Detekce EGFR mutací v cirkulující nádorové DNA (ctDNA) v plazmě – mezilaboratorní porovnání referenčních laboratoří v České republice

Overview

Úvod:

Mutační analýza genu pro receptor epidermálního růstového faktoru (epidermal growth factor receptor – EGFR) z nádorové tkáně je v současnosti standardním testem u pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic. Molekulární testování cirkulující nádorové DNA (circulating tumor DNA – ctDNA) z plazmy se ukazuje být spolehlivou alternativou detekce mutací v případech, kdy není možné získat bioptický či cytologický vzorek z nádoru či je třeba monitorovat léčebnou odpověď pomocí opakovaných vyšetření. Navíc dle recentních prací ctDNA lépe odráží heterogenitu nádorového procesu než odběr z izolované nádorové léze či metastázy. Za účelem zhodnocení analytické kvality testování mutací v genu EGFR z ctDNA izolované z plazmy bylo zorganizováno mezilaboratorní porovnání v rámci referenčních laboratoří prediktivní diagnostiky v České republice.

Materiál a metody:

Celkem 7 laboratořím bylo zasláno 13 komerčně dostupných referenčních vzorků 2 ml plazmy obsahující nejčastější senzitivní mutace genu EGFR (delece v exonu 19, L858R) a rezistentní mutaci T790M s frekvencí mutací 5; 0,5 a 0,05 %. Jeden vyšetřovaný vzorek obsahoval nemutovanou DNA. Vzorky byly analyzovány metodami standardně využívanými v diagnostické praxi. V 6 ze 7 laboratoří byl použit cobas® EGFR Mutation Test v2, v 1 laboratoři Super-ARMS® EGFR Mutation Detection Kit.

Výsledky:

Určeno bylo 91 genotypů s celkovou chybovostí 24,2 % (22/91). Na 0,5% a vyšší úrovni mutační frekvence činila celková chybovost 3,2 % (2/63), na 5% úrovni 0 % (0/35). Nebyly detekovány žádné falešně pozitivní výsledky. Platforma cobas® dosáhla konzistentně úspěšné detekce na hladině 0,05 % pro deleci v exonu 19. Pro mutace L858R a T790M byl práh detekce nad hodnotou 0,5 %.

Závěr:

Naše výsledky poukazují na limitovanou citlivost vyšetření mutací EGFR z plazmy, a to zejména mutace T790M. Obzvláště pro vyšetřování ctDNA z plazmy, jejíž frakce může být velice nízká (až 0,01 %), je nutné klást důraz na používání vysoce senzitivních molekulárních metod. Výsledky tohoto porovnání kvality potvrzují nutnost pokusu o rebiopsii u pacientů s negativním výsledkem, neboť oproti vyšetření solidního vzorku tkáně stoupá podíl falešně negativních případů.

Klíčová slova

cirkulující DNA – tekutá biopsie – receptor epidermálního růstového faktoru – nemalobuněčný karcinom plic – externí posouzení kvality

