Zmeny membránových enzýmov pri teplej ischémii pečene

Souhrn

Cieľ:
Cieľom štúdie bolo objasnenie morfologických zmien parenchýmu pečene pri prerušení krvného toku pri teplej ischémii a overenie ochranného účinku antioxidantu Stobadínu a derivátu metylxantínu – Pentoxifylínu na tkanivo pečene.

Materiál a metódy:
V súbore 24 prasiat po štandardnej hepatektómii sme morfologicky vyšetrili tkanivo pečene. Rozdelili sme ich do troch skupín, v ktorých sme sledovali aktivitu enzýmov membránového systému hepatocytov (alkalickej fosfatázy a 5´- mononukleotidázy). Prvá skupina bola kontrolná, bez ovplyvnenia ochrannými látkami. Pečeň prasiat sme v druhej skupine ovplyvnili podaním Stobadínu. V tretej skupine sme podali Pentoxifylín. Každú vzorku sme hodnotili softvérom Image Forge Version 1.1. (PROVER LTD., Bratislava). Na podklade metódy prahovania sme namerali mieru aktivity jednotlivých enzýmov v časových intervaloch 10, 60, 80 a 100 minút. Získané výsledky sme následne podrobili štatistickej analýze.

Výsledky:
V normálnej svinskej pečeni bola aktivita pravidelná, rovnomerná na žlčovom póle hepatocytov a v Kupfferových bunkách stien sínusoidov v celom lalôčiku. Po 10 minútach teplej ischémie sme zistili ložiskové výpadky aktivity alkalickej fosfatázy, najmä v zóne 3 pečeňového lalôčika. Po hodine trvania boli uvedené zmeny ešte výraznejšie. V oblasti membrán na žlčovom póle hepatocytov sme zaznamenali postupné znižovanie aktivity 5´-mononukleotidázy, čo odrážalo mieru poškodenia buniek najmä pri centrálnej véne lalôčika.

Záver:
Morfologické nálezy aktivity membránových enzýmov potvrdzujú, že pre zachovanie celkovej funkcie pečene majú najväčší význam zóny 2 a 3 pečeňového lalôčika. Ochranný efekt pri teplej ischémii vykazuje jednorazové podanie Stobadínu a Pentoxifylínu do portálneho riečiska pečene.

Kľúčové slová:
teplá ischémia – svinská pečeň – alkalická fosfatáza - 5´-mono nukleotidáza – Pentoxifylín – antioxidant

ÚVOD 

Teplá ischémia pečene je stav vzniknuvší pri obmedzení alebo prerušení zásobenia pečene krvou pri nezmenenej teplote tela. Plánovane nastáva aj pri extenzívnych resekciách pečene s cieľom obmedzenia krvných strát. Perfúzia pečene sa obmedzí svorkovaním arteria hepatica, vena portae, taktiež infrahepatálneho a suprahepatálneho úseku vena cava inferior. Uvedenými postupmi sa dosiahne úplná eliminácia krvného prietoku v pečeni všeobecne známa ako total vascular occclusion [1]. Predmetom diskusií ostáva permanentne problém stanovenia časového intervalu, počas ktorého nevznikne vážne a ireverzibilné poškodenie funkcií pečene. Odporúčaná maximálna dĺžka uzatvorenia toku krvi orgánom je pre zdravú pečeň 60 minút a pre pečeň postihnutú cirhózou 30 minút [2]. Niektorí autori kondične pripravujú pečeň na ischémiu použitím chirurgickej techniky prerušovaného toku krvi. Umožňuje predĺženie doby ischémie na dvojnásobok [3]. Metóda teplej ischémie pečene sa uplatňuje aj v určitých fázach transplantácie pečene alebo v prípadoch hemoragického šoku s poruchami cirkulácie [4]. 

