Analýza těkavých plynů ve vydechovaném vzduchu u nemocných s idiopatickými střevními záněty

Analysis of volatile compounds in the breath of patients with inflammatory bowel diseases

Introduction:
All tests currently used in clinical diagnostics and the activity monitoring of inflammatory bowel disease (IBD) have limited sensitivity and specificity or are directly linked to discomfort or risk to the patient (endoscopy or repeated CT tests), therefore necessitating new, non-invasive methods. The quantification of volatile metabolites in breath is a potential biomarker of IBD presence and activity. Selected ion flow tube mass spectrometry (SIFT-MS) is a relatively new analytical technique for quantitative analysis of the trace gases, chiefly in human breath.

Methods and subjects:
In our pilot project, SIFT-MS was used for the analysis of volatile IBD biomarkers in breath. Differences in their concentrations were studied in relation to the presence of IBD and activity of the disease. The study sample was composed of 48 IBD patients, 28 with ulcerative colitis (UC) and 20 with Crohn’s disease (CD). Of the 48 patients, 25 were female and 23 male. The mean age was 30 years and the mean disease duration was 10 years.

Results:
Significant differences between subgroups of patients were found in the concentrations of pentane, carbon disulphide, acetone and propanol. Patients with CD (both with active and quiescent disease) had significantly higher concentrations of pentane compared to the group of healthy individuals (115 vs. 61 nmol/mol; p < 0.01), as was the case for patients with active UC (91 vs. 61 nmol/mol; p < 0.01). The concentration of carbon disulphide (H2S) was significantly higher in patients with active CD (111 vs. 50 nmol/mol; p < 0.01) and concentrations of acetone (1,495 vs. 509 nmol/mol; p < 0.01) and propanol were significantly higher in the breath of patients who had undergone colonoscopy prior to breath analysis (this was likely due to a lack of nutrition).

Conclusions:
Based on the results of this study, we consider the use of breath testing using SIFT-MS to be a beneficial non-invasive diagnostic and monitoring method for IBD activity. Further targeted studies are necessary to address this issue.

Key words:
inflammatory bowel disease – biomarkers –volatile organic compounds – breath analysis – selected ion flow tube mass spectrometry – SIFT-MS

Autoři: Luděk Hrdlička ¹; K. Dryahina ²; D. Ďuricová ¹ ; M. Bortlík ¹; N. Machková ¹; P. Španěl ²; M. Lukáš ^1,3
Působiště autorů: Klinické a výzkumné centrum pro střevní záněty, ISCARE Lighthouse a 1. LF UK v Praze ¹; Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského, AV ČR ²; Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky, 1. LF UK v Praze ³
Vyšlo v časopise: Gastroent Hepatol 2012; 66(2): 125-130
Kategorie: IBD: původní práce

Souhrn

Úvod:
Všechny dostupné metody používané v současnosti v diagnostice a monitoraci aktivity idiopatických střevních zánětů (IBD) mají omezenou senzitivitu a specificitu (RTG metody, biomarkery) nebo jsou přímo spojené s dyskomfortem či přímo se zdravotním rizikem pro pacienta (opakované endoskopie a CT vyšetření). Proto je legitimní snahou hledat nové neinvazivní diagnostické metody. Analýza koncentrace těkavých stopových metabolitů v dechu je potenciálním markerem v diagnostice IBD a monitoraci aktivity onemocnění. Hmotnostní spektrometrie v proudové trubici s vybranými ionty (SIFT-MS) je nová metoda pro kvantitativní analýzu stopových plynů zejména v lidském dechu.

Metody a soubor pacientů:
V naší pilotní studii bylo SIFT-MS užito pro analýzu přítomnosti těkavých biomarkerů IBD v dechu pacientů, rozdíly v jejich koncentracích byly zkoumány ve vztahu k přítomnosti IBD a aktivitě choroby. Soubor tvořilo celkem 48 IBD pacientů, 28 s ulcerózní kolitidou (UC) a 20 s Crohnovou chorobou (CD) (25 žen a 23 mužů), průměrný věk pacientů byl 30 let a délka trvání choroby 10 let.