Úvod

Karcinom plic (lung cancer – LC) zůstává globálně hlavní příčinou mortality na nádorová onemocnění. Většina pacientů je stále diagnostikována v pokročilém stadiu s nepříznivou prognózou [1]. Objevení řídících mutací v genu kódujícím receptor epidermálního růstového faktoru (epidermal growth factor receptor – EGFR) jako primární onkogenní změny u části adenokarcinomů plic vedlo k vývoji specifických tyrozinkinázových inhibitorů (TKI) tohoto receptoru [2]. Mutace genu EGFR se vyskytují zejména v jeho intracelulární doméně, v exonu 18–21. Celosvětově jsou přítomny u 10–30 % pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic (non-small cell lung cancer – NSCLC) [3,4], v europoidní (kavkazské) populaci jsou identifikovány přibližně u 10 % nemocných [5]. Delece v exonu 19 (del 19) a bodové mutace L858R (c.2573T>G, c.2573_2574TG>GT; p.Leu858Arg) v exonu 21 genu EGFR představují 85–90 % všech popsaných mutací genu EGFR a souvisejí se zvýšenou senzitivitou pacientů k léčbě EGFR-TKI [2]. Oproti tomu bodová substituce c.2369C>T, vedoucí k záměně aminokyseliny threonin za methionin v kodonu 790 (p.Thr790Met, T790M), a inzerce v exonu 20 jsou asociovány s rezistencí na EGFR-TKI [6,7]. U pacientů s pokročilým NSCLC a prokázanou senzitivní mutací EGFR, kteří byli léčeni EGFR-TKI (gefitinibem, erlotinibem či afatinibem) zaznamenalo několik velkých klinických studií signifikantní prodloužení intervalu do progrese onemocnění. Došlo též k prodloužení celkové délky přežití (na více než 24 měsíců) a zlepšení kvality života ve srovnání s pacienty léčenými konvenční chemoterapií [8–12]. Pacienti s pokročilým NSCLC neskvamózní histologie by proto měli být vyšetřeni na přítomnost mutací genu EGFR před zahájením léčby 1. linie. V průběhu 10–14 měsíců léčby EGFR-TKI se u naprosté většiny pacientů vyvine v důsledku nádorové heterogenity klonální evoluce a selekce rezistence vůči této terapii. Ta je až v 60 % případů způsobena bodovou mutací T790M v exonu 20 [3,13,14]. V nedávné době byly vyvinuty ireverzibilní TKI 3. generace (osimertinib, rociletinib) namířené též proti EGFR mutaci T790M a překonávající tuto rezistenci [15]. Randomizované studie prokázaly významný rozdíl v přežití pacientů s mutací T790M léčených osimertinibem oproti chemoterapii [16], a proto posílil význam opakování biopsie při progresi onemocnění za účelem detekce této genetické změny.

Primárním zdrojem materiálu pro molekulární analýzu u pacientů s pokročilým LC jsou tradičně vzorky tkáně získané bioptickým odběrem, příp. vzorky cytologické. Nicméně u velké části pacientů s metastatickým nádorovým onemocněním není možné tento materiál pro nepřístupnost léze získat vůbec či s ohledem na jejich klinický stav provádět vyšetření opakovaně a monitorovat tak dynamický vývoj mutačního stavu nádoru v průběhu terapie [17]. Rovněž v rámci vhodně navržených rozsáhlých klinických studií (IPASS, INTEREST, FLEX) bylo pouze u 20–40 % pacientů možné získat k molekulárnímu vyšetření dostatek materiálu ze solidní léze [8,10,18,19]. Dalším limitujícím faktorem odběru z jednoho ložiska (primárního či metastatického) je fakt, že nemusí odrážet biologickou heterogenitu nádoru a jeho metastáz [20,21].

Neinvazivním zdrojem materiálu pro detekci EGFR mutací se v současnosti ukazuje být tzv. tekutá biopsie, resp. jedna z jejích forem, stanovení volné nádorové DNA cirkulující v plazmě (circulating tumor DNA – ctDNA) [22,23]. Přestože mechanizmus uvolňování ctDNA do krve není přesně známý, zřejmě se jedná o proces úzce spjatý s apoptózou či nekrózou nádorových buněk a zčásti může jít i o aktivní sekreci [23–25]. Výhodou ctDNA je, že dle experimentálních výsledků obsahuje reprezentativní složky celého nádorového genomu [26]. Rovněž četné klinické studie prokázaly, že její detekce v periferní krvi u pacientů s LC ve vysokém procentu případů koreluje s nálezem mutace v nádorové tkáni, a tudíž může být použita k určení mutačního stavu EGFR a predikci účinnosti léčby EGFR-TKI [22,27–33]. Též aktualizované doporučené postupy profesních společností College of American Pathologists, International Association for the Study of Lung Cancer a Association for Molecular Pathology uvádějí vyšetření ctDNA ze vzorku plazmy jako alternativní test mutačního statusu v případě, že vzorek solidní tkáně není dostačující anebo není k dispozici [34]. Přes všechny výhody testování plazmy je nutno podotknout, že plazmatická DNA je vysoce fragmentovaná (nejčastěji o velikosti okolo 180 bp), což znesnadňuje účinnou amplifikaci cílové oblasti, a může být přítomna ve velmi nízké koncentraci. Frakce ctDNA z celkové volné DNA v plazmě (circulating free DNA – cfDNA) kolísá mezi 0,01 a 10 % [35,36]. Proto je v posledním desetiletí věnována velká pozornost vývoji vysoce citlivých, specifických a v neposlední řadě cenově dostupných molekulárních metod k detekci ctDNA [23,29,31,37–43].

