Diverzita humánních izolátů salmonel v Jihomoravském kraji v letech 2009–2012

Souhrn

Cíl práce:
Cílem této studie bylo určit diverzitu humánních izolátů salmonel v jednom z krajů České republiky v časovém horizontu čtyř let pomocí různých typizačních metod.

Materiál a metody:
Z fenotypových metod byla použita sérotypizace, fágová typizace a disková difuzní metoda ke stanovení rezistence k antimikrobiálním látkám. Z genotypových metod pak makrorestrikční analýza a pulzní gelová elektroforéza (PFGE).

Výsledky:
Jako nejčastější sérotyp humánních případů salmonelóz v Jihomoravském kraji byly detekovány Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimuriuma monofazická Salmonella 4,[5],12:i:-. Fágová typizace odhalila dominanci fágového typu 8 u S. Enteritidis a změny ve výskytu fágových typů u S. Typhimurium v průběhu let. Míra rezistence u S. Typhimurium, monofazické salmonely a některých ostatních sérotypů naznačuje vzrůstající problém multirezistentních kmenů jako patogenů člověka. V průběhu studie byly odhaleny izoláty patřící do lokálních i nadnárodních epidemií. Taktéž byly detekovány izoláty sérotypu 9,12:l,v:-, který byl na území České republiky detekován vůbec poprvé.

Závěry:
Variabilita izolátů získaných ve studii provedené v letech 2009–2012 v Jihomoravském kraji naznačuje, že heterogenita zdrojů humánních salmonelóz je poměrně velká. Nicméně odhalení několika případů s možnou epidemickou souvislostí ukazuje na důležitost provádění pečlivé typizace humánních izolátů a jejich porovnání s kmeny non-humánního původu. Zvýšená míra rezistence u některých sérotypů dokazuje nezbytnost monitorování situace v oblasti výskytu multirezistentních kmenů.

Klíčová slova:
Salmonella – antimikrobiální rezistence – typizace

ÚVOD

Salmonelózy (non-tyfoidní) jsou v České republice druhým nejčastějším bakteriálním onemocněním s alimentární cestou přenosu [1]. I přes výrazný pokles v počtech hlášených onemocnění patří Česká republika k zemím s nejvyšší incidencí salmonelóz v celé Evropské unii [2]. Vznik onemocnění je spojován s konzumací nedostatečně tepelně upravených potravin živočišného původu, především pak drůbežího masa, vajec a výrobků z nich a vepřového masa. V posledních letech se také diskutuje o přenosu potravinami rostlinného původu, které mohou být sekundárně kontaminovány na různých stupních pěstitelského a zpracovatelského procesu [2].

V České republice je dlouhodobě nejhojněji hlášeným sérotypem Salmonella enterica subsp. enterica sérotyp Enteritidis. Následují sérotypy Typhimurium a monofazický sérotyp Salmonella 4,[5],12:i:-, který byl popsán v 90. letech minulého století a nyní je pandemicky rozšířen [3]. Při typizaci epidemických kmenů zmíněných tří nejčetnějších sérotypů se v České republice využívá fágová typizace, metody na principu PCR a makrorestrikční analýza. A právě ta, jež je považována za zlatý standard v typizaci salmonel, má někdy nižší diskriminační schopnost než rychlá a levná metoda fágové typizace [4].

Závažným problémem baktérií čeledi Enterobacteriaceae, kam patří také zástupci rodu Salmonella, je zvyšující se výskyt kmenů rezistentních k více než třem skupinám antimikro­biálních látek. V nedávné době prováděné studie ukazují zvyšující se rezistenci u izolátů rodu Salmonella [5, 6]. Problémem je především výskyt kmenů produkujících širokospektré beta-laktamázy typu ESBL a kmenů rezistentních k fluorochinolonům, protože právě ty jsou často používány k léčbě komplikovaných salmonelových infekcí [7].

V letech 2009–2012 probíhal v naší laboratoři sběr humánních izolátů rodu Salmonella a jejich následná typizace. Cílem studie bylo sledování četnosti výskytu sérotypů salmonel, fágových typů u sérotypů Enteritidis a Typhimurium včetně monofazické varianty a rezistence salmonel k antimikrobiálním látkám.

