) jsou nejčastějšími intrakraniálními nádory u dospělých onkologických pacientů. Zatímco dříve byly BM léčeny pouze symptomaticky, přístup k terapii se mění v důsledku zvyšující se incidence, vyplývající z efektivnější léčby primárních nádorů a časnějšího záchytu malých asymptomatických BM. Protože prognóza pacientů s BM je vysoce variabilní, bylo by užitečné zlepšit diagnostické a prognostické nástroje začleněním nových výkonných biomarkerů. MikroRNA (miRNA) jsou v tomto ohledu slibné a díky své vysoké stabilitě vhodné jak pro sekvenování (RNA-Seq), tak pro retrospektivní analýzy v tkáních fixovaných formalinem a zalitých v parafinu (formalin-fixed and paraffin embedded – FFPE). Materiál a metody: Celková RNA obohacená o miRNA byla izolována ze 71 čerstvě zmrazených histopatologicky potvrzených tkání BM s původem v pěti typech nádorů (karcinom plic, 37 %; melanom, 23 %; karcinom prsu, 18 %; renální karcinom, 15 %; kolorektální karcinom, 7 %). Před léčbou byl od každého pacienta získán informovaný souhlas schválený místní etickou komisí. Z RNA byly připraveny knihovny pro sekvenování na platformě NextSeq 500 (Illumina). Mapování čtení na referenci bylo provedeno pomocí nástroje miraligner a databáze miRBase a diferenciální analýza pro 2 437 maturovaných miRNA pomocí nástroje limma. Molekuly miRNA ze vzorků celkové RNA izolovaných z retrospektivního souboru 119 FFPE tkání byly reverzně transkribovány a exprese vybraných diferenciálně exprimovaných miRNA (miR-122-5p, miR-141-3p, miR-146a-5p, miR-194-5p, miR-200c-3p, miR-211-3p, miR-215-5p, miR-514b-3p, miR-934, miR-1270) byla validována pomocí qPCR. Výsledky: Diferenciální analýzou bylo identifikováno 373 miRNA s významně odlišnou expresí mezi pěti skupinami BM (p < 0,001). Následnou validací byla ověřena významně odlišná exprese vybraných miRNA v pěti skupinách BM. Závěr: Prezentované výsledky potvrzují důležitost studia dysregulované exprese miRNA v BM a diagnostický potenciál validovaných miRNA.

Klíčová slova:

mikroRNA – nádory mozku – sekvenování nové generace – biomarkery – metastázy nádorů

Úvod

Metastatická stadia nádorových onemocnění patří mezi nejnáročnější výzvy moderní medicíny. Mozkové metastázy (BM) jsou nejčastějšími intrakraniálními nádory u dospělých onkologických pacientů, přičemž vzdálené metastázy v mozku tvoří odhadem 9–17 % nádorů [1,2]. Zatímco dříve byly BM léčeny pouze symptomaticky, přístup k terapii těchto nádorů se v současnosti mění v důsledku zvyšující se incidence. Ta je zapříčiněna jednak větší dostupností citlivějších metod zachycujících malé asymptomatické BM a jednak efektivnější léčbou primárních nádorů, která sice prodlužuje přežití pacientů, ale zároveň zvyšuje riziko rozvoje metastatického onemocnění. Navzdory implementaci nových metod vedoucích ke zlepšení diagnostiky a léčby pacientů a vývoje nových terapeutik jsou BM nadále fatální událostí v progresi nádorů s přežitím pacienta obvykle < 10 měsíců od stanovení diagnózy BM [3–5].

Nejčastěji do mozku metastazují plicní karcinomy (16,3–36 %), prsní karcinomy (5–30 %), melanomy (6–11 %), renální karcinomy (2–16 %) a kolorektální karcinomy (1–4 %) [6–8]. U této geneticky heterogenní skupiny nádorů se prognóza pacientů velmi liší a bylo by užitečné vylepšit v současnosti používané diagnostické a prognostické nástroje [9] začleněním nových výkonných biomarkerů, které by umožnily časné stanovení diagnózy a identifikaci pacientů s nejhorší prognózou. V tomto ohledu se jako slibná jeví skupina krátkých nekódujících RNA zvaných mikroRNA (miRNA). Jejich velikou výhodou je vysoká stabilita v různých biologických materiálech vč. čerstvé tkáně a formalinem fixované tkáně z parafinových bloků (FFPE). Tyto molekuly jsou tudíž vhodné jak pro sekvenování (RNA-Seq), tak pro analýzy s využitím archivních FFPE tkání [10,11].

