Přirozené protilátky proti α(1,3) galaktosylovému epitopu v séru nemocných s maligními nádory

Souhrn

Východisko:
Přirozené protilátky proti sacharidovým antigenům jsou součástí lidských sér; nejvíc je jich namířeno proti α-galaktosylovému epitopu (Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R). Experimentální a úvodní klinické studie ukazují na možnost využití antigalaktosylových protilátek pro imunoterapii onkologických pacientů preparáty glykolipidů obsahujících α-galaktosylový epitop. Předpokladem tohoto terapeutického postupu je přítomnost dostatečného množství těchto protilátek v sérech nemocných s maligními nádory. V literatuře jsou zmínky o výskytu těchto protilátek u onkologických pacientů pouze ojedinělé. Údaje o jejich množství a o izotypové charakteristice u různých nádorových onemocnění chybí.

Materiál a metody:
Byl vypracován ELISA-test se syntetickým disacharidem Galα1-3Galβ vázaným na polyakrylamid, který umožňuje kvantitativní průkaz antigalaktosylových protilátek v izotypech IgM, IgG a IgA. Tímto testem byla vyšetřena séra od 57 nemocných s mamárním, kolorektálním, pankreatickým karcinomem a melanomem a výsledky byly srovnány s výskytem těchto protilátek u 145 zdravých osob.

Výsledky:
Koncentrace antigalaktosylových protilátek v séru (anti-Gal) je závislá na pohlaví: IgM anti-Gal jsou u zdravých žen ve vyšších titrech než u zdravých mužů (p < 0,01). V séru pacientů s mamárním karcinomem, kolorektálním karcinomem, karcinomem pankreatu a maligním melanomem jsou přítomny přirozené protilátky proti galaktosylovému epitopu v koncentracích podobných jako u zdravých osob, a to v izotypech IgG, IgM a IgA. U pacientů, mužů, s kolorektálním karcinomem byly zjištěny koncentrace IgA anti-Gal vyšší než u zdravých mužů (p < 0,01).

Závěr:
Antigalaktosylové protilátky jsou přítomny v sérech nemocných s maligními nádory a v sérech zdravých osob ve srovnatelných koncentracích i izotypech.

Klíčová slova:
alfa(1,3) galaktosylový epitop – přirozené protilátky – anti-Gal – ELISA – imunoterapie zhoubných nádorů

ÚVOD

Základem protinádorové léčby je chirurgické odstranění nádoru, radioterapie a chemoterapie. Stále více se však uplatňuje imunoterapie, která tuto konvenční léčbu doplňuje a někdy i nahrazuje. Významné postavení při ní mají protilátky, zvláště monoklonální, namířené proti nádorovým antigenům. Jejich účinnost je zvyšována konjugací s toxiny, radionuklidy, polymery [1]. Novým přístupem je využití přirozených protilátek proti galaktosylovému epitopu, které jednak mohou zprostředkovat destrukci nádorové buňky, jednak umožňují imunogennost nádorových antigenů [2]. Tyto přirozené protilátky byly původně prokazovány jako xenoaglutininy s králičími erytrocyty [3]. Epitop, proti kterému jsou namířeny, byl identifikován jako galaktosyl Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R [4]. Antigalaktosylové protilátky (anti-Gal) se vyskytují pouze u člověka, lidoopů a u opic Starého světa, u nichž došlo v průběhu evoluce k inaktivaci genu pro glykosylační enzym a tato struktura se tudíž u nich netvoří. V lidském séru tvoří asi 1 % sérového IgG (tj. 20–100 ug/ml) a jsou přítomny ve všech podtřídách IgG a také v IgM a v IgA. Jejich tvorba je indukována fyziologickou střevní mikroflórou [5]. V experimentální imunologii se používají geneticky modifikované myši (C57BL/6–H-2bxd α1,3GT KO), které galaktosylový epitop nemají a protilátky proti němu tudíž tvoří [6].

V literatuře jsou ojedinělé údaje o aberantní expresi galaktosylového epitopu v některých maligně transformovaných buňkách [7]. Tuto strukturu je však možno nádorům dodat: původní metodika je založena na transfekci nebo transdukci genu pro α-1,3-galaktosyltransferasu [2], jako vhodnější se jeví přímé vpravení α-gal glykolipidu do nádorové tkáně [8]. Nabízí se tak nový způsob imunoterapie nádorů, kdy by bylo využito interakce preformovaných přirozených antigalaktosylových protilátek s nádorovými buňkami exprimujícími galaktosylový epitop. Využití experimentálních údajů v klinické onkologii předpokládá především důkaz o přítomnosti dostatečného množství těchto protilátek v sérech nemocných s maligními nádory. V literatuře jsou pouze ojedinělé zmínky, že se tyto protilátky u onkologických pacientů vyskytují [9, 10]. Informace o jejich hladině u různých nádorových onemocnění a o izotypové charakteristice těchto protilátek však zatím chybí. Vypracovali jsme ELISA-test, který umožňuje kvantitativní průkaz antigalaktosylových protilátek v izotypech IgM, IgG a IgA. V předložené práci uvádíme výsledky vyšetření antigalaktosylových protilátek v sérech nemocných s mamárním karcinomem, kolorektálním karcinomem, karcinomem pankreatu a melanomem a srovnáváme je s výskytem těchto protilátek u zdravých osob.

