Experimentální model perianální píštěle na malém laboratorním zvířeti

Souhrn

Perianální píštěl je časté onemocnění vyžadující chirurgickou intervenci. V současné době jsou předmětem výzkumu nové alternativní terapeutické metody (transplantace mezenchymálních buněk, aplikace fibrinových lepidel nebo zátek – plugů). K ověření účinnosti těchto technik v experimentu je potřebný vhodný model na laboratorním zvířeti. Cílem práce bylo vytvořit klinicky adekvátní model perianální píštěle umožňující hodnocení nových terapeutických metod.

Metody:
U 30 potkanů kmene Wistar byla provedena axiální cékostomie s protažením céka 2,5 cm dlouhým podkožním kanálem simulujícím trakt píštěle. Po 40denním sledování byla zvířata randomizována do tří skupin. V první skupině byla píštěl ošetřena pomocí sutury ústí, ve druhé skupině pomocí podvazu traktu píštěle, třetí skupina byla kontrolní bez intervence.

Výsledky:
Model byl technicky proveditelný u všech zvířat v průměrném operačním čase 22 (± 5,1) min. Během 40denního sledování dvě zvířata (7 %) uhynula první a pátý den po založení cékostomie a u jednoho zvířete (3 %) došlo ke spontánnímu zhojení píštěle. Randomizováno bylo tedy celkem 27 zvířat. Ve skupinách se suturou ústí (n = 9), podvazem traktu píštěle (n = 12) a kontrolní skupině (n = 6) došlo ke zhojení u tří (33 %), šesti (50 %) a 0 (0 %) zvířat. Výsledky v intervenčních skupinách jsou ve shodě s výsledky klinických studií.

Závěr:
V experimentální práci byl vytvořen klinicky adekvátní model perianální píštěle vhodný pro hodnocení nových léčebných metod.

Klíčová slova:
perianální píštěl – zvířecí model – laboratorní potkan

---

Perianální píštěle jsou frekventním onemocněním s předpokládanou incidencí 1–2,3 na 10 000 obyvatel [1]. Píštěl tvoří vnitřní ústí v oblasti anorekta, trakt procházející perianální či perirektální oblastí a zevní perianální ústí. Právě komunikace se zažívacím traktem vede k přetrvávající sekreci.

Léčba perianální píštěle vyžaduje většinou opakované chirurgické intervence s rozdílnou úspěšností. V 80 % případů se jedná o píštěle kryptoglandulární etiologie, které se obvykle primárně manifestují vznikem perianálního abscesu [2]. Po jeho evakuaci je trakt píštěle drénován trasovací nebo elastickou ligaturou. Po regresi zánětu je možný pokus o eradikaci píštěle. K nejjednodušším metodám eradikace patří sutura vnitřního ústí, fistulo­tomie nebo fistulektomie, případně postupné vyhojení traktu fistuly dotahováním elastické ligatury. Tyto metody jsou rezervované pouze pro povrchové píštěle nebo píštěle transfinkterické, postihující pouze malou část svěrače (maximálně distální třetinu svěrače) [3]. U ostatních typů píštělí je po této léčbě vysoké riziko inkontinence 6–25 % [4].

Mezi sfinkter šetřící metody léčby patří ošetření vnitřního ústí překrytím slizničním lalokem (rectal advancement flap – RAF) nebo relativně nová jednodušší technika intersfinkterického podvazu traktu píštěle (ligation of the intersphincteric fistula tract – LIFT) [5,6]. Obě metody dosahují dlouhodobého zhojení mezi 40 a 90 %. Jedná se však o techniky výrazně „expert dependentní“ [5,7]. Komplikovanější je hojení v případě perianální Croh­novy nemoci, při které jsou pacienti významně ohroženi inkontinencí a trvalým střevním vývodem. Kombinace konzervativní a chirurgické léčby je u těchto pacientů efektivní asi ve 40–60 % a recidiva píštělí se vyskytuje až u 50 % pacientů [8].

Dalšími metodami jsou alternativní uzávěry traktu píštěle pomocí zátek z biologických materiálů či lepidel (anal fistula plug, fibrinová lepidla) s frekvencí zhojení 40–60 % a v případě Croh­novy kolem 35 % [9–11].