Z malého počtu publikovaných studií orientovaných na analýzu exprese miRNA v BM lze zmínit studii od Daugaard et al, kteří v rámci své práce identifikovali devět miRNA s dysregulovanou expresí v tkáních metastazujícího plicního adenokarcinomu (metastatic lung adenocarcinoma – MLA) v porovnání s nemetastazujícím plicním adenokarcinomem (non-metastatic lung adenocarcinoma – NMLA). Podobné trendy pozorovali mezi párovými vzorky MLA a BM odvozených od těchto nádorů. Expresi vybraných miRNA pak analyzovali pomocí kvantitativní PCR (qPCR) v rozšířených kohortách NMLA, MLA, BM odvozených od MLA a vzorků zdravé plicní tkáně a pozorovali signifikantně zvýšenou expresi miR-210-3p ve vzorcích plicního adenokarcinomu v porovnání se zdravou tkání i ve vzorcích MLA v porovnání s NMLA, která vysoce korelovala s výskytem distálních metastáz [12]. An et al pomocí sekvenování identifikovali 115 miRNA s dysregulovanou expresí v metastatické buněčné linii 231-BR v porovnání s mateřskou linií MDA-MB-231 s původem v triple-negativním karcinomu prsu. Pomocí qPCR pak potvrdili dysregulovanou expresi vybraných miRNA [13]. Hanniford et al se zaměřili na prognostický potenciál miRNA u pacientů s kožním melanomem tvořícím BM. Expresi miRNA analyzovali v tréninkové kohortě s využitím miRNA mikročipů a pomocí Coxova modelu proporcionálních rizik zahrnujícího klinické stadium nádorů a expresi miRNA identifikovali čtyři miRNA asociované s délkou doby přežití bez BM. Autoři pak pro pacienty definovali rizikové skóre, které úspěšně validovali pomocí mikročipové analýzy ve validační kohortě a pomocí qPCR v další nezávislé kohortě [14].

Materiál a metody

V naší práci jsme se zaměřili na analýzu miRNA v 71 vzorcích čerstvé histopatologicky potvrzené tkáně BM odvozených od karcinomu plic (BML, 37 %), melanomu (BMM, 23 %), karcinomu prsu (BMB, 18 %), renálního karcinomu (BMR, 15 %) a kolorektálního karcinomu (BMC, 7 %). Informovaný souhlas schválený etickou komisí byl obdržen od pacientů před započetím léčby. Celková RNA obohacená o krátké RNA byla izolována ze vzorků tkáně. Molekulární knihovny pro RNA-Seq byly připraveny ze vzorků RNA a sekvenovány na platformě NextSeq 500 (Illumina). Mapování čtení na referenci bylo provedeno pomocí nástroje miraligner a databáze miRBase. Diferenciální analýza byla provedena pro 2 437 maturovaných miRNA pomocí nástroje limma. Validace výsledků RNA-Seq byla provedena pomocí qPCR na nezávislém souboru, který zahrnoval 119 vzorků FFPE tkáně (BML, 23 %; BMM, 24 %; BMB, 18 %; BMR, 20 %; BMC, 15 %). Výsledky PCR byly normalizovány a poté analyzovány pomocí Mann-Whitneyho U testu.

Výsledky

Z výše uvedeného počtu hodnocených molekul bylo statistickou analýzou identifikováno 373 miRNA s významně odlišnou expresí mezi pěti skupinami BM (p < 0,001). Deset signifikantně diferenciálně exprimovaných miRNA (miR-122-5p, miR-141-3p, miR-146a-5p, miR-194-5p, miR-200c-3p, miR-211-3p, miR-215-5p, miR-514b-3p, miR-934, miR-1270) bylo vybráno pro následnou validaci výsledků RNA-Seq v nezávislém retrospektivním souboru. Signifikantní diferenciální expresi vybraných miRNA v pěti typech BM jsme částečně nebo úplně potvrdili u 9 z 10 miRNA. Konkrétně hsa-miR-141-3p a hsa-miR-200c-3p byly vysoce exprimovány v BML (p < 0,0001), BMB (p < 0,0001) a BMC (p < 0,001) v porovnání s BMR a BMM. Hsa-miR-122-5p a hsa-miR-1270 byly vysoce exprimovány v BMR v porovnání s ostatními BM. Zatímco hsa-miR-194-5p byla vysoce exprimována v BMC v porovnání se všemi ostatními skupinami (p < 0,0001), u hsa-miR-215-5p byla signifikantně vysoká exprese v BMC pozorována jen v porovnání s BMB (p < 0,0001) a BMM (p < 0,0001). Statisticky významně zvýšená exprese hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-211-3p a hsa-miR-514b-3p byla pozorována v BMM. V případě miR-934 byl pozorován signifikantní rozdíl mezi BMM a BML (p < 0,01), zatímco u miR-552-3p nebyl pozorován žádný rozdíl mezi porovnávanými BM.