MATERIÁL A METODY

K vyšetření byla použita séra pacientů Masarykova onkologického ústavu v Brně z odběrů krve v rámci standardních diagnostických postupů v souladu s požadavky etické komise. Séra byla získána od pacientů po potvrzení diagnózy na MOÚ bez ohledu na klinické stadium choroby. Byly zpracovány vzorky od 22 pacientek se zhoubným novotvarem prsu, od 20 pacientů se zhoubným novotvarem tlustého střeva, od 6 pacientů s novotvarem slinivky břišní a od 9 pacientů se zhoubným melanomem. Kontrolní séra byla získána od věkově odpovídajících zdravých dobrovolníků (61 mužů a 84 žen) s jejich informovaným souhlasem. Krev byla odebírána venepunkcí standardním způsobem, sérum bylo získáno po půlhodinové koagulaci při pokojové teplotě centrifugací a uchováváno při -20 °C.

Naše metodika, umožňující kvantitativní stanovení antigalaktosylových protilátek v IgM, IgG a IgA, je založena na enzymové imunoeseji, detekčním antigenním reagens je syntetický disacharid Galα1-3Galβ kovalentně vázaný na poly[N-(2-hydroxyethyl)akrylamid] (Lectinity Holdings, Inc., Moskva, Rusko).

Polystyrenové mikrotitrační destičky (Nunc MaxiSorp, Roskilde, Denmark) jsou potaženy antigenním reagens: na jamku 100 µl antigenu v koncentraci 5 µg/ml v 0,1 M uhličitanovém pufru pH 9,6; inkubace při 4 °C přes noc, promytí promývacím roztokem Tris-NaCl-Tween 20 (Aesku Diagnostics GmbH, Wendelsheim, Germany). K blokování je používán 0,1M PBS s 1% BSA, pH 7,4 (150 µl na jamku, 1,5 hodiny při 37 °C). Séra jsou ředěna 1 : 40 roztokem PBS-BSA--Tween (0,1M PBS pH 7,4 s 1% BSA a 5% Tweenem 20). Naředěná séra jsou napipetována po 100 µl do jamek v dubletech a inkubována 2 hod. při 37 °C. Po promytí promývacím roztokem jsou do jamek přidána po 100 µl antiséra značená peroxidázou, inkubace trvá 1 hod. při pokojové teplotě. K průkazu IgM, IgG a IgA jsou použita antiséra IgM/HRP, IgG/HRP a IgA/HRP (Dako Cytomation, Glostrup, Denmark). Po odstranění nenavázaných protilátek promývacím roztokem je do jamek přidán v množství 100 µl substrát (TMB Substrate Chromogen, DakoCytomation, USA), inkubace trvá 7 minut při pokojové teplotě a reakce je zastavena 1 M H₂SO₄. Optická denzita je měřena na fotometru MRXII (Dynex) při 450 nm. Výsledky jsou uvedeny v arbitrárních jednotkách (A. U.), které jsou vypočítány z kalibrační křivky sestrojené z hodnot titrace směsi sér od zdravých dárců krve AB + Rh +. Jako 100 A. U. je vzata hodnota optické denzity standardního séra ředěného 1 : 40.

Ke statistickému zpracování výsledků bylo použito software STATISTIKA (Stasoft, Inc), verze 7.

VÝSLEDKY

Hladiny antigalaktosylových protilátek (anti-Gal) v izotypech IgG, IgM a IgA jsou znázorněny v grafech 1, 2 a 3. Je zřejmé, že jak u kontrolních zdravých osob, tak u onkologických pacientů existuje výrazný kvantitativní rozptyl.

Koncentrace IgG anti-Gal jsou u zdravých osob a u pacientů srovnatelné, bez statistických rozdílů mezi jednotlivými skupinami (graf 1).

Koncentrace IgM anti-Gal (graf 2) jsou u zdravých žen statisticky významně vyšší než u zdravých mužů (p < 0,01). U žen s karcinomem prsu jsou IgM anti-Gal ve srovnání s ženami z kontrolní skupiny sice v nižších koncentracích, ale statisticky nevýznamně (p = 0,065).

V případě IgA anti-Gal (graf 3) jsme zaznamenali vyšší koncentrace u pacientů s karcinomem pankreatu, počet pacientů k interpretaci je však nízký, n = 6. Při analýze pacientů, mužů, s kolorektálním karcinomem (n = 15) jsme naměřili vyšší koncentrace IgA anti-Gal ve srovnání s muži z kontrolní skupiny (statistická významnost p < 0,01). Rozdíly v koncentraci celkových IgA byly u těchto skupin statisticky nevýznamné.

