PL-1

Monoklonální imunoglobuliny (paraproteiny)

Monoclonal immunoglobulins (paraproteins)

Tichý M.

Ústav klinické biochemie a diagnostiky LF UK a FN v Hradci Králové

tichy@fnhk.cz

Monoklonální gamapatie jsou heterogenní skupinou onemocnění charakterizovaných proliferací diferencovaných B-lymfocytů, jejichž klon produkuje elektroforeticky a imunologicky homogenní protein – monoklonální imunoglobulin, paraprotein. Ten se může sestávat z intaktní imunoglobulinové molekuly, nebo jen z lehkých řetězců a/nebo (mnohem vzácněji) jen z těžkých řetězců imunoglobulinů. U všech paraproteinémií je nezbytná analýza séra a moče. Základní metodou zůstává kvalitní elektroforéza bílkovin séra a moče (kapilární elektroforéza, elektroforéza na agaróze). Imunofixační elektroforéza je nezbytná pro určení imunoglobulinové třídy paraproteinu a pro určení antigenního typu lehkých řetězců. V posledních letech je v diagnostice monoklonálních gamapatií (MG) stále více využíváno stanovení volných lehkých řetězců (FLC). Největší význam má stanovení FLC u těch nemocných, kteří nemají klasickými metodami měřitelný paraprotein v séru a/nebo v moči, tzv. nesekreční myelom, dále u AL amyloidózy a mnohočetného myelomu s FLC (Bence Jones Multiple Myeloma). Toto vyšetření se také prosadilo do hodnocení úspěšnosti léčebné odpovědi a do nové prognostické klasifikace MG.

Narůstající význam stanovení FLC vedl k provedení srovnávací mezilaboratorní studie v rámci procesu standardizace, který organizuje Česká myelomová skupina (CMG) s ČSKB, a k zařazení stanovení FLC do externí kontroly kvality SEKK, cyklus „Gamapatie“, jako nepovinné stanovení od r. 2011.

Jako velmi perspektivní se jeví analýza párů těžkých/lehkých řetězců imunoglobulinů (HLC) umožňující průkaz izotypové suprese alternativního páru HLC.

Za posledních 10 let došlo k zásadním změnám v diagnostice MG. To je také jedním z rozhodujících faktorů, který spolu s novými léky a léčebnými postupy výrazně prodlužuje život a jeho kvalitu především u nemocných mnohočetným myelomem.

B-1-1

Hyperkalcemie v dětském věku

Hypercalcemia in children

Průša R.

Ústav lékařské chemie a klinické biochemie, 2. LF UK a FN Motol, Praha

richard.prusa@lfmotol.cuni.cz

Fyziologická kalcemie je udržována třemi hlavními hormony: parathormonem, kalcitoninem a 1,25-dihydroxyvitaminem D, které působí primárně v kostech, ledvinách a v tenkém střevě. Hyperkalcemie má mnoho různých příčin, hyperkalcemické krize patří k velmi závažným metabolickým stavům. Příčiny hyperkalcemie můžeme rozdělit do šesti skupin:

1. z nadbytku parathormonu (např. primární hyperparathyreóza včetně mutací v calcium sensing receptoru),
2. z nadbytku vitaminu D (např. předávkování, nadměrná tvorba aktivního metabolitu makrofágy u sarkoidózy a granulomatozních chorob, nekrózy podkožního tuku, snížená degradace aktivního metabolitu u pacientů s mutací v CYP24A1 genu – idio-patická infantilní hyperkalcemie),
3. z nadměrného příjmu vápníku,
4. z nadměrné renální reabsorpce vápníku (např. po podání thiazidových diuretik, familiární benigní hypokalciurická hyperkalcemie),
5. z nadměrného uvolnění vápníku z kostí (např. malignity, hypervitaminóza A, imobilizace),
6. z různých příčin (Williamsův syndrom, hypofosfatázie, fáze zotavení po rabdomyolýze, Jansenova metafyzeální chondrodysplázie, adrenální insuficience).

Imobilizace a hypervitaminóza D jsou nejčastější příčiny hyperkalcemie u dětí. Jako příklad je možno uvést kazuistiku kojence s hyperkalcemií 5,8 mmol/l, hyperkalciurií 8,0 mmol Ca/mmol kreatininu, 25-hydroxyvitaminem D přes 600 nmol/l a suprimovaným parathormonem (0,41 pmol/l), u kterého spočívala příčina hyperkalcemie v přítomnosti homozygotní mutace R396W v genu CYP24A1 při normální suplementaci vitaminem D.

B-1-2

Syndrom neprospívání ve stáří - křehký pacient

Failure to thrive syndrome in old age - a fragile patient

Jurašková B., Holmerová I., Kalvach Z.

III. interní gerontometabolická klinika FN v HK, Lékařská fakulta v HK, UK v Praze, subkatedra geriatrie; FHS UK v Praze, Gerontocentrum Praha; geriatrická ambulance Praha

juraskovabozena@seznam.cz

Stárnutí je vlastností živého organismu, v pojetí člověka je však stáří mnohdy chápáno jako mizení, vyhasnutí, zánik. Je jistě rozdíl v tom, jak vidí a definují stárnoucího člověka ostatní věkové skupiny, a tím, jak on sám se cítí a vnímá. Všichni, kdo se zajímáme o tuto skupinu pacientů a hlavně o ni pečujeme, víme, že vymezení geriatrického pacienta formálně nad 65 let nesouhlasí mnohdy s „biologickým věkem“. Cílem příspěvku je seznámení s novým pojetím geriatrického pacienta. Geriatrický pacient může být definován jako člověk vyššího věku, u něhož involuční a chorobné změny ovlivňují natolik funkční stav a schopnosti, že dochází ke zhoršení adaptability, regulačních mechanismů, toleranci k zátěži. Předmětem oboru geriatrie se tak stává senior ne dle věkových kriterií, ale dle jeho tzv. „křehkosti“. Jde vlastně o definování některých funkčních charakteristik geriatrického pacienta, které jsou významné z důvodů závažnosti či častosti postižení. Proces stárnutí je ovlivňován samotnými involučními procesy, dále pak řadou rizikových faktorů jako malnutrice, dehydratace, polypragmazie, porucha kognitivních funkcí apod. Tyto faktory jsou příčinou tzv. neprospívání seniorů. Centrem pozornosti geriatrie je zlepšení soběstačnosti seniora. Je dána stavem funkční zdatnosti pacienta a náročností prostředí, v němž žije. Udržována či obnovena může být zlepšením jeho zdatnosti a výkonnosti. Jedná se o významné aspekty z hlediska kvality života ve stáří i z hlediska koordinace péče. Mezioborová spolupráce z tohoto hlediska se tak stává vhodným prostředkem.

B-1-3

Zvláštnosti interpretace laboratorních nálezů ve stáří

Peculiarities in the interpretation of laboratory parameters in elderly patients

Zadák Z., Hyšpler R., Tichá A.

Centrum pro výzkum a vývoj Fakultní nemocnice Hradec Králové

zdenek.zadak@fnhk.cz

V klinické praxi je nutné brát v úvahu při interpretaci biochemických nálezů věkový faktor. Dosavadní studie ukazují, že se stoupajícím věkem se snižuje schopnost udržet homeostázu a zvyšuje se biologická variabilita. Širokým způsobem se uplatňuje i fenomén malnutrice, který je pravidelným nálezem u osob nad 80 let bez ohledu na socio-ekonomický status. Malnutrice v oblasti proteinové rovnováhy má za následek sníženou dostupnost aminokyselin pro syntézu reaktantů akutní fáze a ty nedosahují hodnot potřebných pro obranu proti infekci. Velmi zásadním parametrem, který je nutné ve stáří pečlivě monitorovat, jsou plazmatické proteiny (albumin, transferin a prealbumin), které jsou naprosto nezbytné pro transport některých důležitých endogenních metabolitů, a jejichž pokles má za následek také snížení kompartmentu léků vázaných na plazmatické proteiny. Důsledkem pak může být výrazná změna farmakokinetiky i běžných léků, a tím snížení jejich účinnosti. Pokles albuminu je spojen s jeho sníženou syntézou při malnutrici, avšak na druhé straně jeho plazmatické hodnoty jsou někdy obtížně interpretovatelné vzhledem k chronické hypohydrataci starých jedinců. Velmi dobře je znám pokles renálních funkcí v závislosti na věku. Ve stáří je méně spolehlivé vztahování dávek léků k hodnotám kreatininu, podobně jako využití kreatininu ke standardizaci některých metod užívaných v klinické biochemii a endokrinologii. S věkem dále stoupá prevalence onemocnění, která se projevují poruchami rovnováhy draslíku a sodíku.