Pro diagnostickou praxi byly regulačními orgány Evropské unie i Spojených států amerických (European Medicine Agency, U.S. Food and Drug Administration) v nedávné době schváleny první testy k provádění testování EGFR z plazmy u pacientů s LC jako prediktoru léčebné odpovědi na terapii gefitinibem v případech, kde není možné získat diagnostický vzorek tkáně [25]. Mezi tyto testy patří zejména cobas® EGFR Mutation Test v2 [44] založený na alelicky specifické polymerázové řetězové reakci (polymerase chain reaction – PCR) a Therascreen® EGFR RGQ Plasma PCR kit [45]. Navíc se ukázala metoda detekce ctDNA vhodná k monitorování vývoje rezistence na léčbu EGFR-TKI a relapsu onemocnění [29,46,47].

Vzhledem ke skutečnosti, že v Evropě nebylo do počátku roku 2018 širšímu počtu laboratoří dostupné externí hodnocení kvality testování mutačního stavu EGFR ctDNA v plazmě u pacientů s NCSLC, bylo zorganizováno mezilaboratorní porovnání na úrovni ČR. Cílem této studie bylo zhodnotit účinnost metod používaných v referenčních laboratořích prediktivní diagnostiky v ČR k detekci EGFR mutací v krevní  plazmě.

Materiál a metody

Vzorky

V rámci studie byly každou ze 7 zúčastněných referenčních laboratoří (tab. 1) vyšetřovány 2 totožné sady 13 standardů obsahujících 2 ml plazmy značené „EGFR cfDNA Ring Trial Pack 1 Plasma DNA“ a „EGFR cfDNA Ring Trial Pack 2 Plasma DNA“ (Horizon Discovery Group plc, Velká Británie). Testovány byly 4 sady různých mutací genu EGFR s frekvencí mutované alely 5; 0,5 a 0,05 % a jeden vzorek bez mutované DNA (wild type) (tab. 2). Vzorky plazmy byly až do zpracování uchovávány při –80 °C.

Extrakce DNA

K izolaci cfDNA z plazmy byl použit v 6 případech certifikovaný (in vitro diagnostics – CE IVD) izolační kit cobas® cfDNA Sample Preparation Kit (Roche Molecular Systems Inc., Švýcarsko), v jednom případě pak CE IVD kit QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Německo). Postupováno bylo dle instrukcí výrobce. Izolovaná cfDNA byla eluována do 100 ml DNA elučního pufru, z nichž bylo po finální centrifugaci k dalšímu použití odebráno 80 ml eluátu. Koncentrace DNA byla kvantifikována pomocí spektrofotometru NanoDrop®  ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, USA) či VivaSpec® (Sartorius Stedim Biotech, Německo) nebo semikvantitativně elektroforeticky. Extrahovaná cfDNA byla uchována při –20 °C, příp. byla analyzována bezprostředně po izolaci.