Výsledky:
Významné rozdíly mezi podskupinami pacientů byly zjištěny v koncentracích pentanu, sirouhlíku, acetonu a propanolu: koncentrace pentanu byla signifikantně zvýšena u pacientů s CD (aktivní i v remisi) oproti kontrolní skupině zdravých jedinců (115 vs 61 nmol/mol; p < 0,01) stejně jako u nemocných s aktivní UC (91 vs 61 nmol/mol; p < 0,01). Koncentrace sirouhlíku byla signifikantně zvýšena u pacientů s aktivní CD (111 vs 50 nmol/mol; p < 0,01) a konečně koncentrace acetonu (1 495 vs 509 nmol/mol; p < 0,01) a propanolu byly signifikantně zvýšeny u pacientů, kteří v den měření absolvovali kolonoskopii (pravděpodobný podíl lačnění).

Závěr:
Na základě výsledků našeho pilotního projektu považujeme užití dechové analýzy pomocí SIFT-MS za přínosné v neinvazivní diagnostice a monitoraci aktivity IBD. Další cílené studie této problematiky jsou nutné.

Klíčová slova:
nespecifické střevní záněty – biomarkery – těkavé organické sloučeniny – dechová analýza – hmotnostní spektrometrie v proudové trubici s vybranými ionty – SIFT-MS

Ulcerozní kolitida (UC) a Crohnova choroba (CD) jsou hlavní fenotypové projevy idiopatických střevních zánětů (IBD), které postihují zejména tlusté a tenké střevo. Etiologie a patogeneze těchto chorob není stále jednoznačně objasněna. Obě choroby významně zhoršují kvalitu života a mají pro své nositele negativní socioekonomický dopad [1]. Všechny dostupné léčebné postupy, medikamentozní i chirurgické [2], mohou sice zlepšit symptomatologii pacientů, doposud však nebyla objevena léčba kauzální. Endoskopie (ileokolonoskopie, enteroskopie a gastroskopie), CT nebo MRI enterografie a sonografie jsou v současné době dominující metody v diagnostice a diferenciální diagnostice IBD [3]. Pro stanovení optimálního plánu terapie a dispenzarizace pacienta je nezbytné pravidelné klinické monitorování aktivity choroby, sledování hladiny biologických markerů (sérový CRP, fekální kalprotektin) a provedení zobrazovacích (RTG) a endoskopických vyšetření. Všechny v současné době užívané testy mají určité limitace: omezenou senzitivitu (CRP, RTG metody), specificitu (CRP, kalprotektin, zobrazovací metody), některé z nich přináší pacientovi navíc dyskomfort či přímo zdravotní riziko (endoskopie, RTG metody). Proto je třeba hledat nové a přesné neinvazivní metody pro diagnostiku a monitoraci aktivity IBD.

Zánětlivé změny při IBD způsobují ve střevní sliznici oxidativní stres, jehož důsledkem je degradace buněčných membrán cestou lipidové peroxidace [4,5]. Těkavé organické sloučeniny [6], včetně alkanů [7], které při tom vznikají, jsou transportovány krví do plic a zde exhalovány [8,9]. Tyto těkavé látky lze nově v dechu nemocných kvantitativně stanovovat pomocí hmotnostní spektrometrie v proudové trubici s vybranými ionty (SIFT-MS). V literatuře nacházíme ojedinělé studie, které k diagnostice stopových sloučenin používaly méně senzitivní dechové analyzátory. Rozsáhlejší práce na reprezentativním počtu pacientů dosud nebyly publikovány. Bodelierova studie z r. 2009 [6] naznačuje použitelnost nejméně šesti těkavých sloučenin v diagnostice IBD.

Hlavním cílem našeho pilotního projektu bylo ověření možnosti využití analýzy dechu pomocí hmotnostní spektrometrie v proudové trubici s vybranými ionty (SIFT-MS) v diagnostice a monitoraci aktivity UC a CD. Primárně bylo nutné identifikovat specifické organické těkavé sloučeniny v dechu nemocných, které mohou být vhodným biologickým markerem přítomnosti a aktivity IBD. Následně byly statistickou analýzou naměřených koncentrací určených sloučenin v jednotlivých skupinách pacientů (UC/CD, aktivní a neaktivní choroba, kontrolní skupina bez IBD) posouzeny rozdíly v koncentracích jednotlivých vydechovaných látek.