Závěr: Velká část rutinních biochemických parametrů má ve stáří široký referenční rozsah ve srovnání s mladými jedinci a interpretace je obtížná vzhledem k vlivu polymorbidity a polyfarmacie.

Podpořeno projektem MZ ČR-RVO (FNHK, 00179906).

B-2-1

Správna vedecká prax - nástroj najmä pre prevenciu neetického správania vo vede a výskume

Good Scientific Practice – tool mainly for the prevention of research misconduct

Ftáčniková S.

Agentúra na podporu výskumu a vývoja, Bratislava

sona. ftacnikova@apvv. sk

Príspevok sa venuje definíciám a pojmom súvisiacimi s vedeckými nečestnosťami, podvodmi, pochybnými vedeckými praktikami (PVP) ako aj so správnou vedeckou praxou. Opisuje základné definície „fabrikácie“, „falzifikácie“ a „plagiátorstva“ (FFP). Podrobne analyzuje frekvencie a príčiny výskytu FFP a PVP, opisuje závažnosť vedeckých podvodov a nečestností pre vedeckú komunitu, pre vedu ako takú, ako aj pre celú spoločnosť. Podrobnejšie sa venuje pochybným praktikám v súvislosti s autorstvom a iným typom vedeckých nečestností spojených s publikačnou činnosťou. Špeciálna pozornosť je venované analýze počtu retrakcií a ich dôvodov v biomedicínskych časopisoch indexovaných v Pubmed.

B-2-2

Interpretace výsledků ELFO proteinů laboratorním lékařem. Přidaná hodnota ve prospěch pacienta

Interpretation of protein electrophoresis by physician and its benefits for patient

Franěk T., Friedecký B.,

Ústav lékařské chemie a klinické biochemie 2. LF a FN Motol, SEKK s. r. o. Pardubice

tomas.franek@fnmotol.cz

Úvod: Elektroforéza sérových proteinů patří stále mezi často používaná vyšetření. Vzhledem k různým technikám jejího zpracování v jednotlivých laboratořích a přístupu k postanalytickému hodnocení se však výtěžnost tohoto vyšetření velmi různí. Proto tato práce má poskytnout komplexní náhled na indikace, provedení a postanalytický výstup k tomuto vyšetření.

Metoda: Jednotlivá doporučení se budou týkat hlavních indikací k vyšetření; věnovat se budou diferenciální diagnostice hyperproteinemie, kvantifikaci jednotlivých frakcí elektroforeogramu, správnému názvosloví při zjištění elektroforetických abnormalit a jejich výstupu směrem k indikujícímu lékaři, dále kvantifikaci monoklonálních pruhů v běžných i méně běžných polohách s následnou možností jejich okomentování ve výsledkovém listě.

Závěr: Doporučení k jednotné indikaci, provedení a interpretaci elektroforézy sérových proteinů by mělo pomoci ke sjednocení vydávaných výsledků, zlepšit vzájemnou porovnatelnost mezi laboratořemi, minimalizovat možné chyby v postanalytické fázi a s ohledem na bezpečnost pacienta zvýšit maximální výtěžnost při indikaci tohoto vyšetření.

B-2-3

Komerční in vitro diagnostika - prospěch i riziko pacienta

In vitro diagnostics - benefit and risk for patients

Friedecký B,

SEKK s. r. o., Pardubice

friedecky@sekk.cz

Směrnice pro výrobu in vitro diagnostik (IVD) a jejich uplatnění na trhu popisují závazné podmínky pro balení, značení, identifikaci, ekologickou ochranu a bezpečnost zacházení s nimi, ale neposkytují záruku kvality a úspěšnosti pro použití při péči o pacienta. Takové záruky jsou principem laboratorní medicíny založené na důkazech (EBLM) a medicíny, striktně orientované na individuálního pacienta (personalizované medicíny). Zásady EB(L)M jsou pověřenými experty shrnovány do forem národních nebo lépe mezinárodních doporučení (guidelines). Měly by být základní zárukou dostatečně kvalitní diagnostiky a bezpečnosti péče o pacienty. Platí, že kvalitní závěry o diagnostice a léčbě lze získat pouze vložením (použitím) kvalitních vstupních dat. Jde o obdobu jevu, známého z preanalytické fáze, že kvalitní analytika nutně předpokládá kvalitní vzorek analyzovaného materiálu. Ani dokonale sofistikované a detailně validované doporučení nemůže fungovat bez kvalitních analytických dat, na nichž je založeno. U některých doporučení jsou nezbytné analytické požadavky jejich součástí, avšak často nedostatečně formulované, existuje však řada doporučení (i k takovým závažným chorobám jako jsou ledvinové, kardiální nebo tumorové), kde se analytickou stránkou problémů ke škodě a k riziku pacienta autoři nezabývají. Stejně závažnou situaci lze registrovat i u péče o kriticky nemocné pacienty při aplikaci metod POCT. Nesmírně závažným je problém nedostatečné standardizace, anebo aspoň harmonizace metod, která by byla schopná redukovat systematické diference na tolerovatelné míry. I u metod již řadu let standardizovaných a považovaných za naprosto neproblematické, lze pozorovat diference, dosahující 10 – 20 % mezi šaržemi nebo při kalibračních korekcích. Programy EHK na řešení těchto problémů často rezignují s odvoláním na údajnou nekomutabilitu (4 – 40 %)?!

B-2-4

Brain-to brain loop a bezpečnost pacienta

Brain-to brain loop and patient safety

Jabor A., Franeková J.

Pracoviště laboratorních metod, IKEM, Praha

anja@ikem.cz

Úvod: Brain-to-brain loop charakterizuje celkový proces vyšetření. Jeho jednotlivé části jsou spojeny s určitým výskytem chyb, které ohrožují bezpečnost pa-cienta. Bezpečnost pacienta je širší koncept související s kulturou bezpečnosti zdravotnických systémů.

Definice: Bezpečnost pacienta je (podle WHO) definována jako redukce rizika zbytečného poškození spojeného s poskytováním zdravotní péče na akceptovatelné minimum. Akceptovatelné minimum je skupinovým názorem na současné znalosti, dostupné zdroje a kontext, ve kterém byla péče poskytnuta s uvážením rizika nezahájení léčby nebo jiné léčby. Bezpečnost pacienta je podmnožinou kvality zdravotní péče. Guidelines založené na principech EBM jsou definovány jako konsensuální přístupy v rizikových situacích s cílem redukovat variabilitu praxe a zlepšit výstupy péče. Minimalizace chyb je proces prevence selhání diagnostických a léčebných plánů, aby mohly být terapeutické cíle dosaženy v zamýšleném rozsahu pomocí vhodných a korektních postupů. Kvalita je taková úroveň poskytování zdravotní péče, ke které se snaží zdravotní systémy pro jednotlivce a populace zvýšit pravděpodobnost požadovaného stavu zdraví, která je konsistentní se současnou úrovní odborných znalostí. Řízení kvality je proces sestávající z měření výkonnosti, porovnávání výkonnosti proti cílům a provedení vhodných opatření v situacích, kdy změřená výkonnost nevyhovuje předem definovaným cílům.

Závěry: Systém charakterizovaný tzv. kulturou bezpečnosti je založený na odpovědnosti, nezávislosti na finančních a provozních cílech, otevřenosti s efektivními komunikačními kanály, zpětnovazebných mechanismech analýzy chyb a vhodných strukturách a řídicích mechanismech s odpovídajícími prostředky. Laboratoře jsou součástí zdravotní péče a znalosti principů kultury bezpečnosti se týkají i klinických laboratoří.