Mutační analýza pomocí PCR (COBAS®, Super-ARMS®)

Mutační stav genu EGFR v cfDNA izolované z plazmy byl stanoven pomocí PCR v reálném čase. V 6 laboratořích byl použit kit cobas® EGFR Mutation Test v2 (Roche Molecular Systems Inc., Švýcarsko) na přístroji cobas® 4800 (Roche Molecular Systems Inc., Švýcarsko). Tato sada detekuje mutace G719A/C/S v exonu 18, 29 různých delecí v exonu 19, mutace S768I, T790M a 5 odlišných inzercí v exonu 20 a mutace L858R a L861Q v exonu 21. Pro každou reakci bylo použito 25 ml neředěného eluátu cfDNA. V jedné z referenčních laboratoří byly vzorky vyšetřovány kitem Super-ARMS® EGFR Mutation Detection Kit (AmoyDx, ČLR) využívajícím ARMS-PCR (amplification refractory mutation system – ARMS) na přístroji Stratagene Mx3000P® (Agilent Technologies, USA). Vyšetřované mutace jsou obdobné jako u předchozího výrobce, navíc sada umožňuje detekci jedné další inzerce v exonu 20. Reakční směsi a jejich analýza byly provedeny podle instrukcí výrobců.

Výsledky

Výsledky genotypizace v jednotlivých referenčních laboratořích jsou shrnuty v tab. 3.

Mutace T790M v exonu 20 ve standardu obsahujícím tuto mutaci s frekvencí 0,05 % nebyla detekována ani jedním kitem a žádným z účastníků studie. Metodou cobas® byla ve vzorcích s frekvencí 0,5 a 5 % detekována všemi zúčastněnými laboratořemi, metodou Super-ARMS® pak pouze ve vzorku s mutační frekvencí 5 %. Mutace L858R v exonu 21 nebyla metodou cobas® detekována ve vzorku s frekvencí 0,05 % žádným účastníkem, naopak vzorky s frekvencí mutace 0,5 a 5 % byly správně identifikovány všemi zúčastněnými laboratořemi. Metodou Super-ARMS® byla anotovaná varianta L858R detekována ve všech vzorcích, tj. s frekvencí 0,05; 0,5 a 5 %. Delece v exonu 19 (c.2235_2249del15, ΔE746_A750) byla oběma metodami a všemi účastníky stanovena ve všech vzorcích s touto anotovanou genetickou změnou, tj. s mutační frekvencí 0,05; 0,5 a 5 %. Kombinaci mutací T790M a L858R detekovali všichni účastníci správně ve vzorku s 5% frekvencí obou mutací. Správně zaznamenalo obě varianty ve vzorku s 0,5% frekvencí obou mutací 6 ze 7 laboratoří, přičemž v 1 laboratoři byla detekována pouze varianta L858R. Ve vzorku s frekvencí 0,05 % nebyly varianty detekovány na 4 pracovištích. Ve 2 laboratořích byla detekována pouze varianta L858R, žádný z účastníků nezachytil v tomto vzorku anotovanou variantu T790M. Vzorky s nemutovanou (wild type) DNA byly shodně všemi zúčastněnými hodnoceny jako negativní. Žádné falešně pozitivní výsledky nebyly zaznamenány.

Průměrná chybovost byla vypočítána jako součet všech falešně pozitivních a falešně negativních výsledků dělený počtem všech vyšetření. Celkově bylo stanoveno 91 genotypů s průměrnou chybovostí 24,2 % (22/91). Průměrná chybovost činila v případě vyšetření senzitivních mutací 14,3 % (6/42), pro mutaci T790M 38,1 % (16/42) a pro wild type DNA 0 % (0/7). Vezmeme-li v úvahu pouze výsledky s frekvencí mutací 0,5 % a vyšší a vyšetření wild type DNA, činila celková chybovost 3,2 % (2/63). Pro výstupy na úrovni 5% frekvence mutací a wild type DNA dosáhla chybovost 0 % (0/35). Ve všech případech se jednalo o falešně negativní výsledky.