Metodika

Analýza dechu byla provedena během měření v Klinickém a výzkumném centrum pro střevní záněty ISCARE Praha v listopadu a prosinci 2011. Studie byla provedena ve spolupráci s pracovníky oddělení spektroskopie Ústavu fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR. Tento tým má rozsáhlé zkušenosti s vývojem SIFT-MS a její aplikací v plynové analýze včetně výzkumu v biomedicíně. Analýza byla provedena přístrojem Profile 3, který byl po dobu měření umístěn v centru ISCARE. Studie byla schválena místní etickou komisí a všichni pacienti podepsali informovaný souhlas.

Do souboru bylo zahrnuto celkem 48 IBD pacientů. Jednalo se o 20 nemocných s CD (9 klinicky aktivních, 11 v remisi) a 28 pacientů s UC (15 klinicky aktivních, 13 v remisi). Pro zhodnocení aktivity choroby bylo použito Harvey-Bredshaw indexu (HBI) u CD a parciálního Mayo skóre (PMS) u UC. Žen bylo v našem souboru 25 (52 %), mužů pak 23 (48 %), průměrný věk pacientů byl 30 let a průměrná doby trvání choroby 10 let. Kontrolní skupinu tvořilo 33 zdravých jedinců průměrného věku 22 let bez IBD onemocnění. Analýza vydechovaného vzduchu byla provedena přímým odběrem vzorku s okamžitým vyhodnocením iontových signálů. Získaná data byla zpracována použitím standardních deskriptivních metod – průměr (± SD) nebo medián pro spojitá data, procentuální zastoupení pro kategorická data. Rozdíly v koncentraci identifikovaných těkavých látek mezi jednotlivými skupinami byly porovnány pomocí parametrických (nepárový t-test), na hladině významnosti p < 0,05.

Cílem následujícího odstavce je velice stručně nastínit princip metody SIFT-MS, další podrobnosti jsou uvedeny v citované literatuře [10,11]. Mikrovlnný doutnavý výboj ve vzduchu vytváří směs kladných iontů, ze které jsou pomocí kvadrupolového hmotnostního filtru vybrány ionty s danou hodnotou poměru hmotnosti k náboji, m/z. Tyto prekurzorové ionty, H₃O⁺ (m/z 19), NO⁺ (m/z 30) nebo O₂⁺ (m/z 32) jsou vstřelovány do helia proudícího jako nosný plyn proudovou trubicí. Kontinuální proud vzorkovaného vzduchu je přimísen do tohoto nosného plynu pomocí kalibrované vyhřívané kapiláry a reaguje zde s prekurzorovými ionty unášenými konvekcí nosného plynu helia. Vyhřívání vzorkovací kapiláry na 70 °C zabraňuje kondenzaci vodní páry a jiných látek na jejím vnitřním povrchu. Prekurzorové ionty reagují s molekulami stopových plynů a těkavých látek během definovaného reakčního času určeného délkou proudové trubice a čerpací rychlostí vývěvy odsávající nosný plyn s příměsí vzorku z proudové trubice. Tyto reakce vedou pro jednotlivé stopové látky k tvorbě charakteristických produktových iontů, jejichž hmotnost umožňuje identifikaci látek a jejich počet detekovaný násobičem hmotnostního spektrometru v časovém intervalu desetin sekundy slouží pro výpočet koncentrace látek přítomných ve vzorku. Analytický hmotnostní spektrometr umožňuje pořízení hmotnostních spekter v rozsahu m/z od 10 do 300. Zjednodušené schéma SIFT-MS je znázorněno na obr. 1. Data získaná pro přímou analýzu dechu mají podobu časových profilů koncetrací získaných v režimu „multiple ion monitoring (MIM)“, blíže viz [11]. Příklad typického výsledku analýzy tří po sobě jdoucích výdechů jednoho pacienta je znázorněn na obr. 2.