PL-2

DNA testing of maternal plasma to screen for Down syndrome and other aneuploidies

Palomaki, G. E.

Department of Pathology and Laboratory Medicine, Women & Infants Hospital, Providence, Rhode Island, USA

The discovery of cell free DNA of fetal origin in the maternal circulation in 1997 led fourteen years later to the introduction of the first clinical screening test for Down syndrome based on next generation sequencing. Since that time, at least seven commercial companies world-wide have launched laboratory developed tests for clinical use, resulting in an unprecedented rate of dissemination of a screening technology, amidst fierce competition. This presentation will provide a review of the published sensitivity and specificity estimates for the common autosomal trisomies along with other important test characteristics such as failure rates, contraindications (e. g., twins, egg donation), and turn around times. Similarities and differences among methods will be presented, and professional and regulatory oversight will be summarized. Since the test can be offered in both a high risk and general population setting, the impact of prevalence on the predictive values will be examined along with perceived and real barriers to offering this testing as a first line screen. Lastly, additio-nal chromosome disorders that could be identified in the near future will be reviewed.

B-3-1

Prenatální screening ve světě

Prenatal screening in the world

Zima T., Springer D.

Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a VFN Praha

zimatom@cesnet.cz

Prenatální screening slouží k odhalení různých onemocnění či poškození plodu v průběhu těhotenství s cílem bezpečného porodu a narození zdravého plodu. Mezi pravidelná vyšetření v těhotenství patří vyhledávání gestačního diabetes mellitus, inkompatibility v Rh-faktoru a některých významných chromozomálních aberací, zejména Downova syndromu (DS). V Evropě existuje, nejen v různých zemích, ale i v různých regionech, odlišný přístup ke screeningu DS. Tento přístup je dán odlišnými možnostmi zdravotních systémů, právními předpisy, ale zejména kulturními a náboženskými odlišnostmi. V deseti z 18 zemí Evropy mají národní politiku pro screening Downova syndromu. 68 % (0 – 95 %) případů DS je diagnostikováno prenatálně a u 88 % z nich je těhotenství ukončeno. Ve Velké Británii platí doporučení odborné společnosti pro neinvazivní testování pro všechny těhotné s velmi přesnými požadavky na screeningové testování: detekční limit více než 90 % s falešnou pozitivitou menší než 2 %. Všeobecně je ve světě v současnéí době preferován kombinovaný test – stanovení biochemických markerů v 1. trimestru těhotenství spolu s ultrazvukovým vyšetřením plodu - měření nuchální translucence (NT). Doporučení v USA preferuje integrovaný (spojení výsledků z 1. a 2. trimestru), věkově závislý, biochemický screening a měření NT pro detekci aneuploidií. V Kanadě je nabízen prenatální screening v různých variantách a screeningová centra jsou každoročně auditována. V Izraeli je prenatální testování povoleno a podporováno zákony. Od roku 1979 jsou sledovány počty dětí narozených s DS, od roku 1978 je nabízena možnost provedení amniocentézy u žen starších 37 let resp. 35 let od roku 1993. Doporučení v Austrálii a na Novém Zélandu zahrnují screening hlavních aneuploidií různými přístupy, avšak integrovaný test není doporučován.

B-3-2

Přehled současných možností provádění prenatálního screeningu

Current options of prenatal screening

Loucký J.

Imalab s. r. o, Zlín

loucky@imalab.cz

Prenatální screening nejčastějších vrozených vývojových vad je v současné době v mnoha zemích světa pevnou součástí péče o těhotnou ženu a nenarozený plod. Současný prenatální screening kombinuje možnosti biochemického vyšetřování krve matky a ultrazvukových měření prováděných u plodu. Prenatální screening se provádí buď v I. trimestru těhotenství, II. trimestru těhotenství, nebo se integrují výsledky z obou trimestrů. Biochemické testování je prováděno jak v I. trimestru, tak i ve II. trimestru těhotenství, ale měření ultrazvukových parametrů, které jsou rutinně používány při hodnocení rizik, se v současnosti soustřeďuje do I. trimestru. Kvalitní provádění screeningových testů může výrazně ovlivnit počet prováděných invazivních zákroků a tedy hraje velmi významnou úlohu, jak z pohledu možného rizika pro plod, tak samozřejmě z pohledu ekonomického. V současné době existuje několik typů screeningových strategií, jejichž společnou vlastností je snaha o docílení nejvyšší možné senzitivity a co možná nejnižší falešné pozitivity, vždy s přihlédnutím ke konkrétním možnostem dostupnosti jednotlivých, využívaných vyšetření. Kromě klasických screeningových testů, jako je kombinovaný test v I. trimestru, integrovaný test v obou trimestrech, nebo jejich kontingenční či sekvenční varianty, se v posledních několika měsících rozvíjejí také možnosti přímé genetické analýzy plodu prostřednictvím fragmentů volných fetálních nukleových kyselin obsažených v krvi matky. Tato vyšetření nejsou v současné době považována za diagnostické testy, ale za způsob velmi progresivního screeningu, jehož parametry jsou výrazně lepší než u běžných screeningových metod.

B-3-3

Ultrazvukové markery při prenatálním screeningu vrozených anomálií plodu

Ultrasound markers in prenatal screening of foetal birth defects

Polák P.

Centrum prenatální diagnostiky U. S. G. POL s. r. o. Olomouc

info@usgpol.cz

Ultrazvukové vyšetření plodu představuje významnou součást algoritmu prenatálních screeningových programů. Sdělení se věnuje přehledu prvotrimestrálních ultrazvukovým markerů ve vztahu k prenatální detekci Downova syndromu, ale i jiných patologií. Měření tzv. šíjové translucence v rámci kombinovaného testu umožňuje dosáhnout 85% senzitivity při záchytu trizomie 21. chromozómu s 5% falešnou pozitivitou. Pokud přidáme do screeningového protokolu další markery - měření nosní kůstky, srdeční frekvence, obličejového úhlu - a použijeme tzv. dopplerovská vyšetření - zobrazení zpětného krevního toku přes trojcípou chlopeň a pulzní vlnu venózního duktu - pak dosáhneme zvýšení senzitivity na 95 % a snížení falešné pozitivity na 2,5 %. Ultrazvukové markery musí vyšetřovat specialista s patřičnou erudicí. Vyšetření je nutno provést na ultrazvukovém přístroji vyšší třídy. Popsané ultrazvukové markery jsou významné také pro prenatální záchyt srdečních anomálií, skeletálních dysplázií a určitých genetických syndromů. Možnosti ultrazvukového screeningu prvního trimestru se nadále rozšiřují. V současné době máme možnost určit riziko spiny bifidy, obličejových anomálií, renálních obstrukčích vad. Důležitou součástí prvotrimestrálního screeningu je predikce rizika preeklampsie.

B-3-4

Klinické výstupy z kombinovaného biochemicko-ultrazvukového vyšetření plodu v I. trimestru gravidity

Clinical outputs of fetus‘ biochemical-ultrasosographical investigation in the 1st trimester of pregnancy

Šantavý J., Dhaifalah I.

Ústav lékařské genetiky a fetální medicíny Fakultní nemocnice Olomouc

jiri. santavy@fnol.cz

Přelomem v péči o plod byl poznatek, že některé bílkoviny např. alfa-1-fetoprotein a jiné látky jako HCG a estriol v mateřském oběhu mohou svými hladinami signalizovat jeho patologický stav. Postupně docházelo k přesunu vyšetření z II. do I. trimestru, výhodnějšího z hlediska zdravotního, finančního, ale hlavně etického. Kombinací anamnézy těhotné, biochemických a biofyzikálních vyšetření lze stanovit konkrétní riziko spektra pozdějších těhotenských problémů, jakými jsou chromozomální aberace, preeklampsie, těhotenské cukrovky, předčasné porody, samovolné potraty, neprospívání plodu a případně makrosomie plodu. Kombinací věku matky, tloušťkou šíjové translucence a hodnotami sérového – free β hCG a PAPP-A můžeme identifikovat 90 % plodů s aneuploidií. Jako perspektivní se pro včasné posouzení růstové charakteristiky plodu jeví nový biochemický marker – placentární růstový faktor, schopný ji predikovat v období I. trim. gravidity. Předčasný porod je hlavní příčinou perinatální smrti a postižení novorozence. Jeho riziko je určeno algoritmem kombinujícím charakteristiky matky a její porodnickou anamnézu. Apriorní riziko může být upraveno změřením délky cervixu. Screening preeklampsie měřením průměrného arteriálního tlaku a měřením Dopplerovského průtoku v arteria uterina a biochemickými testy v 11. až 13. týdnu může identifikovat okolo 90 % těhotných. GDM je spojen se zvýšeným mateřským a perinatálním rizikem krátkodobých a dlouhodobých komplikací v těhotenství. Algoritmus kombinuje parametry matky a hladinu adiponecetinu v mateřském séru. Tento pohlavní hormon může odhalit 75 % těhotných s rizikem vzniku GDM.