Při porovnání obou použitých metod byla chybovost obdobná (24,4 % (19/78) u testu cobas®, resp. 23,1 % (3/13) u metody Super-ARMS®).

Diskuze

S rozvojem terapeutických možností v oblasti péče o pacienty s pokročilým NSCLC je kladen důraz na precizní molekulární diagnostiku potenciálních léčebných cílů u co největšího procenta nemocných. Jedná se zejména o primární detekci mutací genu EGFR a možnost monitorování léčby EGFR-TKI s případným vznikem rezistence. Rezistentní mutace T790M v exonu 20 genu EGFR se vyskytuje až u 60 % pacientů jako sekundární rezistence v důsledku léčby EGFR-TKI. Její detekce představuje novou výzvu, neboť hraje klíčovou roli v indikaci EGFR-TKI 3. generace (osimertinibu) [14,48]. Molekulární vyšetření z opakované biopsie v době progrese onemocnění tak ovlivňuje další terapeutická rozhodnutí. Vzhledem k jednoduchosti a nízkému riziku odběru periferní krve pro následnou separaci plazmy v porovnání s invazivním bioptickým či cytologickým odběrem a u pacientů, kde není možné získat materiál z primárního nádoru, se detekce EGFR mutací z ctDNA izolované z plazmy (tzv. tekutá biopsie) stává metodou první volby. Zatímco malý bioptický vzorek nemusí být reprezentativní pro celkovou nádorovou masu [49], vzorek tekuté biopsie je rychle dostupný, postihuje intra-a intertumorální heterogenitu, a může  tak představovat výhodné řešení pro monitorování molekulárních změn v nádoru, léčebné odpovědi či sekundárně vzniklé rezistence na cílenou  terapii [35].

Prediktivní vyšetření ctDNA nicméně skýtá i řadu nevýhod. Frakce ctDNA kolísá mezi 0,01 až více než 10 % cfDNA v závislosti na typu nádoru, stadiu nádorového onemocnění, celkovém množství nádorových buněk a jejich schopnosti invadovat do cévního řečiště [35,36]. K obtížné detekci navíc přispívá vysoká fragmentace ctDNA. K vyšetření EGFR ctDNA z plazmy byla v posledních několika letech vyvinuta celá řada metod založených primárně na PCR [37]. Pouze u části z nich jsou však k dispozici spolehlivá data z prospektivních validačních studií s porovnáním výsledků s referenční nádorovou tkání. Aby mohlo dojít k rozšíření detekčních platforem do praxe, musejí tyto být navíc komfortní, efektivní a současně ekonomicky únosné. Jedná se jak o přístupy digitální PCR (droplet digital PCR; beads, emulsions, amplification and magnetics – BEAMing dPCR; chip-based dPCR), tak platformy nedigitální (cobas®, therascreen®). Samozřejmě nelze opomenout možnosti sekvenování nové generace (new generation sequencing – NGS). Metody digitální PCR v kapičkách reakční směsi dosahují sice velmi nízkého limitu detekce (limit of detection – LoD), a to až 0,01 %, nicméně jsou poměrně finančně i časově náročné [38]. Senzitivita a specificita detekce ctDNA jednotlivých metod se při porovnávání vůči nádorové tkáni dle použité technologie do jisté míry liší, avšak konkordance výsledků je vysoká (okolo 90 %) [39,49]. Pro detekci delecí v exonu 19 a mutace L858R se u různých platforem pohybuje senzitivita mezi 67–93 % a specificita mezi 87–100 %. Detekce rezistentní mutace T790M má senzitivitu a specificitu o něco nižší (61–81, resp. 58–67 %) [29,31,36,40,41,43,50].