V posledních letech se objevilo i několik studií zabývajících se léčbou pomocí lokálního podání mezenchymálních zárodečných buněk (mesenchymal stem cells – MSCs) [12]. Přítomnost těchto buněk v oblasti píštěle má imunomodulační a protizánětlivý efekt, což může vést k jejímu zhojení [13]. Možným zdrojem MSCs je tuková tkáň. Po purifikaci mohou být zárodečné buňky aplikovány do perifistulární tkáně nebo do traktu píštěle autologně, tedy bez nutnosti ­imunosuprese [14].

Léčba perianálních píštělí je obtížná a stále se zkoušejí nové techniky a jejich kombinace ve snaze zvýšit jejich úspěšnost. K experimentálnímu hodnocení a vývoji nových metod je nezbytný klinicky adekvátní model píštěle. Tento model by měl být jednoduchý, snadno reprodukovatelný a zatížený minimální morbiditou a mortalitou. Píštěl musí mít vnitřní ústí v zažívacím traktu, vlastní trakt a zevní ústí. Vytvořená píštěl by neměla přerušit kontinuitu zažívacího traktu, i když s ním musí komunikovat, a nemělo by docházet k jejímu spontánnímu zhojení [15]. Píštěl musí být snadno vyšetřitelná. Poloha a trakt píštěle by měly umožňovat aplikaci zátek (plugu) nebo suspenze (fibrin, buněčná suspenze MSCs) do lumina, resp. do perifistulární tkáně. U experimentálního modelu perianální píštěle by mělo po běžně používaném chirurgickém ošetření docházet ke zhojení ve frekvenci obdobné jako v klinické praxi.

Cílem práce bylo vytvořit experimentální model perianální píštěle, který umožňuje hodnocení nových terapeutických metod (transplantace MSCs). Sekundárním cílem bylo ověřit klinickou adekvátnost modelu.

Materiál a metoda

K experimentu bylo použito celkem 30 potkanů kmene Wistar váhy ­250–350 g.

Zvířata byla sedována a relaxována intramuskulárním podáním tiletamin hydrochloridu, zolazepam hydrochloridu (Zoletil, Virbac, ČR) s xylazinem (Rometar, Bioveta, a. s., ČR) ve směsi Zoletil 5 ml + Rometar 2% 7 ml + fyzio­logický roztok (8 ml) v dávce 0,1 ml/200 g váhy zvířete vždy minimálně 30 min před začátkem operace. Po fixaci na zádech a přípravě operačního pole byla provedena krátká (­2,5–3cm) střední laparotomie. Slepá část céka byla protažena fascií a svalem do podkoží cca 0,5 cm laterálně od laparotomie. Cékum pak bylo protaženo 2,5 cm dlouhým podkožním kanálem, simulujícím trakt píštěle, do vzdálenosti 3 cm od laparotomie, kde bylo kožní incizí vytaženo ven, otevřeno a fixováno jednotlivými stehy ke kůži (Vicryl, 4/0) jako axiální cékostomie. Po kontrole krvácení byla laparotomie uzavřena po vrstvách (obr. 1).

Zvířata byla uložena zpět do chovné nádoby s neomezeným přísunem vody a krmiva. Tímto způsobem byla vytvořena samostatná skupina modelu perianální píštěle.

Po 40 dnech byli potkani vyšetřeni a celkem 27 z nich (dvě zvířata zemřela, jednou došlo ke spontánnímu zhojení viz níže) bylo randomizováno do tří skupin. V první skupině byla u devíti zvířat provedena prostá sutura ústí píštěle jednotlivými stehy (Vicryl, 3/0) (obr. 2). Ve druhé skupině byla u 12 zvířat podvázána píštěl pomocí opichu jednoduchým stehem (Vicryl 3/0) v polovině podkožního traktu (simulace metody LIFT) (obr. 3). Třetí skupina (šest potkanů) byla kontrolní, bez intervence.

Hodnocení zhojení píštěle probíhalo v krátké celkové inhalační anestezii (Isoflurene, Piramal Healthcare, UK) podle kritérií Americké gastroentero­logické asociace (AGA). Sterkorální nebo purulentní sekrece ze zevního ústí při kompresi byla považována za otevřenou píštěl [16]. U dvou zvířat byla provedena fistulografie k ověření kontinuity zažívacího traktu.

Po ukončení follow-up byla zvířata utracena podáním letální dávky Thio­pentalu (PharmaSwiss, ČR).

Pokusy probíhaly v Institutu klinické a experimentální medicíny v Praze po schválení etickou komisí v souladu se Zákonem č. 246/1992 Sb., Na ochranu zvířat proti týrání. Intervenční skupiny byly srovnány s kontrolní skupinou pomocí Fischerova exaktního testu.

