Úloha CDK12 v iniciaci a rozvoji nádorů a její klinické konsekvence

Cyklin-dependentní kinázy (CDKs) se účastní celé řady buněčných procesů a zcela zásadní roli zastávají v regulaci buněčného dělení a transkripce. V nedávné době se podařilo identifikovat CDK12 jako důležitý faktor v regulaci transkripce genů BRCA1, ATM, ATR, FANCI a FANCD2 zapojených do odpovědi buňky na poškození DNA. Porucha funkce těchto genů vede ke vzniku genomové nestability, což je jeden z klíčových stavů v procesu kancerogeneze. Z uvedeného postavení CDK12 vyplývají i možné klinické konsekvence, které jsou postupně dokazovány. Jedná se především o zjištění, že v řadě nádorů (např. karcinomy vaječníků, prsu, prostaty, tlustého střeva) dochází v důsledku mutace k poškození funkce nebo snížení exprese CDK12, což může zvýšit citlivost nádoru k cytostatikům způsobujícím poškození DNA (např. platinové deriváty, alkylační látky) a k inhibitorům oprav DNA (např. PARP inhibitory). Tato skutečnost již byla potvrzena na modelu serózního ovariálního karcinomu. CDK12 se tak stává potenciálním terapeutickým cílem léčiv, jejichž úkolem je navodit v nádorových buňkách syntetickou letalitu. Náš přehledový článek přináší poslední informace o významu CDK12 v kancerogenezi a o potenciálních možnostech využití CDK12 pro klinickou praxi.

Klíčová slova:
cyklin-dependentní kináza 12 –  mutace –  opravy DNA –  PARP inhibitor –  platinová cytostatika

Úvod

Z pohledu dnešních znalostí již nepohlížíme na nádor jako na prostou masu nekontrolovaně se dělících buněk, ale spíše jej považujeme za unikátní druh tkáně, kde vzájemně interagují různorodé populace nádorových a normálních buněk, jež jsou od počátku součástí mikroprostředí nádoru a postupně utvářejí jeho stroma, a tyto interakce významně ovlivňují celý průběh kancerogeneze a v kauzálním důsledku i chování nádoru k jeho okolí [1– 3].

Maligní onemocnění představuje složitý komplex celé řady procesů uplatňujících se v průběhu kancerogenze, které ze své podstaty vycházejí z fyziologických buněčných dějů a nádor si je přizpůsobuje k vlastnímu prospěchu. Hanahan a Weinberg jich v roce 2000 popsali šest: soběstačnost v růstových faktorech, rezistence na inhibitory růstu, deregulace a inhibice apoptózy, neomezené buněčné dělení (buněčný cyklus), podpora a udržování angiogeneze a tkáňová invazivita a metastazování [4]. S přibývajícími znalostmi, po více než jednom desetiletí, ti samí autoři rozšířili výše zmíněné procesy o další děje, které jsou v nádorech specificky deregulovány: narušení metabolické rovnováhy v buňce, únik nádorových buněk před specifickou imunitní odpovědí, nádor iniciující zánětlivé procesy a v neposlední řadě mutace a genomová nestabilita [4].

Bylo by velmi odvážné tvrdit, že lze všechny tyto děje seřadit podle důležitosti nebo že jejich výčet je již konečný. Zásadní je, že byly poznány a mohou být využity v prevenci i léčbě nádorů. Náš přehledový článek se zaměřuje na představení nových poznatků, které se dotýkají dvou z těchto dějů, a to procesu neomezeného buněčného dělení a genové nestability, jež v určité fázi využívají stejný typ regulačních proteinů a těmi jsou cyklin-dependentní kinázy (cyclin-dependent kinases –  CDKs).

Buněčné dělení a cyklin-dependentní kinázy

Cyklin-dependentní kinázy (CDKs) obecně patří do skupiny proteinkináz, což jsou enzymy uskutečňující přenos fosfátové skupiny z donorové molekuly ATP na konkrétní substrát v procesu označovaném jako fosforylace. Aktivita a specificita CDK je závislá především na jejich přímé asociaci se specifickým vazebným partnerem –  cyklinem [5]. V současnosti je v literatuře experimentálně popsáno 21 odlišných CDK, které se podílejí na různých fyziologických procesech v buňce, z nichž dva nejvýznamnější jsou právě proces kontroly buněčného dělení a regulace transkripce. Do první skupiny CDK regulující buněčné dělení lze zahrnout CDK 1, 2, 4, 6 a 7, do druhé skupiny patří CDK 7, 8, 9, 11, 12 a 13 [6– 9].