Diskuze a závěr

Po statistickém zpracování sekvenačních dat a validaci pomocí qPCR potvrdily uvedené výsledky statisticky významnou dysregulaci exprese miRNA v BM. Tyto RNA mají značný potenciál stát se vhodnými diagnostickými biomarkery a do budoucna bude taky přínosné korelovat jejich expresi s klinicko-patologickými daty pro ověření jejich prognostického potenciálu.

Mgr. Marek Večeřa
CEITEC – Středoevropský
technologický institut
Kamenice 753/5
625 00 Brno
e-mail: marek.vecera@ceitec.muni.cz
Obdrženo/Submitted: 15. 7. 2022
Přijato/Accepted: 15. 8. 2022

Sources

1. Nayak L, Lee EQ, Wen PY. Epidemiology of brain metastases. Curr Oncol Rep 2012; 14(1): 48–54. doi: 10.1007/ s11912-011-0203-y.

2. Sacks P, Rahman M. Epidemiology of brain metastases. Neurosurg Clin N Am 2020; 31(4): 481–488. doi: 10.1016/ j.nec.2020.06.001.

3. Niemiec M, Głogowski M, Tyc-Szczepaniak D et al. Characteristics of long-term survivors of brain metastases from lung cancer. Rep Pract Oncol Radiother 2011; 16(2): 49–53. doi: 10.1016/ j.rpor.2011.01.002.

4. Sperduto PW, Kased N, Roberge D et al. Summary report on the graded prognostic assessment: an accurate and facile diagnosis-specific tool to estimate survival for patients with brain metastases. J Clin Oncol 2012; 30(4): 419–425. doi: 10.1200/ JCO.2011.38.0527.

5. Wu K, Sharma S, Venkat S et al. Non-coding RNAs in cancer brain metastasis. Front Biosci (Schol Ed) 2016; 8(1): 187–202. doi: 10.2741/ s457.

6. Barnholtz-Sloan JS, Sloan AE, Davis FG et al. Incidence proportions of brain metastases in patients diagnosed (1973 to 2001) in the Metropolitan Detroit Cancer Surveillance System. J Clin Oncol 2004; 22(14): 2865–2872. doi: 10.1200/ JCO.2004.12.149.

7. Ostrom QT, Wright CH, Barnholtz-Sloan JS. Brain metastases: epidemiology. Handb Clin Neurol 2018; 149: 27–42. doi: 10.1016/ B978-0-12-811161-1.00002-5.

8. Schouten LJ, Rutten J, Huveneers HA et al. Incidence of brain metastases in a cohort of patients with carcinoma of the breast, colon, kidney, and lung and melanoma. Cancer 2002; 94(10): 2698–2705. doi: 10.1002/ cncr.10541.

9. Kazda T, Kuklova A, Pospisil P et al. Utilization of prognostic indexes for patients with brain metastases in daily radiotherapy routine – is the complexity and intricacy still an issue? Klin Onkol 2015; 28(5): 352–358. doi: 10.14735/ amko2015352.

10. Kakimoto Y, Tanaka M, Kamiguchi H et al. MicroRNA stability in FFPE tissue samples: dependence on GC content. PLoS One 2016; 11(9): e0163125. doi: 10.1371/ journal.pone.0163125.

11. Peiró-Chova L, Peña-Chilet M, López-Guerrero JA et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows Arch 2013; 463(6): 765–774. doi: 10.1007/ s00428-013-1485-2.

12. Daugaard I, Venø MT, Yan Y et al. Small RNA sequencing reveals metastasis-related microRNAs in lung adenocarcinoma. Oncotarget 2017; 8(16): 27047–27061. doi: 10.18632/ oncotarget.15968.

13. An M, Zang X, Wang J et al. Comprehensive analysis of differentially expressed long noncoding RNAs, miRNAs and mRNAs in breast cancer brain metastasis. Epigenomics 2021; 13(14): 1113–1128. doi: 10.2217/ epi-2021-0152.

14. Hanniford D, Zhong J, Koetz L et al. A miRNA-based signature detected in primary melanoma tissue predicts development of brain metastasis. Clin Cancer Res 2015; 21(21): 4903–4912. doi: 10.1158/ 1078-0432.CCR-14-2566.