Výsledky

Model píštěle byl technicky proveditelný u všech 30 operovaných zvířat. Operační výkon trval průměrně 22 (± 5,1) min. Celkem dvě (7 %) zvířata uhynula první, resp. pátý pooperační den. Ostatní zvířata prospívala a přibývala na váze. U jednoho (3 %) zvířete došlo ke spontánnímu zhojení píštěle. Ostatní píštěle zůstaly otevřené a průchodné pro sondu. Střední délka follow-up byla u modelové skupiny 41 dnů (23–98). Fistulografie provedená měsíc od vytvoření modelu potvrdila průchodnost píštěle se zachovanou kontinuitou zažívacího traktu (obr. 4).

Po vytvoření modelu se u zvířat intermitentně objevil odchod řídké stolice píštělí. Kůže v okolí zevního ústí byla přechodně macerovaná.

Po vyloučení zmíněných tří zvířat bylo randomizováno celkem 27 potkanů. Ve skupině s jednoduchou suturou ústí (n = 9) se píštěl zhojila ve třech případech (33 %). Ve skupině s podvazem píštělového kanálu (n = 12) došlo ke zhojení u šesti (50 %) zvířat (obr. 5). Po intervenci neuhynulo ani jedno ze zvířat. V kontrolní skupině (n = 6) ne­došlo ani v jednom z případů ke zhojení píštěle nebo k úmrtí. Frekvence zhojení píštěle byla vyšší v intervenčních skupinách ve srovnání s kontrolní skupinou, tento rozdíl byl u potkanů po podvazu traktu píštěle na hranici signifikantnosti (p = 0,05) (tab. 1).

Medián follow-up po randomizaci byl 39 (14–62) dnů. Při pozitivním testu píštěle podle kritérií AGA byl při kompresi nejčastěji pozorován odchod stolice s purulentní příměsí.

Diskuze

Předmětem současného výzkumu jsou nové metody léčby perianálních píštělí jako intrafistulární aplikace zátek (plugů) nebo transplantace MSCs. Druhá zmíněná metoda byla publikována jako první fáze klinického hodnocení v rámci multicentrické prospektivní studie (200 nemocných), ve které bylo prokázáno zhojení píštěle u 50 % pacientů jeden rok po aplikaci buněk v kombinaci s fibrinovým ­lepidlem [12].

Vzhledem k ne zcela přesvědčivým výsledkům by měly následovat další spíše experimentální studie, které by pomohly popsat proces hojení píštěle po transplantaci mezenchymálních buněk a případně zkoumat modifikace techniky. Jde především o délku přežití MSCs in vitro a in vivo, jejich diferenciaci a eventuální redistribuci do okolí píštěle, případně vhodné způsoby aplikace.

Podrobné funkční a morfologické vyšetření umožňuje pouze zvířecí model. Publikovány byly experimentální modely perianální píštěle na velkých a středních laboratorních zvířatech (prase, králík). Nejčastěji užívanou technikou je perforace anorekta směrem ven s vytvořením transsfikterického kanálu s následným zavedením a ponecháním drénu [17,18]. Tyto modely jsou klinicky adekvátní, nicméně manipulace s velkými zvířaty a časté anestezie při evaluaci píštěle jsou technicky náročné a nákladné a neumožňují vytvořit dostatečně velké skupiny zvířat. V případě hodnocení efektu transplantace MSCs je problematické i zajištění inbredních kmenů nebo adekvátní imunosuprese. Vzhledem k nutnosti většího počtu subjektů v intervenčních skupinách potřebných pro statistické zpracování se naopak jeví výhodné zvolit jako subjekt malé laboratorní zvíře (potkan), které bylo po­užito i v této práci.

V první fází experimentu byl technicky vytvořen vlastní model píštěle. Celkem bylo zařazeno 30 zvířat tak, aby tuto skupinu bylo možné použít i v dalších studiích při sledování efektu léčby. Ve druhé části pokusu byly po randomizaci použity běžné výše popsané chirurgické techniky k uzávěru píštěle v intervenčních skupinách k ověření klinické relevance modelu. Cílem bylo dosažení obdobně nízké frekvence zhojení, která je po intervenci popisována u pacientů s perineální píštělí. Splnění tohoto cíle bylo podmínkou uznání adekvátnosti modelu.

