Vizualizácia aktivity nervov bolesti z orgánov tráviaceho traktu

Souhrn

Východiska: Viscerálne aferentné nervy monitorujú vnútorné orgány a sprostredkujú informácie centrálnemu nervovému systému. Úloha aferentných nervov v patogenéze a symptómoch gastrointestinálnych ochorení je často podceňovaná. Preto treba zdôrazniť, že bolesť, pálenie záhy, plnosť, nevoľnosť a vracanie sú všetko symptómy sprostredkované viscerálnymi aferentnými nervami. Dôležité je tiež vyzdvihnúť, že stimulácia viscerálnych aferentných nervov zápalom pri chorobách narúša normálnu reguláciu sekrécie a motility, čím prispieva k symptómom od dysfágie po hnačku a zápchu. Z tohto výpočtu symptómov je zrejmé, že terapeutické ovplyvnenie viscerálnych aferentných nervov by mohlo pomôcť pri liečbe mnohých gastrointestinálnych ochorení. Vývoj nových liekov zameraných na viscerálne aferentné nervy však brzdí nedostatok informácií o týchto nervoch. Napríklad ani receptory pre kyselinu v pažerákových nervoch sprostredkujúcich pyrózu, ako ani iónové kanály zodpovedné za mechanickú aktiváciu v nervoch sprostredkujúcich koliku neboli celkom objasnené. Nedostatok informácií o viscerálnych aferentných nervoch možno vo veľkej miere pripísať ťažkostiam spojeným s ich štúdiom, typicky po jednom nervovom vlákne metódou klasickej elektrofyziológie.

Cieľ: V tomto článku prezentujeme adaptáciu špičkovej vysoko výkonnej metódy na štúdium gastrointestinálnych aferentných nervov, ktorá umožňuje súčasné zobrazovanie aktivity v stovkách neurónov. Táto metóda je založená na genetickej expresii fluorescenčného vápnikového indikátora GCaMP6 a multifotónovej mikroskopie v transgénnej myši. Očakáva sa, že okrem poskytovania základných informácií o viscerálnych aferentných nervoch budúce iterácie tejto metódy umožnia štúdium nervovej aktivity v biopsiách od pacientov s gastrointestinálnymi ochoreniami.

Klíčová slova:

inervácia – gastrointestinálny trakt – bolest – mikroskopia

Úvod

Viscerálne aferentné nervy monitorujú stav vnútorných orgánov a sprostredkujú tieto informácie centrálnemu nervovému systému. V tráviacom trakte sa aferentné nervy podieľajú na reflexnej regulácii fyziologickej motility a sekrécie a za patologických podmienok sprostredkujú informácie o zápale a poškodení tkaniva. Pri chorobách tráviaceho traktu zápalové mediátory a ďalšie signály z poškodených tkanív nadmerne stimulujú aferentné nervy, a preto sa aktivita týchto nervov zvyšuje. Zvýšená aktivita aferentných nervov spúšťa symptómy vrátane bolesti, pyrózy, plnosti, nauzey a zvracania. Zvýšená aktivita aferentných nervov tiež podstatne prispieva k patogenéze tráviacich chorôb, pretože narúša normálnu reguláciu motility a sekrécie. Toto vedie k celému spektru ďalších symptómov, ako napríklad dysfágia, nafukovanie, hnačky a zápcha. Z tohto zoznamu príznakov, ktorý zahŕňa veľkú časť symptómov z tráviaceho traktu, je zrejmé, že tlmenie zvýšenej aktivity aferentných nervov by pomohlo pri liečbe mnohých tráviacich chorôb. Spolu s liečbou základnej príčiny by inhibícia aktivity aferentných nervov zlepšila symptómy a prerušením niektorých patomechnizmov prispela ku kauzálnej liečbe.