B-3-5

Štítná žláza v těhotenství

Thyroid gland during pregnancy

Springer D., Límanová Z.

Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky Všeobecná fakultní nemocnice a 1. LF UK Praha; 3. interní klinika VFN a 1. LF UK Praha

springer@vfn.cz

Normální funkce štítné žlázy zajišťuje správný průběh těhotenství a dostatečná hladina tyroxinu je nezbytná pro zdravý vývoj plodu. Poruchy funkce štítné žlázy jsou u žen v produktivním věku relativně časté, a proto se vyšetřování funkce štítné žlázy v těhotenství v posledních letech dostalo do centra pozornosti mnoha světových odborníků, kteří se ve formě doporučení pokouší sjednotit postoj k této problematice. Zásadním bodem sporu je, zda vyšetřovat plošně nebo pouze u rizikových skupin těhotných. Doporučení České endokrinologické společnosti a České společnosti klinické biochemie (2012) se přiklání k plošnému vyšetřování a to TSH, FT4 a anti -TPO protilátek. V Evropě endokrinologové provádí screening poruch štítné žlázy v těhotenství asi v 78 %, a to ve stejném poměru screening plošný i u rizikových skupin, jen asi 17 % respondentů provádí vyšetřování nesystematické, většinou u vysoce rizikových skupin těhotných. V České republice byla provedena pilotní studie vyšetřování štítné žlázy u asymptomatických těhotných v 1. trimestru těhotenství, která navázala na výsledky předchozích výsledků některých pracovišť, která se touto problematikou zabývala. Všechny tyto práce i pilotní projekt odhalily přibližně 2,5 % těhotných s hypotyreózou a asi 12 % těhotných s pozitivními anti-TPO protilátkami. U žen pozitivitou protilátek se může v těhotenství rozvinout některá z poruch štítné žlázy a zvyšuje se riziko výskytu poporodní tyreoiditidy. Jejich přítomnost může být i bez poruchy funkce štítné žlázy asociována s neplodností, opakovaným potrácením i selháním metod asistované reprodukce. Vyšetřování štítné žlázy v těhotenství je v naší republice obecně doporučováno, ale obvykle významně závislé na ošetřujícím gynekologovi a jeho osvícenosti.

B-3-6

Prenatální diagnostika vrozených chromozomových aberací v ČR

Prenatal diagnostics of the chromosomal aberration in the Czech Republic

Gregor V., Šípek A.

Oddělení lékařské genetiky, Thomayerova nemocnice, Praha

vladimir.gregor@ftn.cz

Úvod: Prenatální diagnostika vrozených chromozomových aberací se v ČR za uplynulých dvacet let významně změnila. Narostl počet výkonů prenatální diagnostiky, a to jak v absolutních, tak v relativních počtech. Zárověň se změnilo i spektrum používaných screeningových metod a díky tomu i metod prenatální diagnostiky. Tyto změny vedly ke zvýšení efektivity prenatální diagnostiky vrozených chromozomových aberací.

Metodika: V naší práci jde o retrospektivní analýzu dat o úspěšnosti prenatální diagnostiky vrozených chromozomových aberací v ČR v období 1993 - 2012. Analyzovali jsme incidence sledovaných diagnóz vrozených chromozomových aberací, prenatálně a postnatálně diagnostikovaných.

Výsledky: Nejčastěji prenatálně zachycovanými vadami jsou v současné době chromozomové aberace, z těch hlavně Downův syndrom (DS). Od roku 1993 se zvyšuje incidence prenatálně diagnostikovaných a předčasně ukončených případů DS na úkor případů zaznamenaných u narozených dětí. V prvních letech sledovaného období se procento prenatální diagnostiky DS pohybovalo pod 40 %. V dalších letech se průměrné procento záchytu zvyšovalo až nad 60 %. Od roku 2006 se úspěšnost prenatální diagnostiky DS opět zvyšuje, až nad 80 %. V případě Edwardsova a Patauova syndromu se také úspěšnost prenatální diagnostiky ve sledovaném období výrazně zvyšuje.

Závěr: Stoupající záchyt DS v posledních pěti letech je způsoben jednak kvalitativní změnou indikačního kritéria (screening v I. trimestru), jednak kvantitativního poklesu celkově provedené invazivní prenatání diagnostiky při stoupajícím podílu metody odběru choriových klků. Významně se snižuje i týden těhotenství při diagnostice vrozených vad.

B-4-1

Moderní separační metody ve spojení s pokročilými technikami hmotnostní spektrometrie v klinické laboratoři

Modern separation methods coupled with advanced mass spectrometry techniques in clinical laboratory

Friedecký D., Adam T.

Laboratoř dědičných metabolických poruch, Oddělení klinické biochemie, Fakultní nemocnice Olomouc; Laboratoř metabolomiky, Ústav molekulární a translační medicíny, Univerzita Palackého v Olomouci

david@friedecky.cz

Hmotnostní spektrometrie v poslední dekádě zaznamenala výrazný posun v rychlosti, citlivosti, robustnosti či objevech nových technologií. Díky tomuto se stává hmotnostní spektrometrie rutinním nástrojem v klinických laboratořích. V příspěvku jsou prezentovány separační metody ve spojení s hmotnostní spektrometrií pro oblasti terapeutického monitorování léků a analýzu diagnosticky významných markerů onemocnění. Jsou zmíněny trendy posledních let v chromatografii a vysoko-rozlišujících hmotnostních spektrometrech, čímž se cena a rychlost stává konkurenceschopnou imunochemickým metodám. Další oblastí je přímá analýza vzorků bez separačního kroku za pomocí ionizace elektrosprejem nebo ambientními technikami za účelem screeningu.

Práce je podpořena granty IGA MZCR NT12218 a LF UP 2013-016. Institucionální část projektu (Ústav molekulární a translační medicíny) byl podpořen Operačním programem výzkumu a vývoje pro inovace (projekt CZ. 1. 05/2. 1. 00/01. 0030).

B-4-2

Multiplexová imunoanalýza a její využití

Multiplex immunoanalysis

Vrzalová J., Topolčan O., Fuchsová R., Karliková M.

Laboratoř imunochemické diagnostiky, Oddělení nukleární medicíny, Fakultní nemocnice Plzeň

vrzalovaj@fnplzen.cz

Multiplexová imunoanalýza je moderní analytický postup umožňující stanovení většího množství analytů v jediném alikvotu vzorku o objemu v řádu desítek mikrolitrů. V naší laboratoři používáme tzv. xMAP (multiple analyte profiling) technologii, která je v současné době celosvětově rozšířená a využívaná pro klinické výzkumy biomarkerů v oblastech biochemie, imunologie, mikrobiologie, hematologie, genetice atd., pro některé aplikace jako například neonatální screening je metodika již užívána rutinně.

Principem multiplexové analýzy je reakce (např. vazba antigenu na protilátku) na povrchu barevně kódovaných mikrokuliček. Množství navázané látky je stanoveno díky reporterové fluorescenční molekule (např. druhá protilátka). Měření probíhá na speciálním průtokovém cytometru Luminex 100 IS, který určuje jedním laserem spektrální kód kuličky (druh analytu) a druhým laserem množství reporterové molekuly (kvantitu analytu) nebo v případě nejnovější magnetické varianty kuliček na přístroji MagPix vybaveným CCD kamerou pro rozlišení spektrálních kódů. V případě imunoanalýzy jsou koncentrace jednotlivých analytů vypočteny na základě standardních kalibračních křivek. Pro analýzu lze použít různé biologické materiály – sérum, plazma, exsudáty, nitrooční tekutinu, supernatanty buněčných kultur nebo lyzáty buněk. V prezentaci ukážeme možnosti využití v klinickém i základním výzkumu z našich zkušeností a poukážeme na problematiku výběru materiálu, preanalytických pravidel a interpretace multiplexových výsledků v budoucí rutinní klinické praxi.