K zavedení vyšetřování ctDNA do klinické praxe je nutná spolehlivost a reprodukovatelnost výsledků molekulárního vyšetření, garantovaná úspěšnými výsledky externí a interní kontroly kvality. Evropští poskytovatelé kontrol kvality pod záštitou organizace International Quality Network for Pathology v roce 2016 provedli průzkum používaných metodik k testování ctDNA z plazmy u genů EGFR a RAS na 167 pracovištích v různých zemích [51]. Na jeho základě v létě 2017 zorganizovali za účasti 32 vybraných laboratoří z celého světa společné pilotní kolo externího posouzení kvality (external quality assessment – EQA) pro izolaci a analýzu EGFR ctDNA z plazmy [52]. V letošním roce je organizováno pilotní schéma EQA pro široký okruh zájemců [53]. Vzhledem k dosavadní nedostupnosti EQA vyšetřování EGFR ctDNA v plazmě bylo zorganizováno mezilaboratorní porovnání na úrovni ČR. V rámci naší studie jsme v 7 referenčních laboratořích ČR za použití komerčně dostupného standardizovaného materiálu (s 5; 0,5 a 0,05% frekvencí mutací) validovali metodiku testování mutačního stavu EGFR u pacientů s NSCLC.

Ke genotypizaci byly použity 2 různé metodiky, přičemž jejich celková chybovost byla obdobná (24,4 % (19/78) u metody cobas®, resp. 23,1 % (3/13) u metody Super-ARMS®). Platforma Super-ARMS® však byla zastoupena pouze jednou laboratoří a co se týče porovnání obou metodik, nelze z této práce vyvozovat bližší závěry. Obě metody použité ve studii jsou schopné poměrně spolehlivě správně detekovat mutaci s vyšší než 0,5% frekvencí jak senzitivních mutací (del 19, L858R), tak rezistentní mutace T790M. U vyšetření s frekvencí mutací 0,5 % a vyšší a vyšetření wild type DNA činila celková chybovost 3,2 %. Při posouzení vzorků s frekvencí mutací 5 % byly všechny výsledky správné (chybovost 0 %, 0/35). Nejnižší citlivost obou metod pro detekci varianty T790M se projevuje při typizaci vzorků s velmi nízkým podílem (0,05 %) mutované ctDNA (graf 1). Metoda cobas® dosáhla v nejnovějších publikovaných studiích pro detekci T790M v plazmě senzitivity 60–73 % a specificity 67–81 % při LoD 0,1 % [29,50]. V naší srovnávací studii bylo pro detekci T790M dosaženo LoD 0,5 % v 100 % (6/6) laboratoří používajících tuto metodu. Pro samotné senzitivní mutace dosáhlo 0,5% LoD 83,3 % (5/6) laboratoří, pro del 19 byl v 100 % (6/6) pracovišť LoD min. 0,05 %. Ukázalo se, že analytická senzitivita metodiky cobas® v rámci naší studie je konzistentní se senzitivitou udávanou výrobcem (0,75 % pro del 19 a 1 % pro mutace L858R a T790M) [54]. Pro kit Super-ARMS® EGFR Mutation Detection Kit je analytická senzitivita udaná výrobcem 0,2 % pro deleci E746_A750 v exonu 19, pro mutaci L858R a rovněž pro mutaci T790M. Této citlivosti nebylo ve studii dosaženo v jednom případě, a to pro mutaci T790M. Mutace L858R a del 19 byly zachyceny ve všech případech, tj. i ve vzorcích s frekvencí mutantní alely 0,05 %.

Poměrně vysoké procento chybovosti této studie oproti jiným běžně prováděným molekulárním testům je možné vysvětlit použitím metod s vyšším limitem detekce, než byla nejnižší vyšetřovaná alelická frekvence 0,05 %. Obzvláště pro vyšetřování ctDNA z plazmy s velice nízkou frakcí (až 0,01 %) je k získání spolehlivých výsledků testování nutné použití vysoce senzitivních molekulárních metod. Optimální senzitivita pro detekci ctDNA v současné době však není zřejmá. Pro použití v klinické praxi je rovněž třeba vyřešit standardizaci preanalytické fáze, zejména odběr vzorku periferní krve (vč. typu odběrové zkumavky) a jeho zpracování, především dodržení časových limitů mezi odběrem, oddělením plazmy a izolací nukleových kyselin, jejíž řešení však přesahuje rámec této publikace.