Zatiaľ však na liečbu ochorení tráviaceho traktu nie sú k dispozícii žiadne lieky, ktoré by účinkovali priamo na viscerálne aferentné nervy (s výnimkou niekoľkých prevažne experimentálnych látok, ktoré ale často účinkujú aj na centrálny nervový systém). Vývoj nových liekov účinkujúcich na viscerálne aferentné nervy je v súčasnosti veľmi obmedzený pre nedostatok základných informácií o týchto nervoch. Pre odborníkov, ktorí v tejto oblasti nepracujú, je až prekvapivé, ako málo sa vie o viscerálnych aferentných nervoch. Ako príklad môže slúžiť pyróza, ktorá je spôsobená stimuláciou pažerákových nervov kyselinou. Napriek tomu, aká je pyróza častá, stále nie sú známe receptory na pažerákových nervoch, ktoré túto aktiváciu spôsobujú. Podobne, kŕčovité bolesti z distenzie čreva sú sprostredkované mechanickou aktiváciou viscerálnych nervov inervujúcich črevo. Napriek tomu, že distenzia je univerzálny mechanizmus vzniku bolesti v tráviacom trakte (sem patrí napr. aj žlčníková kolika), sa nevie, ktoré iónové kanály na viscerálnych nervoch sú zodpovedné za mechanickú aktiváciu. Keďže teda mnohé základné mechanizmy aktivácie a regulácie excitability viscerálnych nervov nie sú známe, nie je ani možné vyvíjať nové lieky zamerané na ich inhibíciu.

Prečo je známe len tak relatívne málo dôležitých informácií o viscerálnych aferentných nervoch v tráviacom systéme? Je to najmä preto, že štúdium týchto nervov je náročné. Po prvé, hustota viscerálnej aferentnej inervácie je podstatne nižšia ako v somatickom systéme, napr. v koži, čo sťažuje ich štúdium. Po druhé, klasickými elektrofyziologickými metódami sa dá obyčajne študovať naraz len jedno nervové vlákno, čo spomaľuje ich štúdium. Preto by veľmi pomohla metóda na štúdium viscerálnych nervov, ktorou by bolo možné naraz študovať celé populácie neurónov. Našťastie pokrok vo vývoji proteínových fluorescenčných indikátorov a v mikroskopických zobrazovacích metódach v posledných rokoch umožnil zavedenie nových metodických postupov, ktoré prekonávajú hlavné obmedzenia doterajších experimentálnych prístupov. V tomto texte prezentujeme adaptáciu špičkovej vysoko výkonnej metódy na štúdium gastrointestinálnych aferentných nervov, ktorá umožňuje zobrazovanie aktivity v stovkách neurónov súčasne. Táto metóda je založená na genetickej expresii fluorescenčného indikátora pre vápnik GCaMP6 v transgénnej myši a multifotónovej mikroskopii. Zameriavame sa hlavne na štúdium nervov, ktoré sprostredkujú bolesť. Očakávame, že okrem získania základných informácií o viscerálnych aferentných nervoch umožnia budúce iterácie tejto metódy aj štúdium nervovej aktivity v biopsiách od pacientov s gastrointestinálnymi ochoreniami.

Aferentná inervácia gastrointestinálneho traktu

Orgány gastointestinálneho systému majú duálnu vonkajšiu aferentnú inerváciu [1–5]. Časť aferentných neurónov inervujúcich gastrointestinálny trakt (GIT) pochádza z vágových nervov. Tieto neuróny sa nachádzajú vo vágových gangliách v oblasti karotíd a majú centrálne synaptické spojenia s centrami mozgového kmeňa pre autonómnu reguláciu ako aj bolesť z hlavových nervov. Vágové nervy sa podieľajú na fyziologickej regulácii, patologickej dysregulácii a ovplyvňujú vnímanie podnetov z tráviaceho traktu. Druhá časť aferentných neurónov inervujúcich GIT pochádza zo spinálneho systému. Tieto neuróny sa nachádzajú v gangliách zadných miechových rohov a majú centrálne synaptické spojenia najmä so spinálnymi dráhami vedúcimi bolesť. Napríklad pažerák, žalúdok, tenké črevo a proximálna časť hrubého čreva sú aferentne inervované z vágových nodóznych a jugulárnych ganglií a zároveň sú inervované torakolumbárnymi spinálnymi aferentnými neurónmi, ktorých axóny prebiehajú v splanchnických nervoch.