MATERIÁL A METÓDA 

Používané metódy morfologickej analýzy v pokuse u svíň sme orientovali na sledovanie aktivít enzýmov, ktoré sa považujú za markery stavu bunkovej membrány [5]. Prvým z nich bola alkalická fosfatáza (AF, fosfohydroláza monoesterov kyseliny ortofosforečnej, EC 3.1.3.1.). Ako druhý enzým sme skúmali 5´- mononukleotidázu (5´- áza, 5´-ribonukleotid fosfohydroláza, EC 3.1.3.5.) [6, 7]. Zistené zmeny v kontrolnej skupine A sme porovnali so zmenami v dvoch ďalších skupinách B a C. V skupine B sme za účelom ochrany tkaniva pečene použili antioxidant pyridoindol (Stobadín.2HCl, m. h: 275.2224, šarža: STB/II – DH1011). V skupine C sme chránili tkanivo pečene pred ischemickým poškodením podaním látky s vazodilatačným a rheologickým účinkom – derivát metylxantín-theobromínu Pentoxifylín (Agapurin^®, Zentiva).

Morfologicky sme vyšetrili tkanivo pečene 24 prasiat (kríženec plemena Slovenská biela mäsová a Nemecká Landrasse, SBM x LS), priemernej hmotnosti 36 kg (26–48 kg), u ktorých sme vykonali štandardnú hepatektómiu.

V súbore A (kontrolný) sme vzorky z tkaniva pečene odobrali vo všetkých sledovaných časových intervaloch bez ovplyvnenia vitality tkaniva. Hneď po hepatektómii sme gravitačnou infúznou kanylou zavedenou do vena portae podali 500 ml fyziologického roztoku. Roztok sme podali kontinuálne v intervale 0–10 min. po hepatektómii. Prvú vzorku tkaniva pečene sme odobrali v časovom intervale 0 minút teplej ischémie, pred začatím podávania infúzneho roztoku. Ďalšie vzorky sme odoberali v časovom intervale 10, 60, 80 a 100 minút od prerušenia krvného toku. Pečeň sme medzi odbermi vzoriek ukladali do nádoby s fyziologickým roztokom v termostate pri teplote 37,6 °C.

V súbore B (Stobadín) sme hneď po hepatektómii gravitačnou infúznou súpravou cez kanylu zavedenú do vena portae podali antioxidant Stobadín. Po rozpustení 4,2 mg substancie v 500 ml fyziologického roztoku sme získali 30 μmol.l^-1, t. j. 30 μM roztok. Prvú vzorku tkaniva pečene sme odobrali v časovom intervale 0 minút teplej ischémie, pred začatím podávania infúzneho roztoku. Ďalšie vzorky sme odoberali podľa harmonogramu ako v kontrolnej skupine – súbore A.

V súbore C (Pentoxifylín) sme hneď po hepatektómii gravitačnou infúznou súpravou cez kanylu zavedenú do vena portae podali Pentoxifylín v dávke 100 mg v 500 ml fyziologického roztoku. Ďalej pokračovali odbery vzoriek podľa protokolu ako v kontrolnej skupine.

Aktivitu alkalickej fosfatázy sme zistili naftolom AS-BI-fosfátu a Fast Blue BB. Aktivitu 5´-mononukleotidázy sme zistili metódou Wachsteina a Meisela s použitím nitrátu olova k precipitácii fosfátových iónov [7, 8].

Každú vzorku sme hodnotili softvérom Image Forge Version 1.1. (PROVER LTD., Bratislava). Ním sme namerali percento zastúpenia vopred stanovenej hladiny aktivity jednotlivých enzýmov. Na to sme použili metódu prahovania na základe predpokladu, že rôzne objekty v obraze sme odlíšili od pozadia podľa jasov jednotlivých bodov snímaného objektu. Všetky body s rovnakou intenzitou sfarbenia sme označili zvolenou prahovou hladinou spektra farieb (threshold level). Počet označených bodov sme potom porovnali s počtom bodov celého zorného poľa. Ku každej vyšetrenej vzorke pečene sme priradili číselnú hodnotu, ktorá odrážala mieru aktivity jednotlivých enzýmov. Získané výsledky sme následne podrobili štatistickej analýze. Našim cieľom bolo zistiť, či je rozdiel v aktivitách jednotlivých enzýmov medzi jednotlivými súbormi v jednotlivých časových intervaloch. Na zodpovedanie tejto otázky sme použili zovšeobecnený lineárny model pre opakované merania, ktorý modeluje správanie závislého parametra vo všetkých skupinách v celom časovom priebehu.