MATERIÁL A METODY

Celkem bylo během daného období do naší laboratoře doručeno 688 suspektních kmenů salmonel. Kmeny pocházely ze tří klinických laboratoří na území Jihomoravského kraje.

Přijaté kmeny byly z transportních médií vyočkovány na půdy BGA (Oxoid, UK) a v případě potřeby na Rambach agar (Merck, Německo). U několika izolátů, které nerostly na chromogenním médiu v koloniích typické morfologie, byla prokazována náležitost k rodu Salmonella rodově specifickou metodou PCR [8]. Sérotyp byl ověřován metodu sklíčkové aglutinace se somatickými a bičíkovými antiséry (Denka Seiken, Japonsko a BioRad, Francie). U kmenů s určenými sérotypy Enteritidis, Typhimurium a 4,[5],12:i:- byla provedena fágová typizace podle protokolu HPA Colindale Londýn [9, 10]. U suspektních kmenů sérotypu Typhimurium, které nevykazovaly reakce se základní sadou fágů, byla použita i přídatná sada fágů a prověřena přítomnost genu druhé bičíkové fáze fljB [10, 11]. U kmenů sérotypů Typhimurium, 4,[5],12:i:-, vybraných izolátů Enteritidis a ostatních sérotypů, bylo provedeno stanovení rezistence k antimikrobiálním látkám diskovou difuzní metodou s vyhodnocením rezistence podle standardů CLSI a použitím antibiotických disků Oxoid (počet analyzovaných kmenů n = 1 75) [12]. Spektrum testovaných látek bylo následující: A – ampicilin (10 µg), AMC – ampicilin/kyselina klavulanová (30 µg), CTX – cefotaxim (30 µg), C – chloramfenikol (30 µg), S – streptomycin (10 µg), K – kanamycin (30 µg), CN – gentamicin (10 µg), N – neomycin (30 µg), APR – apramycin (15 µg), SU – složené sulfonamidy (300 µg), SXT – sulfamethoxazol/trimethoprim (25 µg), W – trimethoprim (5 µg), TE – tetracyklin (30 µg), NA – nalidixová kyselina (30 µg), CIP – ciprofloxacin (5 µg), ENR – enrofloxacin (5 µg), CT – kolistin (10 µg).

Makrorestrikční analýza byla provedena u kmenů méně častých sérotypů s možnou epidemickou souvislostí. Analýza byla provedena pomocí pulsní gelové elektroforézy (PFGE) podle protokolu PulseNet a vyhodnocena pomocí softwaru BioNumerics verze 5.1. [13]

VÝSLEDKY

Celkem bylo během daného období do naší laboratoře doručeno 688 kmenů suspektních salmonel, u 5 kmenů byla prokázána příslušnost k jinému rodu. Získaný soubor izolátů salmonel tvořil každý rok od 12 do 16 % všech humánních izolátů hlášených z Jihomoravského kraje. Počty izolátů salmonel přijatých k typizaci v jednotlivých letech jsou zobrazeny v grafu 1.

Sérotypizace

Celkem jsme ve sledovaném souboru detekovali 28 různých sérotypů salmonel. Četnost sérotypů v procentech je uvedena v tabulce 1 a počty sérotypů jiných než Enteritidis, Typhimurium a monofazické 4,[5],12:i:- jsou sumarizovány v tabulce 2.

Fágová typizace

U 493 kmenů sérotypu Enteritidis, 97 kmenů sérotypu Typhimurium a 22 kmenů sérotypu 4,[5],12:i:- byla provedena fágová typizace. Nejčetnějšími fágovými typy u S. Enteritidis byly PT8, PT21c, PT4b, PT13a, PT6c (graf 2). Také byl evidován výskyt pro Českou republiku vzácnějšího fágového typu PT3. Celkem bylo během sledované doby detekováno 25 různých fágových typů. U S. Typhimurium pak mezi nejčetnější patřily fágové typy DT104, DT141, DT120, DT193 (graf 3). Celkem bylo detekováno 13 různých fágových typů. U monofazické varianty dominoval fágový typ DT193, byl potvrzen u více než 90 % všech kmenů tohoto sérotypu.