Aferentné nervy v tráviacom trakte sú stimulované najmä podráždením sliznice, distenziou lúmenu orgánov, zmenou pH alebo prítomnosťou zápalových a iných endogénnych mediátorov. V stimulácii zohrávajú dôležitú úlohu aj enteroendokrinné bunky v sliznici a imunitné bunky v stene tráviaceho traktu [6–7]. Na základe experimentálnych štúdií vieme, že v tráviacom trakte sa nachádza množstvo typov zakončení vágových a spinálnych nervov, ktoré charakterizujú ich štrukturálne a funkčné vlastnosti [5,8,9]. Podľa rýchlosti vedenia akčných potenciálov v ich axónoch je možné tiež periférne senzorické neuróny rozdeliť na vlákna s rýchlym vedením (typ A, myelinizované) a s pomalým vedením (typ C, nemyelinizované) [10]. Napriek tomu, že oba typy môžu reagovať na bolesť vyvolávajúce podnety, najväčšia pozornosť v štúdiu bolesti je venovaná neurónom s C-vláknami, ktoré reagujú na rôzne nociceptívne noxy, a sú preto nazývané polymodálne nociceptory [11]. Poznať presný mechanizmus aktivácie aferentných nervov v tráviacom trakte je nevyhnutné pre ďalší výskum v oblasti vývoja vhodnej terapie. Na Johns Hopkins University, School of Medicine v Baltimore, USA sa autori podieľali na adaptácii novej metódy štúdia aferentnej inervácie gastrointestinálneho systému. Z naších skúseností vieme, že súčasne môžeme v rámci jednej stimulácie zaznamenať aktivitu z niekoľkých stoviek neurónov z nodózneho ganglia nervus vagus u myši. Tento postup je v súčastnosti zavádzaný aj na Slovensku vďaka spolupráci s Ústavom patologickej fyziológie Jesseniovej lekárskej fakulty v Martine. Metóda je založená na princípe 2-fotonóvého mikroskopu [12] a detekcie excitácie špeciálnych flourescenčných proteínov [13].

2-fotonóvá mikroskopia

Zobrazovanie v 2-fotónovej mikroskopii, čo je druh fluorescenčnej mikroskopie, je založené na princípe excitácie fluorescenčných molekúl fotónmi laseru a následného zachytenia elektromagnetického žiarenia, ktoré je emitované tkanivom pri jeho prechode na predchádzajúcu pokojovú energetickú hladinu. K tomuto sa v rámci 2-fotónovej (multifonotóvej, nelineárnej) mikroskopie najčastejšie používa Ti-safírový laser [14]. Princíp 2-fotonóveho zobrazovania spočíva v absorbcii dvoch fotónov v danom mieste tkaniva v rovnakom čase (približne v intervale 10-18 s) [12]. To v praxi znamená, že sa používa laser s dvojnásobnou vlnovou dĺžkou fotónov potrebných pre excitáciu fluorescenčného nosiča [14]. Fluorescenčné molekuly sú excitované len v ohniskovej rovine, v ktorej je najvyššia hustota fotónov, pričom v rovinách nad ohniskovou rovinou a pod ňou k excitácii nedochádza. Ďalšou výhodou je nízka fototoxicita. Takto je teda možné zhotovovať trojdimenzionálne snímky živého tkaniva v dostatočne dlhom časovom okne potrebnom pre náročné neurofyziologické experimenty. Navyše, tradičné mikroskopické techniky, ktoré využívajú proces lineárnej (1-fotónovej) absorbcie, sú limitované na použitie len v blízkosti povrchu snímaného tkaniva (resp. max. do hĺbky 100 µm) [15]. Nelineárna 2-fotónová fluorescenčná mikroskopia rieši tento problém, umožňujúc výraznú hĺbku zobrazenia, pretože dokáže usporiadať aj viacnásobne rozptýlený signál [15]. Týmto spôsobom je umožnené snímkovanie do hĺbky niekoľko stoviek mikrometrov [16]. Vďaka nízkej záťaži pre tkanivo umožňuje 2-fotónová mikroskopia v kombinácii so špecifickými technikami značenia štúdium dynamických procesov komplexne v tkanivách vrátane centrálneho [17] a periférneho nervového systému [18].