V druhej časti sme porovnávali 3 súbory v jednotlivých časoch. Použili sme jednoduchú analýzu rozptylu a následne Bonferroniho [9], resp. Tamhanov test pre viacnásobné porovnávania [10]. V tretej časti nás zaujímala závislosť hodnôt jednotlivých parametrov od času pre jednotlivé súbory. Použili sme v prvom rade lineárnu regresiu. Určili sme krivku takej matematickej funkcie, ktorou je možné čo najvýstižnejšie vyjadriť (fitovať) túto závislosť. Hladina významnosti nami nameraných hodnôt bola vyššia, ako obligatórna hodnota používaná v biologických vedách x = 0,05. 

VÝSLEDKY 

Alkalická fosfatáza

Súbor A: AF – kontrola (Tab. 1, Graf 1)

Pri subjektívnom hodnotení bola pozitívna reakcia na alkalickú fosfatázu na povrchu žlčového pólu hepatocytov, tiež v Kupfferových bunkách sínusoidov pečeňového parenchýmu. Reakcia v žlčových kanálikoch v časových intervaloch 10–100 min. plynulo klesala. Z topografického hľadiska v normálnej svinskej pečeni bola aktivita AF pravidelná, rovnomerná na žlčovom póle hepatocytov a v Kupfferových bunkách stien sínusoidov v celom lalôčiku. Po 10 min teplej ischémie nastali ložiskové straty aktivity najmä zóne 3, neskôr v celom lalôčiku. 

Súbor B: AF – Stobadín (Tab. 1, Graf 1)

Po privodení teplej ischémie nastal vzostup aktivity AF na žlčovom póle hepatocytov, aj v Kupfferových bunkách steny sínusoidov. V 60 až v 80 minúte aktivita AF klesala pod pôvodnú hodnotu a nakoniec v 100 min. mierne narastala, ale pôvodnú hodnotu nedosahovala. Z hľadiska zónovania väčšina aktivity bola v min. 0 na periférii, v 10 min. a v nasledujúcich časových intervaloch sa zónovanie AF neprejavovalo. V min. 100 subjektívne aj objektívne aktivita AF stúpla. V niektorých lalôčikoch aktivita AF chýbala. Z kvantitatívneho hľadiska v 10 min aktivita AF mierne stúpla. V intervale 60 min. až 80 min. pomerne prudko klesla a v intervale 100 min opäť vzrástla približne na úroveň intervalu 60 min.

Súbor C: AF – Pentoxifylín (Tab. 1, Graf 1)

10 minút po privodení teplej ischémie nastávalo pomalé zníženie aktivity AF na žlčových póloch hepatocytov, tiež v Kupfferových bunkách steny sínusoidov. Tento pokles sme zaznamenali tiež v 60 min., aj v 80 min. Aktivita AF napokon v 100 min. mierne vzrástla, ale pôvodnú hodnotu nedosiahla. Z hľadiska zónovania sme našli väčšinu aktivity AF v časovom intervale nula min. na periférii (zóna 3), v časovom intervale 10 min. zónovanie AF zostávalo zachované. V ďalších troch časových intervaloch nastala strata zónovania aktivity AF. V daktorých lalôčikoch aktivita AF chýbala. Z kvantitatívneho hľadiska v 10 minúte aktivita AF mierne klesla. V intervale 60–100 min. zostávala približne na rovnakej úrovni.

5´-mononukleotidáza

Súbor A: 5´-mononukleotidáza – kontrola (Tab. 2, Graf 5)

V časovom intervale 0 minút boli v celom lalôčiku rovnomerne pozitívne reagujúce membrány na žlčovom póle hepatocytov. V časovom intervale 10–100 min sa aktivita membrán na žlčovom póle hepatocytov úplne stratila. Aktivita 5´-ázy zostávala v žlčových vývodoch, ložiskovo aj v endotele vén. V nasledujúcich fázach ischémie boli hrudy reakčného produktu nepravidelne uložené v rozličných zónach lalôčikov pečene. Výsledok obrazovej analýzy vyjadroval hlbší pokles aktivity 5´-ázy v 10. minúte teplej ischémie, ktorý sa v intervaloch 60 a 80 minút významnejšie nemenil.