Rezistence k antimikrobiálním látkám

U 175 kmenů byl proveden test rezistence k antimikrobiálním látkám. V grafu 4 je znázorněna míra rezistence u vybraných izolátů podle sérotypů, graf 5 zobrazuje rezistenci kmenů salmonel podle jednotlivých antimikrobiálních látek.

Makrorestrikční analýza a PFGE

Vybrané salmonely vzácně se vyskytujících sérotypů byly analyzovány metodou makrorestrikční analýzy. Detekované pulsní profily byly porovnány programem BioNumerics a jsou uvedeny v tabulce 3.

DISKUSE

V letech 2009–2012 jsme v naší laboratoři typizovali 683 humánních kmenů salmonel z Jihomoravského kraje. V souladu s celorepublikovými daty byla zjištěna stálá dominance sérotypu Enteritidis [1], v průběhu sledovaného období však byl zaznamenán postupný pokles výskytu tohoto sérotypu z původních 73 % na 56,6 %. Tento pokles může být způsoben pozitivními změnami v chovech nosnic, souvisejícími s národním ozdravným programem probíhajícím od roku 2009 [14]. Zaznamenaný vzestupný trend v četnosti výskytu ostatních sérotypů může být způsoben tím, že se v šíření salmonel stále více uplatňuje jako vehikulum salmonelových infekcí vedle vajec i drůbeží maso. A právě v chovech brojlerů je popisováno širší spektrum sérotypů salmonel než u nosnic [2].

Sérotyp Typhimurium si v průběhu sledovaných let udržel zhruba stejnou četnost, u jeho monofazické varianty 4,[5],12:i:- došlo podle očekávání, zřejmě zejména díky zlepšení diagnostiky, k postupnému nárůstu v četnosti.

Mezi 28 detekovanými sérotypy, byly i takové, jenž byly spojené s lokálními (9,12:l,v:-, Mikawasima) i nadnárodními epidemiemi (Urbana, Stanley) [15, 16]. Sérotyp 9,12:l,v:- byl v na území České republiky detekován vůbec poprvé, a to v roce 2011 [17].

Zajímavý je také výskyt sérotypu defektního v první bičíkové fázi S. 6,7:-:1,5. Ve stejných letech byl tento sérotyp několikrát detekován u prasat (laboratorní data). Otázkou je, zda bude časem stejně úspěšný jako monofazická S. 4,[5],12:i:-, která je taktéž spojována s chovy prasat [18]. Fágová typizace u sérotypu Enteritidis potvrdila i po letech výsledky studie z roku 2008, a to, že PT8 je stále nejhojněji se vyskytujícím fágovým typem na našem území [19]. Ovšem v roce 2012 došlo i u něj ke snížení četnosti a naopak zvýšení četnosti fágových typů PT21c, PT14b a PT6c.

Naproti tomu u sérotypu Typhimurium došlo k poměrně dramatické proměně výskytu jednotlivých fágových typů v průběhu let. V letech 2009 a 2010 dominoval k antimikrobiálním látkám citlivý fágový typ DT141, který se v 90. letech minulého století podílel na jedné z největších salmonelových epidemií v České republice a který byl potvrzen také v uzených makrelách zpracovaných v potravinářském podniku v Jihomoravském kraji, jenž byly vehikulem této nákazy. Posléze tento fágový typ zcela vymizel a byl nahrazen většinou multirezistentním fágovým typem DT104. Tento typ se na našem území i v zahraničí vyskytoval v 90. letech 20. století, nicméně v poslední době je také na ústupu [20].

U monofazické salmonely 4,[5],12:i:- se výrazná dominance fágového typu DT193 v průběhu let neměnila.