Calcium imaging s použitím vápnikového indikátora GCaMP6

Calcium imaging (zobrazovanie vnútrobunkového vápnika) je založené na princípe zobrazovania zmien intracelulárneho vápnika a využíva skutočnosť, že akčné potenciály v neurónoch vedú k influxom vápnikových katiónov (Ca2+) do bunky [19]. V proteíne vápnikového indikátora GCaMP6 je fluorescenčný proteín naviazaný na kalmodulín, ktorý slúži v bunke ako univerzálny sekundárny messenger vo vápnikovej signalizácii vo vnútri bunky. Za pokojových podmienok nie je GCaMP6 fluorescenčný. Pri aktivácii neurónu (t.j. pri akčných potenciáloch) sa bunková membrána opakovane depolarizuje, čo vedie k vstupu iónov vápnika do bunky cez napäťovo riadené vápnikové kanály. Intracelulárny vápnik sa naviaže na GCaMP6, čím sa robustne zvyšuje jeho fluorescenčná excitabilita, ktorú je možné kvantifikovať vhodnými zobrazovacími technikami, ako je napr. multifotónová mikroskopia [13]. Na rozdiel od elektrofyziológie, ktorou je možné naraz snímať aktivitu len niekoľkých buniek, je mikroskopicky možné naraz snímať GCaMP6 fluorescenciu prakticky zo všetkých buniek v zornom poli. Pri vhodnej voľbe parametrov je možné naraz sledovať aktivitu stoviek neurónov v reálnom čase, čo predstavuje výrazný posun v možnostiach výskumu nervovej aktivácie a jej cieleného ovplyvnenia.

Efektívnymi metódami expresie GCaMP6 v neurónoch je cielené kríženie transgénnych pokusných zvierat alebo génový prenos pomocou adeno asociovaného vírusu, ktorý reverzne vpíše gén nutný pre expresiu fluorescenčného proteínu do deoxyribonukleovej kyseliny danej bunky [20]. V našich experimentoch sme využili transgénne myši Pirt-Cre; R26-GCaMP6 [21], u ktorých je expresia GCaMP6 reproducibilná počas mnohých generácií [13]. U týchto myší sa geneticky modifikované potomstvo získava použitím Cre-Lox rekombinantného systému [22]. Výhoda tohto postupu je, že pod nepriamou kontrolou Pirt promotora dochádza k expresii GCaMP6 prakticky vo všetkých aferentých neurónoch [23]. Veľmi dôležité je, že pritom nedochádza k jeho expresii v gliových, imunitných a väzivových bunkách, ktoré sú tiež súčasťou zobrazovaného aferetného nervového ganglia, a teda ich aktivita neinterferuje s meraním aktivity neurónov [24]. Keď sa pri kvantifikácii GCaMP6 fluorescencie využíva 2-fotótonová mikroskopia s vlnovou dĺžkou excitačného lasera 920 nm, nedochádza k tzv. photobleachingu GCaMP6, a preto je kvalita signálu stabilná aj pri opakovanej stimulácii [25]. GCaMP6 je veľmi vhodný pre sledovanie aktivity neurónov, lebo dokáže zachytiť už jeden akčný potenciál v nervus vagus [25]. Pirt-Cre; R26-GCaMP6 transgénne myši tak predstavujú ideálny nástroj na komplexné štúdium celej populácie aferentných neurónov.

