Význam stanovování cirkulujících nádorových buněk v diagnostickém a léčebném procesu u karcinomu ovaria

Souhrn

Cíl studie:
Naším cílem bylo shrnout klinické studie, které detekovaly CTC/CSCs pro určení prognózy u pacientek s karcinomem vaječníků.

Typ studie:
Přehledová práce.

Název a sídlo pracoviště:
Gynekologicko-porodnická klinika 3. LF UK a FNKV, Praha.

Předmět a metoda studie:
Prezentovaný článek popisuje různé metody detekce CTCs jako jednoho z možných nových biomarkerů, použitelných v rámci diagnostického a terapeutického procesu u karcinomu ovaria.

Závěr:
Stanovování CTC (cirkulujících nádorových buněk) / CSCS (rakovinných kmenových buněk) má obrovský potenciál v diagnostice, stanovení prognózy, monitoringu onemocnění, terapeutického účinku a rizika relapsu u karcinomu ovaria i u dalších malignit. Přítomnost CTCs/CSCs v krvi se zdá být rozhodujícím faktorem iniciace metastatického procesu. Z výsledků uvedených studií vyplývá zřejmá souvislost CTC negativity s prodluženou délkou intervalu bez progrese (PFI) a celkového přežití (OS) u pacientek s karcinomem ovaria.

Klíčová slova:
cirkulující nádorové buňky – nádorové kmenové buňky – metastazování – karcinom ovaria

ÚVOD

Rakovina vaječníků je druhou nejčastěji diagnostikovanou gynekologickou malignitou. Hlavní příčinou úmrtí v důsledku rakoviny vaječníků je její metastatické šíření do mnoha tkání a orgánů. Metastatický proces vyžaduje migraci nádorových buněk z primárního ložiska do vzdálených míst. Dokonce i u nádorů šířících se zejména lymfatickým systémem je hematogenní rozsev nejčastější cestou metastazování. Migrace rakovinných buněk z primárního nádoru do krevního oběhu je podmíněná epitelo-mezenchymální tranzicí (EMT). Protože se tyto buňky pak dále šíří v krvi, jsou označovány jako cirkulující nádorové buňky (CTCs). Populace CTCs se dynamicky vyvíjí a mění, pokud jde o počet CTC v krvi. Dalšími účastníky nádorového rozsevu jsou rakovinné kmenové buňky (CSCs),vznikající z diferencovaných nádorových buněk přes EMT a zárodečným transdiferenciačním procesem. Přítomnost CTCs/CSCs v krvi se zdá být rozhodujícím faktorem iniciace metastatického procesu. V klinických studiích byl prokázán prediktivní a prognostický význam CTC u pacientů s metastazujícím karcinomem prsu, prostaty a tlustého střeva.

Velká část ovariálních nádorů je diagnostikována ve stadiu III/IV (75–80 %). Časná diagnóza a detekce metastáz spolu s optimálním posouzením účinnosti léčby by byly jednoznačně cestou ke zlepšení přežívání. Na systémovou léčbu u ovariálního karcinomu odpovídá přibližně 80 % pacientek. Za nejlepší sérový biomarker monitorující onemocnění je v současné době považován CA 125 (MUC-16), jeho specificita je však relativně nízká. Proto je nadále třeba identifikovat nové prediktivní biomarkery pro rozhodování v procesu léčby, které by vedly k individualizaci nádorové terapie u ovariálního karcinomu.

DETEKCE CIRKULUJÍCÍCH NÁDOROVÝCH BUNĚK

Detekce, kvantifikace a molekulární charakterizace CTCs mají obrovský potenciál v mnoha oblastech onkologie. V počátečních stadiích onemocnění CTCs mohou být použity k určení rizika metastazování a posouzení prognózy. V průběhu léčby mohou být CTCs použity ke zhodnocení účinnosti terapie, nebo jako pomocná metoda při volbě nejvhodnějšího léčebného režimu. To by mohlo napomoci k individualizaci terapie a snížení jejích potenciálně nepříznivých účinků. Navíc by molekulární analýza CTCs mohla napomoci ke zdokonalení cílené biologické léčby. Nicméně detekce a izolace CTCs je technicky dosti náročná. V prvé řadě je množství CTCs v periferní krvi poměrně malé, asi 1 CTC na 106–109 normálních krevních buněk [19, 29, 30], a dále jsou tyto buňky relativně heterogenní skupinou.