Naším cílem je seznámit čtenáře s nedávno objevenou CDK12, která se účastní regulace buněčné transkripce a u které se prokázala zřejmá spojitost s procesem maligní transformace a kancerogeneze [10,11]. Dříve než budeme detailněji diskutovat aspekty funkce CDK12 v procesu kancerogeneze, je vhodné zmínit skutečnost, že transkripční CDK kinázy byly již dříve spojovány s bio­logií nádoru, z toho CDK9 zaujímá zcela výsadní pozici. Tato CDK, která byla z počátku studována zejm. v souvislosti s regulací replikace viru HIV způsobujícího onemocnění AIDS [12– 14], byla později identifikována jako zcela klíčový transkripční faktor nezbytný pro aktivitu řady dalších transkripčních faktorů a bona fide onkogenů (NFκB, C-MYC, estrogenový receptor, glukokortikoidový receptor a další), jejichž funkce v procesu kancerogeneze již byla detailně popsána [15– 18]. Způsob, jakým CDK9 pozitivně reguluje podřízené molekuly, spočívá v její vazbě na daný faktor/ onkogen a následné fosforylaci tzv. C-terminální domény (CTD) RNA polymerázy II (RNAPII), což má za následek efektivnější produkci onkogen-dependentních genů a iniciaci transformace.

I když se mohlo dlouhá léta zdát, že oblast nádorové bio­logie a transkripčních kináz je již podrobně zmapovaná a nepřinese nové výraznější objevy, v roce 2010 a 2011 vyšly dvě zásadní publikace, které kromě objevu cyklinu K jako nového vazebného partnera CDK12 a CDK13 kináz přesvědčivě prokázaly, že CDK12 je klíčovým faktorem v procesu udržování genomové stability [11,19].

Cyklin-dependentní kináza 12 (CDK12)

CDK12 byla poprvé v literatuře popsaná pod zkratkou CrkRS, která označuje Cdc2- příbuznou kinázu s oblastmi bohatými na arginin/ serin (RS motivy). Toto označení navrhli Ko et al v roku 2001 na základě její příbuznosti s CDK1, původně známou pod označením Cdc2 [20]. Později byla přejmenována na Cdc2- příbuznou protein kinázu 7 (CRK7) a poté na CDK12 [21]. Původně se rovněž předpokládalo, že její regulační podjednotkou je cyklin L1, teprve až recentní objev přímé interakce CDK12 s cyklinem K (CycK) u octomilky (Drosophila m.) a člověka vedl k jejímu definitivnímu označení CDK12 [11,19].

Struktura a vlastnosti CDK12

Lidská CDK12 se skládá z 1 490 aminokyselin a její molekulová hmotnost je 164 kDa. Oproti ostatním CDK, jejichž struktura je převážně tvořena dvěma funkčními oblastmi, struktuře CDK12 dominují tři funkční oblasti, a to katalytická nebo také kinázová doména ohraničená N- a C-rameny. Kinázová doména se nachází v centrální části proteinu, je tvořena přibližně 300 aminokyselinami a je zodpovědná za fosforylaci daného substrátu (obr. 1A). Kinázová doména obsahuje v místě PSTAIRE helixu, známého u CDK1 a ostatních příbuzných CDK, PITAIRE sekvenci. Podobně jak je tomu u CDK1, má i ATP vazební doména CDK12 na svém počátku charakteristické treoninové a tyrosinové aminokyselinové zbytky důležité pro její regulaci, ať už pozitivní, či negativní [20]. Druhým dominantním rysem struktury CDK12 jsou dvě ramena ohraničující kinázovou doménu. V nich je možné rozpoznat několik funkčně odlišných oblastí: 1. oblasti bohaté na arginin a serin, tzv. RS motivy, které hrají důležitou roli v sestavování proteinových komplexů a jsou běžné u proteinů potřebných pro sestřih (splicing) pre-mRNA a alternativní sestřih [22– 24]. Většina –  21 z 22 RS motivů –  se nachází na N-ramenu v prvních 400 aminokyselinách (obr. 1A) a jen jeden RS motiv ve zbývající části proteinu [20]; 2. dalšími funkčně významnými strukturními oblastmi jsou tzv. PRM domény, které jsou bohaté na proliny (obr. 1A). Tyto PRM domény mají význam především v protein-proteinové interakci odehrávající se při tvorbě multiproteinových signálních komplexů, a to díky jejich specifické interakci s SH3, WW nebo prolinovými doménami v jiných proteinech [25,26]. (Této skutečnosti bude jistě možné využít při hledání cílených nízkomolekulárních léčiv.) Protein CDK12 je exprimován ve všech tkáních, z toho zvýšená hladina je detekována ve vaječníku, varlatech, plících, štítné žláze a slezině [27].