Súbor B: 5´-áza – Stobadín (Tab. 2, Graf 5)

V časovom intervale 0 min. boli v celom lalôčiku rovnomerne vykreslené pozitívne reagujúce membrány na žlčovom póle hepatocytov. V intervale 10 až 100 min. sa aktivita membrán na žlčovom póle hepatocytov vytrácala. Vidno iba miernu difúzne pozitívnu reakciu v celej cytoplazme hepatocytov. Pri porovnaní so vzorkou neovplyvnenou Stobadínom sme našli v intervale 10 min. mierny pokles aktivity 5´-ázy. V intervale 60 min. jej aktivita rástla nad pôvodnú hladinu a nato klesala. Tento pokles bol menší ako v iných dvoch skupinách.

Súbor C: 5´-áza – Pentoxifylín (Tab. 2, graf 5)

V časovom intervale 0 minút boli v celom lalôčiku rovnomerne vykreslené pozitívne reagujúce membrány na žlčovom póle hepatocytov. V intervaloch 10 až 100 min. bola aktivita na membránach žlčového pólu hepatocytov pri subjektívnom hodnotení nápadne menšia. Našli sme ale miernu difúzne pozitívnu reakciu v celej cytoplazme hepatocytov. Aktivita 5´-ázy klesala vo vzorkách ovplyvnených Pentoxifylínom rýchlejšie ako vo vzorkách ovplyvnených Stobadínom, ale pomalšie ako aktivita v neovplyvnených vzorkách. 

ŠTATISTICKÁ ANALÝZA

Alkalická fosfatáza (AF)

1. S pribúdajúcim časom teplej ischémie sa hodnoty aktivity AF znižovali a v zmenách hodnôt medzi po sebe nasledujúcimi meraniami sa všetky 3 skupiny navzájom líšili štatisticky významne v každom časovom intervale (p < 0,001).
2. V čase 10 a 60 minút platilo, že hodnoty AF boli v kontrolnej skupine štatisticky významne nižšie ako v skupinách ovplyvnených Stobadínom, či Pentoxifylínom. Hodnoty aktivity AF v skupine ovplyvnenej Pentoxifylínom boli štatisticky významne nižšie ako v skupine s ovplyvnením Stobadínom (p = 0,002). V čase 80 a 100 minút sme zistili, že hodnoty AF v kontrolnej skupine bez ovplyvnenia boli štatisticky významne nižšie ako v skupine ovplyvnenej Stobadínom a Pentoxifylínom (p < 0,001).
3. Pri snahe o stanovenie trendu vývoja hodnôt aktivít AF v jednotlivých troch skupinách sme použili lineárnu regresiu. Tento model vyhovoval všetkým trom skupinám, avšak kontrolnej skupine vyhovovala najviac funkcia R2 = 0,804, na rozdiel od skupiny s ovplyvnením Stobadínom, ktorej najviac vyhovovala funkcia R2 = 0,505 (graf 2, 3, 4 ).

5´-mononukleotidáza

1. S pribúdajúcim časom teplej ischémie hodnoty aktivity 5´-ázy klesali a hodnoty medzi po sebe nasledujúcimi meraniami sa vo všetkých troch skupinách navzájom štatisticky významne líšili v každom časovom intervale (p < 0,001).
2. V každom z piatich časových intervalov platilo, že hodnoty aktivity 5´-ázy boli štatisticky významne nižšie, ako hodnoty jej aktivity vo zvyšných dvoch skupinách (p < 0,001). Pri porovnaní hodnôt aktivity enzýmu v skupinách s ovplyvnením pečene antioxidantom Stobadínom a Pentoxifylínom sme zaznamenali štatisticky nižšie hodnoty v skupine, v ktorej bolo tkanivo pečene ovplyvnené Pentoxifylínom (p < 0,001).
3. Na stanovenie trendu vývoja hodnôt aktivít 5´-ázy v sledovaných časových intervaloch pre jednotlivé skupiny sme použili lineárnu regresiu. Tento model vyhovoval všetkým skupinám, avšak najmenej skupine ovplyvnenej Stobadínom (R2 = 0,438) na rozdiel od kontrolnej skupiny (R2 = 0,605) a sledovanej skupiny s ovplyvnením Pentoxifylínom, ktorej najviac vyhovovala funkcia R2 = 0,635 (Graf 6, 7, 8).