Mezi nejčastěji používané metody pro izolaci CTC patří imunomagnetická separace, separace podle velikosti na bázi filtrace a metody gradientu hustoty ve spojení s imunohistochemií.

IMUNOMAGNETICKÁ SEPARACE

Imunocytochemická detekce CTC v periferní krvi se obvykle provádí v kombinaci s odstředěním gradientu hustoty. Jedinou metodou, která byla zatím americkou agenturou Food and Drug Agency (FDA) schválena pro klinické vyžití, je CellSearch (Veridex, Raritan, NJ). CellSearch je založen na imunomagnetickém obohacování a je semi-automatickou metodou, která obohacuje CTC v krvi pomocí ferrofluid – nanočástic potažených anti-EpCAM protilátkami (pozitivní selekce). Obohacená populace je následně obarvena fluorescenčním jaderným barvivem DAPI, fluorescenčními protilátkami specifickými pro CD45 (negativní selekce leukocytárních buněk) a fluorescenčními protilátkami vůči intracelulárním cytokeratinům 8, 18 a 19, které jsou specifické pro epitelové buňky. Analýza vzorků se pak provádí v Cell-Spotter analyzátoru, složeném ze čtyř barevných semi-automatizovaných mikroskopů, které identifikují epitelové buňky (např. CTCs) jako DAPI pozitivní, cytokeratin pozitivní a CD45 negativní [3].

Podobně AdnaTest (AdnaGen AG, Lan-genhagen, Německo) je založený na zachycení buněk epiteliálních nádorů, tedy buněk exprimujích na povrchu buněk vazebnou molekulu – EpCAM, která obvykle není přítomna u krevních buněk.

AdnaTest využívá kombinaci protilátek EpCAM/mucinu 1 (MUC1) u karcinomu prsu a tlustého střeva, u karcinomu ovaria a prostaty kombinaci EpCAM/HER2 [6, 14, 29]. Obohacená CTC frakce je dále analyzována pomocí semikvantitativní RT-PCR pro transkripty spojené s nádorovým procesem, např. EpCAM, HER2, MUC1, CAE, PSA, PSMA, EGFR. Omezením výše uvedených metod separace je to, že detekce EpCAM a/nebo cytokeratinů může být ovlivněna procesem EMT (epiteliálně mezenchymální tranzice) [24, 27, 28]. Frekvence CTC s mezenchymálními a/nebo EMT vlastnostmi se zvyšuje u pacientů, kteří jsou rezistentní na léčbu [1] a také u pacientů s metastatickým onemocněním v porovnání s časným stadiem onemocnění [12].

SEPARACE ZALOŽENÉ NA VELIKOSTI

CTC-obohacení na základě velikosti buňky řeší problém snížení EpCAM exprese na CTCs buněčné membráně. Nicméně, filtrace ukazuje relativně nízkou senzitivitu a specifitu, protože malé CTCs mohou uniknout detekci, zatímco velké leukocyty mohou kontaminovat CTC populaci. Separace CTC na základě velikosti odděluje nádorové buňky větší než 8 μm. ScreenCell/ISET filtrace izoluje nádorové buňky podle velikosti a může být použita pro izolaci širokého spektra nádorových buněk nezávisle na protilátkách, včetně buněk non-epiteliálního původu [7].

MICROCHIP MIKROFLUIDNÍ TECHNOLOGIE

Nově byla představena CEE-CTC-chip – Cell Enrichment a extrační technologie (Biocept, San Diego, CA), která je schopna zachytit buňky nezávisle na jejich EpCAM a CK19 expresi, na rozdíl od CellSearch a AdnaTestu [8, 17]. Získané buňky mohou být hodnoceny morfologicky a immunohistochemicky pomocí FISH nebo různými molekulárními analýzami po extrakci DNA nebo RNA. CEE platforma využívá kokteil protilátek namířených proti různým epiteliálním antigenům na povrchu buněk epiteliálních a buněk mezenchymálních [21]. Pomocí této platformy Pecot et al. zjišťovali CK+ a/nebo CK- CTC u pacientů s karcinomem prsu, vaječníků nebo tlustého střeva [21].