Funkce CDK12

Jak již bylo uvedeno, CDK12 se podílí na regulaci transkripce. Vlastní proces transkripce je velmi komplexní a přísně regulovaný děj vycházející z fyziologických potřeb organizmu. Sestává se z mnoha dílčích fází, které je možné pro potřeby přehledového článku rozdělit na iniciaci, elongaci a terminaci [28,29]. Každá z výše zmiňovaných fází současně slouží jako kontrolní bod v regulaci transkripce zprostředkované aktivitou RNAPII.

Pro savčí RNAPII je typická přítomnost tzv. CTD domény, která obsahuje 52krát opakující se heptapeptidový motiv Y₁S₂P₃T₄S₅P₆S₇ [30,31]. V průběhu transkripce dochází k sekvenční fosforylaci jednotlivých serinů, treoninů a tyrozinů nacházejících se v CTD doméně, což funkčně koreluje s příslušnou fází transkripce nebo s přechodem mezi jednotlivými fázemi [32,33]. A právě CDK12 specificky fosforyluje v CTD doméně RNAPII serin v pozici 2 (Y₁S₂P₃T₄S₅P₆S₇) a tím umožňuje přechod transkripce z iniciační do elongační fáze [11,19].

Zajímavou skutečností je ovšem fakt, že CDK12 se nechová jako globální regulátor transkripce, podobně jako je tomu v případě CDK9, která v CTD doméně RNAPII fosforyluje stejné místo. Jak dokazují provedené experimenty, inhibice aktivity CDK12 má za následek snížení exprese pouze malé skupiny genů bez výrazného efektu na transkripci jako celek [11,19,32,34,35]. Z pohledu kancerogeneze je velmi důležitým zjištění, že onou specifickou skupinou CDK12 regulovaných genů jsou právě geny účastnící se, kromě jiného, odpovědi buňky na poškození DNA (damage response/ repair pathway –  DDR): BRCA1, ATM, ATR, FANCI a FANCD2. U všech těchto genů bylo prokázáno, že porucha jejich funkce vede ke vzniku genové nestability a tímto způsobem se uplatňují v procesu vzniku a rozvoje nádorů (obr. 2) [7,36].

Mimo již popsané aktivity v procesu odpovědi buňky na poškození DNA reguluje CDK12, podobně jako CDK9, přechod z iniciační do elongační fáze transkripce. Právě kontrola přechodu mezi iniciační a elongační fází transkripce je v nádorech často narušena, a to nejen zvýšenou aktivitou elongační fáze, jako je tomu např. u různých typů leukemií, ale především ektopickou aktivací protoonkogenů a bona fide onkogenů, jakými jsou JUN, TIF1γ, c-FOS [37– 44]. Zcela bezprecedentní ukázkou, jak významnou roli hraje elongační fáze v rozvoji nádoru, je mechanizmus účinku onkogenu c-MYC. Hladina různých forem onkogenu MYC je významně zvýšena u celé řady nádorových onemocnění, přitom detailní analýzy jednoznačně nevedly k identifikaci c-MYC-dependentních genů, které jsou klíčové pro další vývoj nádoru. Richard Young a jeho tým zjistili, že zvýšení hladiny c-MYC proteinu ve většině nádorů má za následek nespecifické spuštění elongační fáze transkripce, což v konečném důsledku vede k aktivaci genů obecně nezbytných pro rozvoj nádorů, ovšem v případě konkrétního nádoru se vždy jedná o geny specifické výhradně pro tento nádor [45]. Podobně jako c-MYC, také CDK12 reguluje přechod z iniciační fáze do fáze elongační, a proto je odůvodněné se domnívat, že deregulace aktivity CDK12 může mít dramatický dopad na transkripci genů, které se přímo podílejí na iniciaci a rozvoji konkrétního nádoru (obr. 2). Tato hypotéza však dosud nebyla experimentálně potvrzena. V případě, že se tak v budoucnu stane, mohla by CDK12 v závislosti na dalších molekulárních změnách nabývat v kontextu jednotlivých nádorů funkce nejen primárně nádorového supresoru, ale i protoonkogenu.