Priebeh experimentu

Popísané postupy umožňujú štúdium mechanizmov aktivácie nervových zakončení v pažeráku v unikátnom izolovanom ex vivo systéme, ktorý nie je skreslený komplexnou aktivitou, motilitou a reflexnou reguláciou pažeráka prítomnou v živom organizme. Pažerák sa spolu so študovanými vágovými alebo spinálnymi nervami a ich gangliami izoluje pomocou jemnej disekcie okamžite po usmrtení myši a udržuje sa optimálne vitálny pomocou perfúzie zohrievaným (37 °C), okysličovaným roztokom obsahujúcim glukózu a fyziologické koncentrácie základných katiónov a aniónov počas niekoľkých hodín. Ako je ukázané na obrázkoch 1A–B (obr. 1), izolovaný pažerák sa umiestni do perfundovaného tkanivového kompartmentu, kde sa do pažeráka podávajú testované stimuly. Nervové gangliá s neurónmi exprimujúcimi vápnikový indikátor GCaMP6S spojené s pažerákom pomocou zachovaných vágových alebo spinálnych nervov sa umiestnia pod piezoelektrický, pohyblivý (v Z-osi) špeciálny objektív multifotónového mikroskopu. Typický pokus je zobrazený a popísaný na obrázkoch 1C–E (obr. 1).

Autori doteraz študovali chemicky, mechanicky alebo elektricky vyvolanú aktiváciu vo viac ako 1 000 neurónoch v pokusoch zameraných na reguláciu viscerálnych nervov napäťovo riadenými sodíkovými kanálmi NaV1.1. V súčasnosti sa pripravujú pokusy, ktoré budú objasňovať receptory zodpovedné za aktiváciu nervov inervujúcich pažerák neurotrofínmi, chemokínmi, cytokinínmi, interferónmi a ďalšími mediátormi zápalu, ktoré ovplyvňujú nervovú reguláciu a vnímanie pyrózy a bolesti z pažeráka.

Záver

Detailné pochopenie neurofyziológie aferentnej signalizácie z tráviaceho traktu je dôležitý predpoklad pre vývoj nových účinných terapií pre ochorenia, u ktorých sa v patofyziológii ich vzniku uplatňuje nadmerná aktivita v dôsledku kombinácie zvýšenej stimulácie a/alebo zvýšenej citlivosti aferentných nervov. Hoci sa často stretávame s názorom, že aferentné nervy z GIT a dalších viscerálnych systémov sú už dostatočne známe, v mnohých prípadoch zatiaľ nepoznáme ani základné mechanizmy regulácie ich excitability za fyziologických podmienok a už vôbec nie ich zmeny pri chorobách. Popísaný vývoj nových experimentálnych postupov, ktoré sa budú dať v blízkej budúcnosti použiť aj na štúdium bioptických vzoriek z ľudských orgánov, umožní efektívne vyplniť tieto medzery v poznaní a bude motivovať a usmerňovať vývoj nových stratégií zameraných na tlmenie nadmernej aktivity viscerálnych aferetných nervov.

Doručené: 11. 6. 2019

Prijaté: 27. 7. 2019

MUDr. Peter Bánovčin Jr, PhD.

Interná klinika – gastroenterologická

JLF UK a UN Martin

Kollárova 2

036 59 Martin

pbanovcin@gmail.com

Konflikt záujmov: Autori deklarujú, že text článku zodpovedá etickým štandardom, bola dodržaná anonymita pacientov a vyhlasujú, že v súvislosti s predmetom článku nemajú finančné, poradenské ani iné komerčné záujmy.

Publikačná etika: Príspevok nebol doteraz publikovaný ani nie je v súčasnosti zaslaný do iného časopisu na posúdenie.

Autori súhlasí s uverejnením svojho mena a e-mailového kontaktu v publikovanom texte.

Dedikácia: Článok nie je podporený grantom ani nevznikol za podpory žiadnej spoločnosti.

Redakčná rada potvrdzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritériá pre publikácie zasielané do biomedicínskych časopisov.