IMUNOHISTOCHEMICKÁ ANALÝZA OBRAZU

Nová metoda „high definition“ CTC (HD-CTC) test identifikuje CTC bez použití povrchovýchproteinů, a to tak, že v rámci obohacené leukocytární frakce vizualizuje CTC v dostatečně vysokém rozlišení (HD), tak aby splňovaly diagnosticképožadavky kvality obrazu [13, 15]. Ve studii Phillips et al. byly CTC detekovány pomocí HD-CTC testu také u pacientek s ovariálním karcinomem [22]. Byla využita světelná mikroskopie ke kvantifikaci fyzikálních parametrů, jako je objem, hmotnost, plocha, a hustota CTC. Jde o novou techniku k posouzení heterogenity CTC [22, 23]. Navíc HD-CTC testem jsou detekovány vyšší počty CTC než pomocí CellSearch systému. HD-CTC test poukazuje na přítomnost CTC –shluků (CTC-clusters) u 88 % u pacientů s metastazujícím nádorovým onemocněním [15], takže je možné, že pro klinickou praxi bude mít v budoucnu detekce shluků větší prognostickou validitu.

CTC A JEJICH VÝZNAM V KLINICKÉ PRAXI

Detekce CTC může být potenciálně použita ke stanovení diagnózy, jako alternativa k invazivní biopsii pro včasnou detekci metastatického šíření nádoru a pro monitorování efektivity terapie u jednotlivých pacientů. Počty a vlastnosti CTC mohou být prognostickým faktorem pro přežití, nebo prediktivním faktorem odpovědi na terapii. Dlouhodobé monitorování CTC může poskytnout příležitost lépe posoudit dynamiku odpovědi na léčbu. Přítomnost CTC v krvi předchází změnu nálezu při zobrazovacích metodách a naznačuje, že CTC analýza může být senzitivnějším biomarkerem pro zhodnocení progrese onemocnění než zobrazovací metody [20].

Nepříznivá prognostická hodnota přítomnosti CTC je popsána u metastazujícího karcinomu prsu, metastazujícího karcinomu tlustého střeva a metastazujícího karcinomu prostaty.

Vysoká míra nesouladu v expresi receptorů u primárních nádorů a CTC naznačuje, že molekulární charakterizace CTC by mohla určit nový terapeutický cíl u pacientů s metastatickým onemocněním, v tomto konkrétním případě u karcinomu prsu, kde jde o expresi HER2 [10]. Existují také studie, týkající se propojení výskytu CTC a vzniku žilního tromboembolismu. Mego et al. zjistili, že u pacientů s ≥ 1 CTC byl výskyt trombózy čtyřikrát vyšší ve srovnání s pacienty bez CTC [16]. CTC jsou pravděpodobně zapojeny do aktivace koagulace prostřednictvím exprese a uvolněním tkáňových faktorů (TFS) [4, 5].

VÝZNAM CTC U KARCINOMU OVARIA

V tabulce 1 jsou uvedeny recentní studie týkající se různých metod používaných ke stanovení CTCs u karcinomu ovaria a hodnotící délku celkového přežití v měsících u pacientek, které byly na začátku terapeutického procesu CTC pozitivní a CTC negativní a rovněž progresion free interval u CTC pozitivních a negativních pacientek. Z výsledků uvedených studií vyplývá výraznější souvislost CTC negativity s prodlouženou délkou intervalu bez progrese. Rozdíly v měsících celkového přežití nejsou tak výrazné, ovšem i zde je patrný signifikantní rozdíl ve smyslu prodloužení celkového přežití u CTC negativních pacientek.

Jednou z řešených otázek bylo, zda je možno pomocí kvantifikace CTCs předpovědět délku, respektive zkracování intervalu přežití bez progrese (PFS) a celkové přežití (OS) u pacientek s recidivou pokročilého ovariálního karcinomu. Vícečetné analýzy ukazují, že vstupní hodnoty CA 125, rezistence či citlivost vůči cisplatině, největší průměr léze, počet nádorových lézí a grade tumoru korespondují s množstvím detekovaných CTCs. V případě zvýšeného počtu CTC je tedy prokázána závislost ve smyslu zkrácení PFS a OS intervalu [2, 25].

U ovariálního karcinomu se jako přesnější, spíše než jen počet CTC či pouhá detekce přítomnosti CTC, jeví sledování overexprese některých genů z krve. Obermayr et al. testovali expresi u 216 pacientek pomocí RT-qPCR. U dvou třetin byla identifikována zvýšená exprese genu cyklofilinu C (PPIC) a jen nízká exprese EpCAM. Přítomnost CTC na začátku léčby souvisí s přítomností ascitu, suboptimálním debulkingem a hladinou CA 125a HE-4, vyšší množství CTC v průběhu léčby bylo zjištěno častěji u pacientek vyššího věku a platina rezistentních pacientek. PPIC pozitivní CTC v průběhu terapie byly významně častěji zjištěny u platina rezistentních pacientek a jsou indikátorem horší odpovědi na první linii chemoterapie platinovými deriváty, nezávisle na klasických prognostických parametrech [18].