Klinické aspekty CDK12 

Výsledky výzkumu z posledních let ukazují, že poškození funkce CDK12 může významně narušit proces oprav DNA formou homologní rekombinace, a tím i udržování genomové stability. Primárně se tak děje v důsledku bodových nebo frameshift mutací či nukleotidových záměn, které jsou nejčastěji lokalizovány v kinázové doméně (2/ 3 mutací) a ve většině případů vedou ke ztrátě kinázové aktivity CDK12 a ke snížení exprese genů, které se procesu homologní rekombinace přímo účastní, jako např. BRCA1 a BRCA2 (nepublikovaná data, obr. 1B) [46]. Kromě těchto mutací může ke ztrátě kinázové aktivity CDK12 dojít i při vzniku fúzního proteinu CDK12- ERBB2 (CDK12- HER2), který byl popsán u karcinomů prsu a žaludku nesoucích amplifikaci HER2/ neu genu. Oba geny se nacházejí na chromozomu 17 [41,42,47] a při strukturálních změnách na tomto chromozomu může dojít k deleci části exonu 13CDK12 a k jeho přiřazení k intronu 4HER2/ neu genu. Mutace, které vznikají v RS nebo PRM motivech (1/ 3 mutací), se v kancerogenezi uplatňují spíše odlišným způsobem, a to zejm. narušením procesu sestřihu pre-mRNA/ /mRNA [22– 24]. Následný chybný sestřih změní poměry jednotlivých mRNA postižených genů, což napomáhá v rozvoji daného onemocnění [48]. Kromě toho bylo prokázáno, že snížená hladina CDK12 v buňkách vede k nesprávnému sestavení subjaderných rekombinačních komplexů obsahujících RAD51, a tím opět k problémům s homologní rekombinací [46].

Z klinické praxe již máme důkazy o tom, že je-li v nádorové buňce nefunkční proces oprav DNA, lze toho terapeuticky dobře využít. Porucha funkce genů BRCA1 a BRCA2, ať již navozená mutací, nebo epigenetickými změnami, predikuje u pacientek s karcinomem prsu nebo ovarií zvýšenou pravděpodobnost odpovědi nádoru na deriváty platiny a inhibitory poly(ADP-riboso)polymerázy (PARP inhibitory) [49,50]. Cytostatika na bázi platiny poškozují DNA alkylací, přitom vznikají vnitro- a meziřetězcové kovalentní spoje vedoucí k zásadní změně konformace molekuly DNA, v důsledku které dochází k zástavě replikace i transkripce. Oprava takto poškozených míst probíhá procesem excize nukleotidů (nucleotide excision repair –  NER). PARP1 je enzym uplatňující se v procesu oprav jednořetězcových zlomů DNA (single-strand breaks –  SSB) mechanizmem excize bází (base excision repair –  BER). Pokud jsou výše popsané opravné mechanizmy zablokovány, dochází ke kumulaci SSB a v případě, že buňka vstoupí do buněčného cyklu, není schopna replikace DNA a v místě SSB vznikají dvouřetězcové zlomy (double-strand break –  DSB). Je-li současně nefunkční BRCA1 nebo BRCA2, nelze DSB efektivně opravit, buněčný genom se stává nestabilním a v důsledku těchto závažných poruch se spouští apoptóza nádorové buňky [51].