DISKUSE

Možnost využití přirozených protilátek proti galaktosylovému epitopu (anti-Gal) rozšiřuje repertoár současné imunoterapie onkologických pacientů. Mechanismus protinádorového účinku je v tomto případě dvojí. Za prvé, nádorová buňka exprimující galaktosylový epitop (jako jeden z projevů maligní konverse nebo po arteficiálním vpravení) po vazbě antigalaktosylových protilátek přítomných v séru pacienta může být zničena hyperakutní rejekcí, způsobenou komplement-dependentní cytolýzou a buněčnou cytotoxicitou závislou na protilátkách (ADCC). I když u pacientů s nádorovými chorobami defekty aktivačních drah komplementového systému přítomny nejsou, problém může být v relativní rezistenci nádorových buněk k membránovému lytickému komplexu. Ta je podmíněna abnormální expresí regulačních proteinů komplementu, zejména CD46, CD55, CD59 na maligně transformovaných buňkách, ale také solubilním faktorem H [11, 12]. Na experimentálních modelech se tento problém daří překonat [13]. Za druhé, tyto anti-Gal protilátky, opsonizují nádorové buňky, které mají ve své membráně galaktosylový epitop, zprostředkovávají vazbu nádoru na buňky předkládající antigen (APC), využívajíce jejich receptoru pro Fc fragment imunoglobulinu (FcγR). Uvádí se, že endocytóza nádorových buněk opsonizovaných IgG prostřednictvím FcγR na dendritických buňkách vede ke zkřížené prezentaci antigenních peptidů a efektivní imunitní reakci na úrovni jak protilátkové, tak buněčné. Mimořádně významné je to, že se imunitní reakce rozvíjí i proti dalším nádorovým antigenům [2, 8, 14, 15].

Uplatnění poznatků získaných na experimentálních modelech v klinické onkologii předpokládá především potvrzení, že pacienti s nádory mají tyto protilátky v dostatečném množství. V literatuře jsou o tom zmínky ojedinělé [2, 9, 10, 14]. Naše výsledky jsou s nimi ve shodě, ale dostupné údaje rozšiřují. Dokládáme, že tyto protilátky jsou přítomny v izotypech IgM, IgG a IgA v množství srovnatelném se zdravými osobami i u pacientů s karcinomem prsu, s kolorektálním karcinomem, s karcinomem pankreatu a s melanomem. Hlubší analýzu zasluhuje naše zjištění statisticky významně vyšších koncentrací IgA anti-Gal u pacientů s kolorektálním karcinomem. V této souvislosti jsou pozoruhodná sdělení Itzkowitze et al. [16] o antigenních alteracích v tkáních kolorektálního karcinomu týkajících se exprese inkompatibilních antigenů krevních skupin a Chena et al. [17] o tvorbě imunoglobulinů i nelymfoidními buňkami nádorů. S ohledem na potenciální terapeutické využití přirozených antigalaktosylových protilátek v onkologii by bylo vhodné zaměřit cytologické vyšetření i na aberantní expresi galaktosylového epitopu na buňkách nádorů. V souvislosti s možnými molekulárními změnami maligně transformovaných buněk je však třeba uvažovat také o strukturách, imitujících galaktosylový epitop, např. peptidech [18].

Lze předpokládat, že intervence založená na interakci galaktosylového epitopu v nádorových buňkách s antigalaktosylovými protilátkami séra by se mohla uplatnit kromě léčby nádorů v pokročilém stadiu také při neoadjuvantní terapii, např. před resekcí tumoru a že by mohla přispět i k omezování metastatického šíření nádorového procesu [8]. S pozorností je proto třeba čekat na výsledky klinických studií, které ohlásili Mandles et al. (lymfom) [14] a Rossi et al. (karcinom plic a prsu) [19]. První slibné údaje uvádí Whalen et al. [20]. V klinické studii koncipované jako I. fáze byl aplikován do nádorového ložiska jedenácti pacientům s velmi pokročilým stadiem karcinomu pankreatu, tlustého střeva, prostaty, ledvin, vaječníků, preparát glykolipidů s galaktosylovým epitopem. Prodloužené přežívání takto léčených pacientů vede autory k názoru, že byla navozena účinná protinádorová imunitní reakce.

Poděkování: Podpořeno granty MHCZ – DRO – MMCI00209805, RECAMO.CZ.1.05/2.1.00/03.0101, ACIU LM2011017 a MZ ČR- NR/9035-4.

Do redakce došlo dne 15. 1. 2014.

Adresa pro korespondenci:

Prof. MUDr. Jindřich Lokaj, CSc.

Ústav klinické imunologie a alergologie LF MU

Pekařská 53

656 91 Brno

e-mail: jlokaj@med.muni.cz