B-4-3

Analýza vzorků biologického materiálu pomocí surface plasmon resonance imaging

Analysis samples of biological material using surface plasmon resonance imaging

Šigutová R., Lesňák M., Šafarčík K., Švagera Z.

Ústav laboratorní diagnostiky, Oddělení klinické biochemie, Fakultní nemocnice Ostrava; Katedra biomedicínských oborů, Lékařská Fakulta Ostravské univerzity v Ostravě; Institut Fyziky, Vysoká škola báňská - Technická univerzita Ostrava

radka.sigutova@fno.cz

Úvod: Rezonanční excitace povrchových plazmonů (SPR, Surface Plasmon Resonance) patří mezi jednu z nejrozvinutějších optických detekčních technik v oblasti biosenzorů. V případě přiřazení zobrazovacího prvku se jedná o Surface Plasmon Resonance imaging (SPRi). SPRi umožňuje monitorovat interakce biomolekul v reálném čase a detekovat látky bez nutnosti značení jednoho z reaktantů. V reálném čase lze sledovat přímo zobrazení povrchu biočipu při interakcích biomolekul. Lze paralelně měřit několik desítek různých interakcí.

Cíle studie: Cílem bylo testovat metodu SPRi a připravit čipy pro stanovení vybraných biochemických markerů.

Metody: Pro testování metody bylo využito stanovení ovalbuminu o různých koncentracích od 0,001 do 5 mg/l, každý vzorek byl měřen 10x. Dále byl připraven a otestován čip pro stanovení albuminu v moči v koncentračním rozsahu od 1 do 500 mg/l a cystatinu C v séru od 0,01 do 10 mg/l.

Výsledky: Při stanovení velmi nízkých koncentrací ovalbuminu byla navržena amplifikace signálu vazbou sekundární biotinylované protilátky, na níž byl vázán streptavidin. Variační koeficient byl v celém koncentračním rozsahu pod 8 %. Při stanovení vybraných biochemických markerů byla nutná stabilizace čipů pomocí stabilizačního roztoku Stabilguard.

Závěr: Dle získaných dat lze usoudit, že uvedené koncentrace analytů jsou s dostatečnou přesností měřitelné. Bude však nutné provést analýzy na větším souboru vzorků.

Práce vznikla za přispění Institucionální podpory Ministerstva zdravotnictví ČR č. 1 RVO-FNOs/2012.

B-4-4

Vzácné genetické varianty u Mendelovských a komplexních onemocnění

Rare genetic variants in Mendelian and complex diseases

Kmoch S,

Ústav dědičných metabolických poruch, 1. LF UK

skmoch@lf1.cuni.cz

Dostupnost nových technik analýzy nukleových kyselin (genomové sekvenování, DNA čipy) a stále se zvyšující znalost genetické variability člověka (1000 genomů, ESV, dbSNP, DGV) spolu s výkonnými bioinformatickými nástroji zásadně mění strategii biomedicínského výzkumu, metodologii studia molekulární podstaty všech lidských onemocnění a rozsah a úroveň diagnosticko-preventivních postupů u vzácných i populačně častých onemocnění. Obor se postupně přesouvá od „klasických“ vazebných a asociačních studií k detailní analýze genetické informace jedinců. Tento posun umožňuje efektivní analýzu širokého spektra vzácných Mendelovských onemocnění podmíněných funkčně závažnými mutacemi v jednotlivých genech. U komplexních onemocnění se oproti původnímu předpokladu významného vlivu kombinace populačně běžných genetických variant odhaluje dominantní úloha vzácných funkčně významných genetických variant. Tyto vzácné genetické varianty jsou výsledkem explozivního populačního růstu posledních století a jsou nutně populačně specifické. Určení genetické architektury komplexních onemocnění proto vyžaduje sekvenační analýzu lokálních kohort pacientů, znalost genetické variability studované populace a expertizu v molekulárně biologické, buněčně patologické a cílené klinické charakterizaci nalézaných variant.

B-5-1

Nové markery kardiovaskulárního rizika a onemocnění

New cardiovascular biomarkers

Franeková J., Jabor A.

Pracoviště laboratorních metod, IKEM, Praha

jafa@ikem.cz

Cíl: vyhodnotit prediktivní roli cystatinu C u pacientů po akutním infarktu myokardu (AIM, soubor A), posoudit predikční efektivitu galectinu-3 (Gal3) po transplantaci srdce (TxHT) a porovnat vypovídací schopnost hsTnT a hsTnI u těchto pacientů porovnáním head-to-head (soubor B).

Metodika: Soubor A - sledovali jsme 811 pacientů po AIM po dobu 5,5 let, 733 pacientů přežilo, 78 zemřelo v průběhu follow-up. 142 pacientů bylo při přijetí léčeno statiny. Odběr na stanovení cystatinu C (Abbott Architect) byl proveden při přijetí. Soubor B - sledovali jsme Gal3 (Abbott Architect) u 106 pacientů po TxHT, odběr byl proveden 10. den po TxHT, sledoval se vliv na přežití v období až 900 dnů. Pro porovnání hs-troponinů (hsTnT Cobas Roche, hsTnI Abbott Architect) bylo selektováno 94 pacientů, 6 zemřelo.

Výsledky: Soubor A - cystatin C nad 1,5 mg/l byl spojen se zkrácenou pravděpodobností přežívání (Kaplan-Meier, 57 %) v porovnání s pacienty s cystatinem C pod 1,5 mg/l (pravděpodobnost přežití 90 %, p<0,0001, HR 6,5, 95 % CI 2,3 – 18,5). Schopnost predikovat prognózu byla zachována u pacientů léčených i neléčených statiny. Soubor B – Gal3 v 10. dnu po TxHT nad 25 µg/l predikoval riziko úmrtí (Kaplan-Meier, p<0,001, HR 8,2, 95 % CI 1,8 – 36,4). Gal3 byl zvýšen u pacientů, kteří měli 12 měsíců po TxHT signifikantně zvýšené koncentrace BNP. Vztah k prognóze pacientů po TxHT mělo vyšší hsTnT než hsTnI ve 30. dnu (ROC analýza pro kriterium exitus, AUC pro hsTnI 0,780, 95 % CI 0,68 – 0,86; AUC pro hsTnT 0,824, 95 % CI 0,73 – 0,90).

Závěry: Cystatin C predikuje riziko úmrtí po infarktu myokardu. Galectin-3 predikuje pozdní riziko úmrtí a selhávání myokardu po transplantaci srdce. Diagnostická efektivita hsTnT a hsTnI pro predikci prognózy pacientů po transplantaci srdce byla porovnatelná s mírně vyšší predikční efektivitou hsTnT.

B-5-2

Význam necholesterolových sterolů pro odhad rizika aterotrombózy a léčbu dyslipidémie

The importance of non-cholesterol sterols for the risk of atherothrombosis and treatment of dyslipidemia

Žák A., Vecka M.

4. interní klinika, 1. lékařská fakulta UK a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze

azak@vfn.cz

Limitované možnosti predikce ICHS vedou v současnosti k definici nových rizikových faktorů včetně molekulárně-genetických činitelů. Během léčby statiny přetrvává u části osob závažné reziduální riziko ICHS. Za část reziduálního rizika odpovídají vyšší koncentrace TAG a HDL-cholesterolu. Vysoká hladina bazální syntézy cholesterolu a nízká absorpce cholesterolu jsou spojeny s větším profitem ze statinové léčby, kdežto obráceně nastavené parametry homeostázy cholesterolu jsou příznačné pro jedince s KVO. Absorpce fytosterolů je zprostředkována aktivitou sterolového kotransportéru ABCG5/G8. U osob, které mají zvýšený pool cholesterolu a fytosterolů v důsledku snížené aktivity ABCG5/G8, je metabolismus necholesterolových sterolů odlišný, a to jak v důsledku zvýšeného příjmu exogenního cholesterolu a/nebo přímého toxického působení fytosterolů (resp. oxidačních produktů). Experimentální modely naznačují souvislost mezi endoteliální dysfunkcí, zvýšeným TK a hladinami fytosterolů. Retrospektivní studie sice prokázaly účinnost statinů pro zastavení progrese degenerativní stenózy aorty, nicméně prospektivní studie poskytují kontroverzní výsledky.