V kontextu těchto informací se jeví jako velmi zajímavá zjištění o CDK12 kináze publikovaná v roce 2014. Dva autorské týmy nezávisle na sobě potvrdily relativně vysoký výskyt somatických mutací v high-grade serózních ovariálních karcinomech a výrazně zvýšenou citlivost těchto nádorů k cisplatině, melfalanu a k dvěma PARP inhibitorům veliparibu a olaparibu [46]. Z uvedených prací rovněž plyne, že v případě ovariálního karcinomu, u kterého je porucha homologní rekombinace identifikována až u 50 % případů, přičemž pouze 20 % případů lze vysvětlit přítomností patogenní mutace v BRCA genech, může být další významnou příčinou tohoto stavu právě mutace v CDK12 [46]. Bajrami et al naproti tomu vycházeli z genomové analýzy 316 high-grade serózních ovariálních karcinomů, která byla provedena v rámci projektu „The Cancer Genome Atlas“ (TCGA), a zjistili výskyt mutace v BRCA1 genu ve 12 %, BRCA2 genu v 11 %, CDK12 ve 3 %, ATR, ATM a PALB1 v 1 % případů (obr. 1B) [10]. Přitom mutace CDK12 téměř exkluzivně vylučovala současný nález mutace v BRCA1 nebo BRCA2 genech. Provedli proto dodatečnou analýzu exprese CDK12 (mRNA) ve vzorcích uvedených nádorů, jež pocházely od pacientek léčených chemoterapií s platinovým derivátem, a potvrdili téměř dvojnásobné celkové přežití (overall survival –  OS) u těch, jejichž tumory měly nízkou expresi CDK12 (HR = 0,55, p = 0,0076) (graf 1A). Při experimentech s xenografty high-grade serózních ovariálních karcinomů vedla uměle navozená ztráta exprese CDK12 ke zvýšené citlivosti těchto nádorů vůči PARP inhibitoru olaparibu (graf 1B). CDK12 se tak jeví jako slibný prediktor odpovědi na léčbu platinovými deriváty a PARP inhibitory [46].

Závěr

Na základě dosavadních poznatků je tedy možné na CDK12 primárně pohlížet jako na potenciální tumorový supresor, jehož poškození může vést k poruchám replikace DNA a transkripce RNA a tím přispět k procesu kancerogeneze. Stanovení mutačního stavu nebo exprese CDK12 genu může mít v klinické praxi zcela zásadní význam, neboť snížení exprese nebo poškození funkce CDK12 predikuje zvýšenou citlivost k protinádorové léčbě způsobující ve svém důsledku poškození DNA (např. platinové deriváty, alkylační látky, PARP inhibitory). Zvýšená exprese funkčního proteinu může mít za specifických podmínek účinek právě opačný. S ohledem na svoji funkci se CDK12 stává rovněž významným terapeutickým cílem léčiv způsobujících v nádorových buňkách syntetickou letalitu. Vzhledem k tomu, že CDK12 reguluje expresi hned několika genů účastnících se oprav poškozené DNA, lze předpokládat, že anti-CDK12 cílená léčba může být efektivnější, než je tomu např. u PARP inhibitorů. Nicméně výzkum v této oblasti je teprve na počátku.

Poznámka k převzatým obrázkům /  Comment on translation and picture modification

Převzaté obrázky pro tento článek byly pozměněny, včetně překladu nadpisů a komentářů. Za tyto změny nakladatel časopisu Cancer Research, společnost AACR, nenese zodpovědnost.

Translations of any AACR materials into languages other than English are intended solely as a convenience to the non-English-reading public. Translation accuracy is neither guaranteed nor implied. If any questions arise related to the accuracy of the information contained in the translation, please refer to the English version of the AACR journal that is the Cancer Res 2014; 74(1): 287– 297.

Práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR č. NT14599-3, rozvojovým projektem organizace MZe č. MZE-00027162/02:2 a prostředky institucionální podpory výzkumné organizace MOÚ poskytnuté MZ ČR v roce 2014 č. MOÚ, 00209805.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Jiří Kohoutek, Ph.D.

Oddělení chemie a toxikologie

Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i.

Hudcova 296/70

621 00 Brno

e-mail: kohoutek@vri.cz

Obdrženo: 15. 9. 2014

Přijato: 25. 9. 2014