Z praktického hlediska z proběhlých studií i naší práce vyplývá, že standardně používané metodiky detekce EGFR ctDNA jsou schopné detekovat nejčastější senzitivní mutace (zejména del 19) s vysokou spolehlivostí, a být tak podkladem pro léčbu EGFR-TKI. V případě detekce sekundárně vzniklé rezistentní mutace T790M v ctDNA je výsledek možné brát jako východisko pro indikaci léčby TKI 3. generace. Obdobná léčebná odpověď u pacientů s touto mutací v plazmě jako v primárním nádoru byla prokázána v rámci několika klinických studií [29,50]. Díky tekuté biopsii by se tak s ohledem na frekvenci mutace T790M a na senzitivitu vyšetření ctDNA mohlo vyhnout bioptickému či cytologickému odběru více než 50 % pacientů s rezistencí na léčbu TKI [55]. Detekce ctDNA může být negativně ovlivněna nízkou nádorovou náloží, blokádou cytotoxickými léky či preanalytickými a analytickými faktory, především výběrem metody kvantifikace a analýzy ctDNA [56]. V případě negativního výsledku je proto všeobecně doporučována maximální snaha o získání materiálu z nádorového ložiska (schéma 1).

Závěr

Tekutá biopsie se stává realitou každodenní klinické praxe. Testování mutačního stavu EGFR z ctDNA z plazmy má potenciál získat si své trvalé místo v rutinní diagnostice a monitorování léčby pacientů s NSCLC, zejména vezmeme-li v potaz, že extrakci cfDNA a stanovení mutačního stavu je možné provést v průběhu jednoho pracovního dne. Díky vývoji nových vysoce senzitivních metod a jejich zavedení do praxe představuje detekce ctDNA z plazmy vhodnou metodu v případech nedostatečného množství tkáně k molekulárnímu testování nebo u pacientů, kde není možné bioptický odběr provést či vyšetření provádět opakovaně. Musíme si nicméně uvědomit, že tekutá biopsie není pro detekci EGFR statusu konkurenční metodou k odběru bioptickému či cytologickému, ale jeho cennou alternativou. Eseje užívané k typizaci EGFR ctDNA z plazmy prokázaly ve většině publikovaných studií relativně vysokou specificitu a pozitivní prediktivní hodnotu, avšak limitovanou senzitivitu, zejména pro mutaci T790M. Rovněž naše výsledky vzhledem k nižší citlivosti detekce rezistentní mutace T790M potvrzují nutnost pokusu o rebiopsii u pacientů s negativním výsledkem, neboť zde oproti vyšetření solidního vzorku tkáně stoupá podíl falešně negativních případů. Jedině národní či mezinárodní schémata kontroly kvality jsou schopná vést k posouzení, udržení, popřípadě zlepšení úrovně molekulárního vyšetřování EGFR z ctDNA z plazmy, aby se mohlo stát robustním opěrným bodem pro terapeutické rozhodování.

Poděkování

Děkujeme pracovníkům všech zúčastněných labora-toří a prof. MUDr. A. Ryškovi, Ph.D., za iniciaci této  studie.

Práce byla realizována za podpory firmy Astra- Zeneca a podpořena projektem (Ministerstva zdravotnictví) koncepčního rozvoje výzkumné organizace 00064203 (FN MOTOL).

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

MUDr. Linda Čapková, Ph.D.

Ústav patologie a molekulární medicíny 2. LF UK a FN

Motol V Úvalu 84 150 06 Praha 5

e-mail: linda.capkova@fnmotol.cz

Obdrženo: 4. 6. 2018

Přijato: 1. 8. 2018