DISKUSIA 

Za účelom ochrany tkaniva pečene sme v skupine B použili antioxidant pyridoindol (Stobadín.2HCl, m. h: 275.2224, šarža: STB/II – DH1011) pre jeho efektívny účinok zametača (scavenger) hydroxylových, peroxylových a alkoxylových radikálov a účinok zhášača (quencher) singletového kyslíka [11]. V skupine C sme chránili tkanivo pečene pred ischemickým poškodením podaním látky s vazodilatačným a rheologickým účinkom – derivát metylxantín-theobromínu Pentoxifylín (Agapurin^®, Zentiva). Jeho účinok vysvetľujú znížením vnútrobunkovej hladiny cyklickej fosfodiesterázy monofosfátu adenozínu, čo má za následok vzostup vnútrobunkovej hladiny cyklického monofosfátu adenozínu [12, 13]. Pentoxifylín preukázateľne tlmí syntézu a sekréciu tumor nekrotizujúceho faktora alfa (TNF-α) vo viacerých orgánoch [14]. Rudiger a Clavien [15]dokázali tento tlmiaci vplyv Pentoxifylínu v pečeni laboratórnej myši. Ochranný účinok Pentoxifylínu pri kaskáde patologických zmien počas teplej ischémie pečene opisujú aj ďalší autori [16].

Alkalická fosfatáza

Súbor A: Alkalická fosfatáza – kontrola (Tab. 1, Graf 1)

AF je enzým, ktorý prepravuje rôzne metabolity cez bunkovú membránu. Zvyčajne je na povrchu žlčových kanálikov, a ich poškodenie napr. cholestázou môže privodiť rast aktivity AF na povrchu epitelu vystielajúceho žlčové kanáliky [17]. V našom prípade išlo o pokles membránovej aktivity, privodený ischémiou podobne ako je to známe v iných orgánoch [18].

AF sme použili hlavne ako marker membrán žlčových kanálikov a endotelu sínusoidov. V Kupfferových bunkách tiež ako marker lyzozómov. Pokles aktivity AF výstelky sínusoidov parenchýmu pečene a aktivity AF žlčových kanálikov bol rôzny. Aktivita AF klesla najmä v žlčových kanálikoch. Zistili sme to už v 10 min. a pokles pokračoval aj v ďalších časových intervaloch. Náš nález do istej miery vyhovel opisu poškodenia hepatocytov podľa Vokurku [19, 20], ale hlavne Koudstaala a Hardonka [21], ktorí po galaktózamínovom poškodení pečene potkanov nenašli zmeny hladiny AF vo výstelke sínusov, ale videli ich v žlčových kanálikoch. Treba však brať do úvahy aj ďalší poznatok Koudstaala [22], ktorí referujú o rozdielnej lokalizácii AF v pečeni potkana a človeka. U človeka je za bežných okolností aktivita AF vyššia v stenách sínusoidov na rozdiel od potkana, u ktorého našli nízke hodnoty aktivity AF v žlčových kanálikoch, osobitne na periférii pečeňových lalôčikov.

Súbor B: AF - Stobadín (Tab. 1, Graf 1)

Nami opísaný nález vzostupu aktivity AF v žlčových póloch hepatocytov a v Kupfferových bunkách steny sínusoidov už 10 min. po privodení teplej ischémie naznačil možnosť, že Stobadín ako „zametač“ voľných radikálov v 1. časovom intervale privodil vymedzenú stabilizáciu bunkových membrán [23].

Súbor C: AF - Pentoxifylín (Tab. 1, Graf 1)

Úbytok aktivity AF sme videli už v časovom intervale 10 min. po navodení TI. Nastal v ňom pokles aktivity AF na žlčových póloch hepatocytov a v stenách sínusoidov v Kupfferových bunkách. Podobný nález opisovali v sviniach [24]. Pomalší úbytok aktivity AF v 60 min a v 80 min. ako v neovplyvnených vzorkách dosvedčil ochranný účinok použitej látky. Mierny rast aktivity AF v 100 minúte možno snáď vysvetliť jej nakopením v pozmenených lyzozómoch. Menší rozsah poruchy zónovania aktivity alkalickej fosfatázy nasvedčuje ochrannému účinku Pentoxifylínu.