Závěrem lze říci, že sledování koncentrace necholesterolových sterolů (prekurzorů cholesterolu i fytosterolů), které se uplatňují v etiologii a patogeneze lidské aterosklerózy, má význam minimálně u osob se sníženou aktivitou ABCG5/G8. Terapeutické implikace by mohly zahrnovat na straně jedné výběr jedinců, u kterých podávání fytosterolů může zhoršovat úroveň kardiovaskulárního rizika, případně eliminovat prospěch z kontroly konvenčních kardiovaskulárních rizikových faktorů a na straně druhé pacienty, kteří z léčby statiny výrazněji profitují.

B-5-3

Těhotenský protein PAPP-A a polymorfismy genu PAPP-A v prognóze chronicky hemodialyzovaných nemocných

Pregnancy-associated plasma protein A PAPP-A and PAPP-A gene polymorphisms in the prognosis of chronic hemodialysis patients.

Kalousová M., Jáchymová M., Muravská A., Benáková H., Kuběna A. A., Tesař V., Zima T.

Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a VFN Praha; Klinika nefrologie 1. LF UK a VFN Praha

marta.kalousova@seznam.cz

Cíl studie: PAPP-A je nezávislý prediktor mortality chronicky hemodialyzovaných nemocných. Polymorfismus Cys327Cys genu PAPP-A (rs12375498) je významný u preeklampsie a C alela polymorfismu PAPP-A C/G (rs13290387) se ukázala jako nezávislý rizikový faktor infarktu myokardu. Cílem práce bylo zjistit význam těchto dvou polymorfismů u hemodialyzovaných nemocných.

Metody: Sledovanou skupinu tvořilo 464 jedinců – 319 chronicky hemodialyzovaných nemocných (183 mužů a 136 žen, průměrný věk 62±14 let) a 145 kontrol (65 mužů a 80 žen, průměrný věk 49 ± 14 let). Podskupina 211 hemodialyzovaných nemocných (118 mužů a 93 žen, průměrný věk 63 ± 13 let) byla prospektivně sledována po dobu 4,5 let. V průběhu sledování 111 nemocných zemřelo, u 51 z nich byla příčina úmrtí kardiovaskulární. PAPP-A polymorfismy byly analyzovány sekvenací DNA a PAPP-A bylo měřeno metodou TRACE (time resolved amplified cryptate emission).

Výsledky: Genotypové frekvence se nelišily mezi hemodialyzovanými pacienty a kontrolami a nesouvisely se sérovými koncentracemi PAPP-A. Polymorfismus Cys327Cys byl významný z hlediska přežití - přítomnost mutované alely byla riziková pro celkovou i kardiovaskulární mortalitu (HR (95 % CI): 1,616 (1,110 - 2,353), p = 0,012; 1,757 (1,018 - 3,030), p = 0,043). Polymorfismus C/G neměl prognostický význam.

Závěr: Naše studie ukazuje na význam Cys327Cys PAPP-A polymorfismu (rs12375498) pro celkovou a kardiovaskulární mortalitu hemodialazovaných nemocných.

Poděkování: Práce byla podpořena výzkumnými záměry PRVOUK-P25/LF1/2 a RVO-VFN64165.

PL-3

Úloha laboratorní medicíny v komplexní léčbě nádorových onemocnění

The role of laboratory medicine in the multidisciplinary management of cancer

Melichar B.

Onkologická klinika Lékařské fakulty Univerzity Palackého a Fakultní nemocnice Olomouc

bohuslav.melichar@fnol.cz

Obory laboratorní medicíny a klinická onkologie prošly v posledních desetiletích vývojem, který je v mnoha ohledech analogický. Oba obory před půlstoletím prakticky začínaly a ze skromných začátků se postupně staly nejdynamičtěji se rozvíjejícími oblastmi medicíny s vysokou prestiží. Péče o nemocné s nádory je problematikou, která není omezena na jeden lékařský obor nebo skupinu oborů, ale na prakticky všechny lékařské specializace. Významnou a ve své podstatě nezastupitelnou roli nejen v diagnostice, ale i léčbě nádorových onemocnění hraje i laboratorní medicína. Využití laboratorní medicíny v péči o nemocné s nádory lze shrnout od několika navzájem prolínajících se okruhů, které zahrnují nejen stanovení cirkulujících nebo jiných biomarkerů v rámci screeningu, diagnostiky, předpovědi prognózy nebo odpovědi na léčbu, ale i sledování odpovědi organismu na nádorové onemocnění, sledování nebo predikci toxicity protinádorové léčby nebo monitorování a predikci koncentrací protinádorových léků. Význam laboratorní medicíny roste v současné době cílené léčby, kdy je často vývoj nových léčiv vázán na současný vývoj prediktivních biomarkerů. Bohužel stále je podceňována oblast rozvoje biomarkerů hodnotících odpověď organismu na nádor a toxické postižení při protinádorové léčbě, rovněž možnosti sledování koncentrací léků a farmakogenomiky nejsou dosud v klinické praxi zcela doceňovány a využívány. Přes nutnost dalšího bádání jsou metody laboratorní medicíny již v současné době naprosto nezbytnou standardní součástí péče o nemocné s nádorovým onemocněním.

B-6-1

Šedesát let analýzy DNA – od objevu dvoušroubovice k sekvenátorům nové generace

Sixty years of DNA analysis – from discovery of double helix structure to next generation sequencing

Beránek M.¹ a Novotný D.²

¹Ústav klinické biochemie a diagnostiky, LF UK a FN Hradec Králové; ²Oddělení klinické biochemie, FN Olomouc

beranek@lfhk.cuni.cz

V letošním roce si připomínáme šedesáté výročí objevu dvoušroubovicového uspořádání molekul DNA (J. Watson a F. Crick, 1953). Rozvoj metod molekulární biologie a jejich aplikace pro klinické účely následně ovlivnila řada dalších objevů, z nichž některé letos slaví své kulatiny. Stěžejní význam pro širší aplikace metod molekulární genetiky mělo pochopení principu genetického kódu a funkce nukleových kyselin při proteosyntéze. Převážná většina tripletů nukleotidů kódujících jednotlivé aminokyseliny byla dešifrována v roce 1963. Uplatnění sekvenačních metod pro experimentální i klinické použití umožnily tyto objevy: technologie rekombinantní DNA (1973), princip polymerázové řetězové reakce (1983) a příprava amplikonů v mikrodestičkovém formátu (1993), která přispěla k automatizaci sekvenačních metod. Důležitým mezníkem pro práci s DNA v klinické laboratoři bylo přečtení sekvence lidského genomu prezentované poprvé v roce 2003. DNA databáze se postupně staly nenahraditelným pomocníkem při hledání genetických variant a definovaly referenční sekvenci DNA člověka. Sekvenační analýzu lze provádět na genetických analyzátorech různého typu. Kromě nejběžnějších automatických analyzátorů založených na kapilární elektroforéze (v ČR nyní 150–160 kusů) je u nás v současnosti k dispozici okolo 40 analyzátorů typu next generation sequencing, z nichž 90 % je určeno k analýze klinických vzorků. V roce 2014 se očekává zdvojnásobení nynějšího počtu sekvenátorů nové generace.

B-6-2

Využití moderních genomických přístupů v diagnostice a léčbě leukémií

Application of genomic approaches in leukemia diagnostics and treatment

Pospíšilová Š., Tichý B., Staňo Kozubík K., Malčíková J., Plevová K., Doubek M., Mayer J.