Jak vyplývá z testování rezistence k antimikrobiálním látkám, tak i u rodu Salmonella dochází ke zvyšování míry rezistence, což potvrzuje i nedávná studie autorů Žemličková et al. [21]. Nicméně je potřeba rezistence k antimikrobiálním látkám posuzovat u jednotlivých sérotypů odděleně, protože u sérotypu Enteritidis jsou rezistence k antimikrobiálním látkám vzácné, kdežto u sérotypů Typhimurium a monofazické 4,[5],12:i:- je multirezistence běžným jevem. Z grafu 3 je znatelné, že typickou kombinací rezistencí je tetrarezistence ASSuTe (monofazické kmeny) a pentarezistence ACSSuTe (Typhimurium DT104). Nicméně jsme mohli pozorovat i zvýšení počtu kmenů rezistentních ke kyselině nalidixové, a to především u sérotypu Infantis, jehož výskyt je opět spojen s chovy drůbeže. Gen rezistence k chinolonům může být nesen na plasmidu, tudíž může snadno docházet k jeho  horizontálnímu šíření mezi dalšími střevními bakteriemi, zejména z čeledi Enterobacteriaceae [22, 23].

Pulsní gelová elektroforéza byla použita u kmenů, které vykazovaly pravděpodobnou epidemickou souvislost. Pomocí této metody byly v roce 2012 odhaleny v Jihomoravském kraji tři lokální epidemie způsobené vzácnými sérotypy Mikawasima, Indiana a monofazickou variantou S. 9,12:l,v:-. Izoláty těchto sérotypů byly v roce 2012 získány také z non-humánních zdrojů (laboratorní data). U sérotypu Mikawasima byly ovšem u humánních izolátů odhaleny dva různé pulsní profily, což naznačuje, že se na našem území vyskytly minimálně dvě klonální linie. Celoevropská epidemie způsobená sérotypem Stanley se taktéž dotkla České republiky. V rámci této studie bylo typizováno 5 izolátů S. Stanley humánního původu. Jejich antibiotický i pulsní profil tyto izoláty taktéž přiřadil k probíhající epidemii. Vzhledem k tomu, že ve stejném roce jsme v naší laboratoři také typizovali izoláty sérotypu Stanley non-humánního původu se stejným pulsním profilem, je jasné, že tento sérotyp pronikl do potravního řetězce v České republice a je otázkou, zda dojde k jeho vymizení nebo se stane běžně detekovaným sérotypem. Pulsní profil S. Urbana byl také zkoumán na základě možné souvislosti s nadnárodní epidemií, která se nakonec ukázala jako skutečná [15].

ZÁVĚR

V této studii bylo v průběhu let 2009–2012 typizováno 683 humánních kmenů salmonel pocházejících z Jihomoravského kraje. Dvacet osm detekovaných sérotypů ukazuje na poměrně velkou heterogenitu v rámci rodu Salmonella a také na různé cesty přenosu. Salmonella Enteritidis je stále dominujícím sérotypem, přestože jeho podíl v posledních letech klesá. Následuje sérotyp Typhimurium a jeho monofazická varianta. Fágová typizace ukázala některé změny v trendech ve zkoumaném časovém období, především u sérotypu Typhimurium, u kterého došlo k úspěšnému rozšíření multirezistentního fágového typu DT104 a v poslední době opět k poklesu jeho výskytu. Vysoké procento multirezistentních kmenů u sérotypů Typhimurium a 4,[5],12:i:- poukazuje na nutnost obezřetného přístupu při používání antimikrobiálních látek. Odhalení tří lokálních epidemií zdůrazňuje užitečnost pečlivé typizace kmenů a nutnost spolupráce rutinních mikrobiologických laboratoří s epidemiology.

Poděkování: Studie byla finančně podpořena projektem AdmireVet CZ.1.05/2.1.00/01.0006 a MZE0002716202.

Na tomto místě bychom rádi poděkovali RNDr. Evě Pakrové Plíškové a Mgr. Kateřině Manové z firmy IFCOR-99 a Mgr. Martinu Vrbovi z FN Bohunice za poskytování kmenů. Bez jejich spolupráce by tuto studii nebylo možné uskutečnit.

Do redakce došlo dne 20. 12. 2013.

Adresa pro korespondenci:

Mgr. Petra Myšková

Výzkumný ústav veterinárního lékařství

Hudcova 70

6210 00 Brno

e-mail: myskova@vri.cz