5´-mononukleotidáza

Súbor A: 5´-mononukleotidáza – kontrola (Tab. 2, Graf 5)

5´– mononukleotidáza je enzým typický pre povrch žlčových kanálikov, aj pre endotel vystieľajúci sínusy. Používali sme ju ako citlivý znak ischémie, sprvu zvratnej povahy [25]. Okrem žlčových kanálikov bola 5´-náza mohutnejšia a citlivejšia ako AF v endotelových bunkách sinusoidov pečene [19, 26]. Použili ju predovšetkým v ischemicko-reperfúznych modeloch poškodenia rozličných orgánov [27, 20]. Veľmi citlivo reagovala osobitne na žlčovom póle hepatocytov. Tam jej aktivita v sledovaných časových intervaloch úplne zanikla.

Súbor B: 5´-áza – Stobadín (Tab. 2, Graf 5)

V intervale 0 minút boli v lalôčiku rovnomerne vykreslené dobre reagujúce membrány na žlčovom póle hepatocytov. Z hľadiska kvality sa úbytok jej aktivity podobal úbytku v neovplyvnenej ischémii. Z hľadiska kvantity nastával jej úbytok oneskorene. Stobadín mohol pôsobiť ako faktor ochraňujúci bunkové membrány endotelu a žlčového pólu hepatocytov. Stabilitu bunkových membrán vyjadrenú aktivitou 5´– ázy je možné ovplyvniť aj prezervačným roztokom.

Súbor C: 5´-áza – Pentoxifylín (Tab. 2, Graf 5)

Aktivita 5´-ázy kvantitatívne klesala v Pentoxifylínom chránenej pečeni rýchlejšie ako v pečeni chránenej Stobadínom, ale pomalšie ako v neovplyvnenej vzorke. Rozdiel vo výsledku bol snáď privodený rôznym mechanizmom obrannej funkcie oboch látok. Stobadín pôsobil ako antioxidans. Pentoxifylín účinkoval cez redukciu syntézy a sekrécie TNF-α [28]. 

ZÁVER

Pri skúmaní morfologických zmien parenchýmu pečene po prerušení krvného toku bez ochrany orgánu chladom sme dospeli k nasledovným záverom.

1. Zistené hodnoty aktivity sledovaných enzýmov boli v jednotlivých skupinách v porovnaní s kontrolnou skupinou štatisticky významné.
2. Hodnoty sledovaných premenných vo všetkých skupinách možno považovať za lineárne závislé na čase. V jednotlivých prípadoch je presnejšie pri určení trendov hodnôt použiť inú obvyklú matematickú funkciu. Väčšinou to je kubická funkcia.
3. Predpokladáme, že ochranu svinskej pečene v teplej ischémii je možné zabezpečiť antioxidantami Stobadínom a derivátom metylxantínu Pentoxifylínom, osobitne v metabolických procesoch, na ktorých sa nami testované enzýmy podieľajú.
4. Výsledky umožňujú vyjadrenie predpokladu, že jednorazové podanie antioxidantu - Stobadínu a derivátu metylxantínu – Pentoxifylínu do portálneho riečiska pečene vystavenej teplej ischémii môže zabezpečiť ochranný efekt aj v humánnej medicíne pri extenzívnych resekciách pečene, pri transplantáciách pečene, alebo v prípadoch hypoperfúzie orgánov z iných obehových príčin, napríklad pri hemoragickom šoku.

Zoznam skratiek

teplá ischémia                                           TI

alkalická fosfatáza                                    AF,

5´- mononukleotidáza                             5´- áza

tumor nekrotizujúci faktor alfa               TNF-α

Slovenská biela mäsová                         SBM

Nemecká Landrasse                                LS  

MUDr. Marek Vician, Ph.D.

Slávičie údolie č. 12

811 02  Bratislava

Slovenská republika

e-mail: vicianmarek@gmail.com