V další práci [26] se ověřovala souvislost cirkulujících endotelových progenitorových buněk (EPC) s nádorovou angiogenezí a růstem nádoru. Počet cirkulujících EPC byl stanovován pomocí průtokové cytometrie a soubor tvořilo 25 zdravých žen a 42 pacientek. EPC byly definovány současně expresí CD34 a receptorem cévního endoteliálního růstového faktoru (VEGFR2). Hladiny cirkulujících EPC byly významně zvýšeny u pacientů s karcinomem vaječníků a vykazují korelaci se stadiem nádoru a velikostí nádorového rezidua. Hladiny EPC u pacientek s karcinomem ovaria ve stadiu III a IV byly vyšší než u pacientek ve stadiu I a II nemoci. Po excizi nádoru hladina EPC rychle klesala. Při velikosti nádorového rezidua větší než 2 cm bylo sledováno výrazně vyšší množství EPC. Kromě toho vysoké množství cirkulujících EPC koreluje s délkou OS. Dále byla u pacientek s ovariálním karcinomem rovněž zjištěna over-exprese VEGFR2 a plazmatické hladiny VEGF a MMP-9.

Ukazuje se, že grade a histologický typ nádoru neovlivňuje detekci CTC. Byl zjištěn výrazně kratší disease free interval (DFS) při vyšším množství dia-gnostikovaných CTC a pozitiva CTC byla až v 75 % diagnostikována u stadií III–IV. Avšak větší množství CTC může odrážet pozdější stadium onemocnění a je spojeno s vyššími hodnotami CA 125 [9].

Ve snaze co nejpřesněji kvantifikovat CTCs byly syntetizovány fluorescenční konjugáty dvou vysoce pro tumor afinních specifických ligandů (folátu AlexaFluor 488 a FITC), které vážou nádorové buňky více než 20krát účinněji než fluorescenční protilátky. Využití tumor-specifických fluorescenčních ligandů CTC v periferní krvi může poskytnout jednoduchou, přesnou a citlivou metodu pro stanovení počtu nádorových buněk cirkulujících v krevním řečišti [11].

ZÁVĚR

V posledních letech mnoho výzkumných pracovišť vynakládá nemalé úsilí k pochopení role CTC u pacientů s nádorovým mestastazujícím onemocněním karcinomu ovaria. Přes četné dílčí úspěchy zůstává řada otázek, týkajících se zlepšení terapie onkologických pacientů včetně přípravy na CTC selektivně orientovaných chemoterapeutik, nezodpovězena. K tomu bude nutné pochopení celého procesu metastatické kaskády. CTC jsou generovány v EMT, procesem charakterizovaným down-regulací epiteliálních markerů a up-regulací mezenchymálních markerů. Tyto změny podporují nádorové buňky ke zvýšené motilitě, invazivitě a odolnosti vůči terapii. CTC představují populaci nádorových buněk šířených do vzdálených orgánů s možností následného vzniku mikro- i makrometastatických ložisek. Část nádorových buněk z primárního tumoru a/nebo CTC má vlastnosti kmenových buněk (CSCs). Populace nádorových kmenových buněk má schopnost vlastní obnovy a svědčí o populaci na léčbu rezistentní s horší prognózou. CTC/CSCS mají obrovský potenciál v diagnostice, stanovení prognózy, monitoringu onemocnění, terapeutického účinku a riziku relapsu, a proto je nutné pokračovat v rozvoji a snaze o rozšíření testace CTC na co největší počet pracovišť zabývajících se diagnostikou a terapií gynekologických malignit a zařazení mezi standardní vyšetření u pacientek s karcinomem ovaria, ať už ve stadiu diagnostiky, tak ve stadiu neo-/aud-juvantní terapie.

Podpořeno z výzkumného projektu P 27/2012 Univerzity Karlovy, 3. lékařské fakulty v Praze. 

MUDr. Jiří Pavlásek

Gynekologicko-porodnická klinika

3. LF UK a FNKV

Šrobárova 50

100 34 Praha 10

e-mail: jiri-pavlasek@seznam.cz