Bültmann et al [15] k modelu střevní píštěle použili dvě různé techniky (s evertovaným okrajem / bez evertovaného okraje) provedení cékostomie u potkana. Autoři popsali nulovou mortalitu a ani u jednoho ze zvířat nedošlo ke spontánnímu zhojení píštěle. Intermitentní odchod průjmovité stolice stomií byl pozorován v pooperačním období ve shodě s prezentovaným modelem. Tato píštěl však byla popisována jako enterální a nebylo uvažováno o jejím možném využití k experimentálnímu zkoumání hojení perianálních píštělí. Hodnocení míry klinické korelace pomocí efektu ošetření jednoduchými chirurgickými technikami (sutura ústí, podvaz traktu píštěle) nebylo v této studii provedeno. Autoři model doporučují vzhledem k technicky jednoduchému provedení bez další specifikace. Možnou alternativou je vyvedení cékostomie pomocí speciálně upravené kanyly [19]. Jedná se o model sice technicky jednodušší, ale jeho využitelnost je omezená k odběrům vzorků stolice. K hodnocení metod léčby píštěle je pro ponechanou kanylu zcela nevhodný.

Námi prezentovaný model cékostomie (skupina 30 potkanů) splňuje požadovaná kritéria. Je snadno reprodukovatelný, zatížený nízkou mortalitou (7 %) a spontánně dochází ke zhojení píštěle výjimečně (3 %). Není porušena kontinuita zažívacího traktu, všechna zvířata měla střevní pasáž a přijímala potravu, a píštěl je tudíž teoreticky zhojitelná. Přitom byla vytvořena permanentní komunikace píštěle se zažívacím traktem, což znesnadňuje hojení stejně jako u perianálních píštělí. Vytvořená modelová píštěl má vnitřní a zevní ústí a vlastní trakt. Trakt zůstává průchodný v dostatečné šířce i délce, což umožňuje využití k testování intraluminálních technik (plugů). Okolí traktu a zevní ústí píštěle je dobře přístupné k aplikaci buněčné suspenze do perifistulárního prostoru. Vnitřní ústí píštěle je dostupné transkutánně či pomocí sondy, není však možné hodnotit techniky, které se používají při transanálním ošetření vnitřního ústí (RAF), což je jedinou nevýhodou modelu. Trakt modelové píštěle je vystlán intestinálním epitelem. Tento faktor je považován za jednu z příčin perzistence perianální píštěle u pacientů s idiopatickým střevním zánětem [20].

V rámci hodnocení míry klinické korelace byla píštěl ošetřena dvěma základními chirurgickými technikami. Při prosté sutuře ústí píštěle dochází v klinické praxi ke zhojení ve 40–60 %. Hojení je výrazně horší u píštělí vzniklých na podkladě Crohnovy choroby [21,22]. Tomu odpovídá i výsledek v prezentované intervenční experimentální skupině, kde došlo po sutuře ústí ke zhojení pouze u třetiny zvířat. Metoda podvazu traktu píštěle (LIFT) vede ke zhojení průměrně u 60 % pacientů [6,7,23]. V hodnocené experimentální skupině to bylo u 50 % zvířat, což je vzhledem k velikosti souboru odpovídající. Do skupiny s plánovaným podvazem traktu bylo primárně zařazeno více zvířat pro předpokládanou nižší úspěšnost této léčby. Proto vznikly početně rozdílné skupiny. I když frekvence zhojení v intervenčních skupinách byla vyšší než ve skupině bez intervence, chirurgická eradikace píštěle nebyla uspokojivá (33–50 %) stejně jako v humánní medicíně.

S ohledem na tyto výsledky lze model označit za klinicky adekvátní ke zkoumání metod léčby perianálních píštělí. Vzhledem k přítomnosti intestinálního epitelu v traktu píštěle a horší tendenci k hojení může model simulovat i perianální postižení u pacientů s Crohnovou chorobou.

Závěr

V experimentální studii byl vytvořen jednoduchý model perianální píštěle na malém laboratorním zvířeti. Tento model je vhodný pro hodnocení nových technik léčby, jako jsou transplantace MSCs, aplikace fibrinového lepidla nebo plugu. Klinický korelát modelu byl ověřen ošetřením základními chirurgickými technikami s výsledky odpovídajícími klinické praxi.

Podpořeno grantem IGA: NT 13708.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Doručeno: 13. 7. 2013

Přijato: 7. 8. 2013

MUDr. Ondřej Ryska

Chirurgická klinika

2. LF UK a ÚVN, Praha

U Vojenské nemocnice 1200

160 00 Praha 6

ondrejryska@centrum.cz