Masarykova Univerzita, CEITEC – Centrum molekulární medicíny a Fakultní nemocnice Brno, Interní hematologická a onkologická klinika

sarka.pospisilova@fnbrno.cz

Diagnostika nádorových onemocnění je v posledních letech neodmyslitelně spjata s využitím molekulárně-biologických přístupů. S rozvojem personalizované medicíny navíc vznikla potřeba co nejpodrobněji analyzovat nejen jednotlivé geny s jasným významem u daného onemocnění, ale také celé lidské genomy nebo jejich části. Prvními vysokokapacitními genomickými přístupy byly DNA čipy, které umožnily detekci genové exprese, ale také chromozomálních aberací i bodových mutací a polymorfismů, a pomohly identifikovat četné nádorové markery. V diagnostice našly uplatnění zejména čipy pro detekci cytogenetických změn založené na tzv. komparativní genomové hybridizaci. Zásadním technologickým posunem bylo zavedení vysokokapacitního masivního paralelního sekvenování DNA – tzv. sekvenování nové generace (NGS). Tyto technologie umožňují sekvenaci celého lidského genomu nebo jeho částí, přičemž lze nastavit velmi vysokou senzitivitu a identifikovat mutace přítomné ve velmi malém procentu analyzovaných nádorových buněk. Tento fakt je velmi významný právě pro uplatnění NGS v onkologické diagnostice, protože vysoká citlivost metody umožňuje detekci genetických abnormalit v buněčných subpopulacích a tak sledovat evoluci nádorových klonů. U leukémií již našly nové genomické přístupy velmi široké uplatnění. Pomohly identifikovat nové prognostické markery (např. geny NOTCH1 a SF3B1 u chronické lymfocytární leukémie) nebo markery pro monitorování molekulární reziduální nemoci (např. IDH1/2 u akutní myeloidní leukémie). NGS už také začíná být rutinně využíváno u všech typů leukémií při mutačních analýzách.

B-6-3

Využití platformy sekvenování nové generace (Next Generation Sequencing, NGS) v molekulárně genetické diagnostice na Oddělení lékařské genetiky FN Brno

Next generation sequencing in molecular genetics diagnostics on Departmenet of Medical Genetics University Hospital Brno

Valášková I., Vaňásková M., Dudová S., Nečasová J., Ošťádalová E., Spěšná R., Gaillyová R.

Fakultní nemocnice Brno

ivalaskova@fnbrno.cz

Sekvenování nové generace („next-generation sequencing“, NGS) je revoluční technologie, která poskytuje levné, správné a přesné informace o genomické sekvenci.). Tato technologie od svého uvedení postupně téměř ovládla oblast základního či aplikovaného výzkumu zabývajícího se analýzou DNA. Nyní NGS vstupuje i do klinické diagnostiky. Jedná se zejména o aplikace, kde se vyžaduje velké množství sekvenačních informací případně vysoká citlivost. Naše laboratoř pro molekulárně genetickou diagnostiku genetických chorob používá NGS platformu GS Junior system od firmy Roche, který je založen na 454 technologii pyrosekvenování. GS Junior systém umožňuje velmi rychle sekvenovat stovky úseků DNA pocházejících od různých pacientů a s citlivostí záchytu až pod 1%. Budeme prezentovat konkrétní diagnostické postupy, při nichž je využívána platforma NGS, a to:

1. ultra-široké sekvenování amplikonů, tj. sekvenování desítek exonů genu zodpovědného za dané onemocnění u několika jedinců
2. ultra-hluboké sekvenování amplikonů, zaměřené na velmi vysokou citlivost, a s tím spojený záchyt velmi malého klonu DNA nebo RNA mutovaných sekvencí v analyzovaném biologickém vzorku pacienta
3. sekvenování regionů lidského genomu asociovaných s gen. onemocněním pomocí technologie Sequencing Capture. Uvedeme některé konkrétní příklady našich analýz a podělíme se o zkušenosti.

B-6-4

Analýza vybraných genů metodou Next generation sequencing

Analysis of selected genes using Next generation sequencing technology

Cibulková P., Dvořáková M., Křenková R., Indráková J., Richterová R.

Laboratoře AGEL, a. s., Laboratoř lékařské genetiky, Nový Jičín

petra.cibulkova@lab-agel.cz

Úvod: Sekvenační technologie nové generace (z anglického Next generation sequencing - NGS) umožňují rychlé sekvenování celých genů, resp. genomů, a to i u několika vzorků najednou, což přináší nové možnosti do oblasti klinické diagnostiky. NGS technologie vyvinuté speciálně pro diagnostické účely často již nahrazují nebo doplňují stávající laboratorní metody zejména z důvodu rychlosti a citlivosti. V laboratoři lékařské genetiky využíváme NGS pro analýzu DNA pacientů s familiární adenomatózní polypózou (FAP), hereditárním nonpolypózním kolorektálním karcinomem (HNPCC, Lynchův syndrom) a Marfanovým syndromem (MFS).

Materiál a metody: DNA izolujeme převážně z periferní krve pacientů. U dědičné adenomatózní polypózy, která je charakterizována mnohočetnými nádory střeva, analyzujeme gen APC (5q21). U pacientů s Lynchovým syndromem, pro který je typický výskyt malého počtu adenomů, z nichž některý může progredovat v nádorové onemocnění, analyzujeme geny MLH1 (3p21), MSH2 (2p21), MSH6 (2p16). U pacientů s Marfanovým syndromem sekvenujeme gen FBN1 (15q21), kódující glykoprotein fibrillin-1, který je součástí elastických vláken tkání. Analýzu všech zmíněných genů provádíme pyrosekvenační metodou na přístroji GS Junior 454 (Roche).

Výsledky: Metodou NGS jsme nahradili starší screeningovou metodu pro vyhledávání mutací v genech - SSCP (single strand comformation polymorphism), jejíž účinnost se pohybuje mezi 70 – 90 % a závisí na mnoha vnějších faktorech. Díky tomu se nám podařilo zvýšit záchyt kauzálních mutací v genech přibližně o 12 % a přispět tak u většího počtu pacientů k objasnění klinické diagnózy.

Závěr: Nenahraditelným přínosem NGS je zvýšení citlivosti záchytu sekvenčních změn oproti dosud používaným technikám a analýza v kratším čase.

B-7-1

Příběhy, hry a simulace - součást práce klinického biochemika?

Stories, games and simulations – a part of the laboratory medicine specialist job?

Rajdl D., Racek J., Petříková V., Šolcová M.

Ústav klinické biochemie a hematologie, Univerzita Karlova, Lékařská fakulta v Plzni a FN PLzeň

rajdl@fnplzen.cz

Reálné příběhy jsou přirozeným způsobem předávání informací. Lidský mozek je snadno vstřebává a dlouho uchovává. Kazuistiky proto patří mezi nejcennější formy výuky v pregraduálním i postgraduálním životě lékařů. Obdobně i hry jsou součástí základní pedagogické výbavy většiny savců. Jsou tedy hluboce evolučně zakořeněny, člověka baví a jejich prostřednictvím je schopen snadno pochopit a prakticky zvládnout i složité koncepty. V současnosti máme, kromě tradičních způsobů předávání příběhů a hraní, k dispozici celou řadu elektronických prostředků, které implementaci příběhů, her a simulací do vzdělávání lékařů významně usnadňují. V příspěvku se zaměříme na praktické zkušenosti autorů s některými z nich a na teoretický přehled moderních možností. Konkrétně půjde o využití LMS MOODLE, prezentačního systému Prezi, konceptu virtuálního pacienta a některých počítačových her (např. ElderQuest). Prezentace bude provázena ukázkami kazuistik tak, aby byly demonstrovány výhody (a nevýhody) jednotlivých výukových nástrojů.

B-7-2

Využití interaktivních kazuistik a scénářů v kazuisticky orientované výuce

The use of interactive case studies and scenarios in education

Harazim H., Štourač P., Schwarz D

Klinika anesteziologie, resuscitace a intenzivní medicíny LF MU a FN Brno; Institut biostatistiky a analýz MU

hana.harazim@gmail. com

Úvod: Cílem sdělení je představit interaktivní pomůcky pro výuku akutní medicíny portálů AKUTNE.cz (součást MEFANET) a SEPSIS-Q, které jsou ve formě multimediálních algoritmů či klinických scénářů určeny pro podporu výuky magisterských i bakalářských směrů na lékařských fakultách. Představují důležitou část jednotlivých lekcí, které jsou tak orientovány prostřednictvím prezentované kazuistiky více problémově (Problem Based Learning-PBL) oproti tradičnímu modelu.

Metodika: Na tvorbě algoritmů AKUTNE.cz se podílejí sami studenti pod vedením lékaře v rámci předmětu Samostatná práce. Následně algoritmus vložený do BackOffice portálu podléhá recenznímu (Peer Review) řízení a je zveřejněn na portálu v rámci sekce výukových pomůcek. Striktně anonymizované podklady pro interaktivní scénáře SEPSIS-Q jsou čerpány z registru EPOSS (eposs.registry.cz) a zveřejněny jsou po interní oponentuře garantem.

Výsledky: Od roku 2007 vzniklo přes 30 interaktivních algoritmů v češtině i angličtině, které jsou dostupné na www.akutne.cz. Jednotlivé algoritmy pokrývají tyto tematické celky: první pomoc, urgentní medicína, intenzivní medicína, algeziologie, anesteziologie, stomatologie, gynekologie a porodnictví a chirurgie. Od roku 2012 byly na portálu SEPSIS-Q zveřejněny 4 klinické scénáře těžké sepse, vycházející z reálných klinických případů.

Diskuse: Představené pomůcky lze využít ve výuce formou PBL studijních oborů Všeobecné lékařství, Porodní asistence a Zubní lékařství. Z provedeného evaluačního šetření studenti oceňují jejich zařazení do výuky pozitivně a využívají je i v domácí přípravě.

Závěr: Tyto recenzované výukové pomůcky lze použít pro vedení PBL výuky zdravotnických profesí.

B-7-3

Vybrané kazuistiky z praxe klinického biochemika

Selected case studies from practice of clinical biochemist

Šolcová L., Šimková J., Rajdl D., Sečník P., Lacko J.

Oddělení klinické biochemie: ON Trutnov a. s., ÚKBH FN Plzeň, IKEM Praha, CL Třebíč

lucie.solc@post.cz

Autoři seznamují s činností a náplní vzniklé pracovní skupiny pro kazuistiky. Po krátkém informačním úvodu dochází k představení jednotlivých rozličných případů onemocnění, které jsou podrobněji rozebrány. Vždy je kladen důraz na spolupráci klinického biochemika - lékaře s lékaři ostatních klinických oborů při stanovení správné diagnózy, a tím i zahájení včasné léčby onemocnění. Jednotlivé kazuistiky jsou zajímavé jak svou tématickou různorodostí, tak i možností pomoci při odhalení přesné diagnózy u dalších pacientů v budoucí klinické i laboratorní praxi.

B-7-4

Pracovní skupina Kazuistiky a její výstupy: Zajímavé kazuistiky z laboratorní praxe formou testu

Work group Case reports and its outcomes: Interesting case reports in laboratory practice as a test

Lacko J., Sečník P., Šolcová L., Rajdl D.

Centrální laboratoř, Nemocnice Třebíč, p. o; Pracoviště laboratorních metod, IKEM Praha; Oddělení klinické biochemie, Oblastní nemocnice Trutnov; Ústav klinické biochemie a hematologie, Fakultní nemocnice v Plzni;

medicde@centrum.cz

Autoři prezentují kazuistiky z praxe lékaře - klinického biochemika formou testu. Některé diagnózy ve vybraných kazuistikách byly kliniky opomenuty a odhaleny až po upozornění laboratoře. Je tak ukázán podíl klinického biochemika na péči o pacienta. Vždy po krátkém uvedení do problému jsou nabídnuty možnosti s dotazem na výběr správné odpovědi. Jsou akcentovány základní výhody zpracování kazuistik formou testu, zejména pro edukaci a ověření si znalostí. Je zajištěn elektronický přístup bez časového omezení, jsou vhodné pro samostudium. Jedná se o formu relativně jednoduchou, umožňující rychle přejít od nastolení problému k jádru. Jednotlivé případy mohou být snadno vstřebatelné a zapamatovatelné s možností využití v další klinické i laboratorní praxi.

B-7-5

Nádorové markery – kazuistiky

Tumour markers – care reports

Kalousová M.

Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a VFN Praha

marta.kalousova@seznam.cz

Cíl studie: Kazuistiky jsou stále více zapojovány do výuky studentů medicíny i v oboru klinická biochemie. Jsou názornou demonstrací laboratorních vyšetření u konkrétního nemocného v konkrétní situaci. Cílem práce je ukázat využití nádorových markerů v klinické praxi.

Metody: Nádorové markery byly stanoveny rutinními metodami v laboratoři klinické biochemie dle indikace ošetřujícího lékaře. Jsou prezentovány v širším kontextu dalších laboratorních a zobrazovacích vyšetření.

Výsledky: Nádorové markery jsou určeny především k monitorování nemocných s nádorovým onemocněním. Primárně neslouží pro diagnostiku, ale mohou v diagnostickém procesu pomoci. Pozitivní nález nádorového markeru nemusí vždy znamenat nádor a naopak negativní nález nemusí znamenat nepřítomnost nádoru.

Závěr: Laboratorní vyšetření jsou integrální součástí diagnosticko-terapeutického procesu. Nádorové markery jako každé jiné laboratorní vyšetření musí být správně indikováno, především onkologem, a náležitě interpretováno.

Poděkování: Práce byla podpořena projekty MPO TIP FR-TI3/666 a RVO-VFN6416

B-7-6

Kompletní porucha vnitřního prostředí - kazuistika

Complex disturbance of homeostatis - case

Brodská H., Kazda A., Křemen J.

Ústav lékařské biochemie a 3. interní klinika VFN a 1. LF Praha

kazda@vfn.cz

Cíl studie: Prezentace nemocného s těžce dekompenzovaným diabetem I. typu a rozvratem vnitřního prostředí.

Metody: Na urgentní příjem byl přijat 25 letý muž. Dia-betes mellitus od 18 let, léčen inzulinem. Nyní 3 dny abúsus alkoholu, v den přijetí nalezen v bezvědomí. Přijat v šokovém stavu, podchlazen na 25°C, oteplen do 12 až 18 hod., pak přechodná febrilní špička a bez teplot. Anurie trvající 4 hodiny, po masivním zavodnění nástup diurézy. Další den při vědomí, dezorientace, 3. den upraveno. 9. den dimise v dobrém stavu. První 2 dny monitorován biochemicky po 3-4 hod., později frekvence nižší.

Výsledky: Budou prezentovány na tabulkách. Glykémie při příjmu, za 8 a 48 hod. byla 108, 39 a 11 mmol/l. Opačný trend natrémie, od 127 přes 162 na 155 mmol/l ve stejných časech. Maximum osmolality 424 mmol/kg H₂O. Acidóza metabolická (ketolátky, hyponatremie, laktát) i respirační: pH 6,739, pCO₂ 6,54 kPa, akt. HCO₃^- 6, 3mmol/l, BE ??, po 1 hod pH 6,958, pCO₂ 5,72 kPa, akt. HCO₃^- 9,1 mmol/l, BE -23,7mmol/l. Normalizace do 15 hod jen zdánlivá, na nálezu se podílí acidifikující ketoacidóza, hyperlaktatemie a renální dysfunkce a alkalizující hypoalbuminemie a hypernatremie. Zvýšené chloridy se acidifikačně neuplatňují, vzhledem k hypernatremii je to úměrné. Renální funkce se upravují rehydratací, do 48 hod urea z 34 na 9 mmol/l, kreatinin z 504 na 146 µmol/l, později úprava úplná. Příznivý byl i vývoj dalších, zpočátku extremně zvýšených parametrů, jako byl prokalcitonin (bez infekce), laktát, kys. močová a myoglobin.

Závěr: Práce upozorňuje na iontové dysbalance při poruchách efektivní osmolality i na nutnost komplexního hodnocení vnitřního prostředí pro diagnózu smíšených acidobazických poruch.