Zjednodušené schéma SIFT-MS.
Fig. 1. A simplified schematic of SIFT-MS. — **Obr. 1. Zjednodušené schéma SIFT-MS. Fig. 1. A simplified schematic of SIFT-MS.**

Časová závislost koncentrací několika látek vyhodnocených během přímého vzorkování tří výdechů stejného pacienta s IBD. Koncentrace jsou uvedeny na logaritmické stupnici v jednotkách nmol/mol (ppb). Průměrné hodnoty koncetrací pro účely následné statistické analýzy jsou získány numerickou integrací uvnitř intervalů vyznačených svislými čárkovanými přímkami.
Fig. 2. A time ratio of the concentrations of selected volatile metabolites in breath measured during the direct sampling of three breaths of the same IBD patient. Concentrations are given on logarithmic scale in nmol/mol (ppb) units. Mean concentrations of particular metabolites for the purposes of subsequent statistical analysis are obtained through numerical integration within intervals demarcated using vertical dashed lines. — Obr. 2. Časová závislost koncentrací několika látek vyhodnocených během přímého vzorkování tří výdechů stejného pacienta s IBD. Koncentrace jsou uvedeny na logaritmické stupnici v jednotkách nmol/mol (ppb). Průměrné hodnoty koncetrací pro účely následné statistické analýzy jsou získány numerickou integrací uvnitř intervalů vyznačených svislými čárkovanými přímkami. Fig. 2. A time ratio of the concentrations of selected volatile metabolites in breath measured during the direct sampling of three breaths of the same IBD patient. Concentrations are given on logarithmic scale in nmol/mol (ppb) units. Mean concentrations of particular metabolites for the purposes of subsequent statistical analysis are obtained through numerical integration within intervals demarcated using vertical dashed lines.

Výsledky

Průměrné koncentrace jednotlivých látek přítomných v dechu pacientů jsou uvedeny v tab. 1. Převážná část látek nevykazuje statisticky významné rozdíly mezi skupinami pacientů. U některých metabolitů jsme ovšem pozorovali podstatné rozdíly v jejich koncentraci v závislosti na diagnóze a aktivitě střevního zánětu. Pentan je významně zvýšený u pacientů v aktivní i klidové fázi CD (115 vs 61 nmol/mol; p < 0,01) a u pacientů s aktivní UC charakterizované indexem aktivity (parciální Mayo skore) vyšším než 3 (91 vs 61 nmol/mol; p < 0,01). V porovnání se zdravými kontrolami je sirouhlík (CS₂) významně zvýšený (111 vs 50 nmol/mol; p < 0,01) u CN pouze u aktivních pacientů s indexem aktivity (Harvey-Bradshaw) vyšším než 3.

Průměrné koncentrace jednotlivých látek přítomných v dechu pacientů.
Tab. 1. Mean concentrations of individual substances present in patient’s breath. — **Tab. 1. Průměrné koncentrace jednotlivých látek přítomných v dechu pacientů. Tab. 1. Mean concentrations of individual substances present in patient’s breath.**

Zajímavé bylo zjištění, že je nápadný vliv lačnění a přípravy střeva před koloskopickým vyšetřením na složení dechu. Aceton je signifikantně zvýšen u skupiny, která prodělala koloskopické vyšetření v den provedení dechového testu ve srovnání s ostatními pacienty (1 495 vs 509 nmol/mol; p < 0,01). Podobné zvýšení bylo pozorováno pro propanol. Zvýšená koncentrace acetonu byla pozorována také u tří pacientů bez koloskopie.

Diskuze

Již po staletí je známou skutečností, že zápach lidského dechu může být v některých případech indikátorem nebo symptomem chorobného stavu. Nástroje k přesnému měření koncentrace sloučenin v dechu obsažených jsou však k dispozici jen několik málo let. Vývoj vhodných technik použitelných k přesné kvantifikaci stopových plynů ve vydechovaném vzduchu byl rozhodujícím krokem k realizaci využití této myšlenky v biomedicíně – v diagnostice a terapeutické monitoraci [12,13]. V lidském dechu jsou přítomny rozličné těkavé sloučeniny v miniaturních koncentracích, které se pohybují od 1 : 10⁶ (10 nmol/mol; parts per milion) až po 1 : 10⁹ (1 nmol/mol; parts per bilion) molekul vzduchu. Od původních studií, které využívaly techniku plynové chromatografie, bylo zřejmé, že ve vydechovaném vzduchu existují stovky různých těkavých sloučenin [14], ale pouze malá část z nich byla doposud identifikována a ještě méně jich bylo kvantifikováno. V současné době je také zcela zřejmé, že část těchto sloučenin je exogenního původu a do lidského organizmu se dostala plícemi při dýchání nebo přestupem přes kožní nebo střevní slizniční bariéru. Je také patrné, že velká část těchto těkavých sloučenin se vyskytuje ve stopových koncentracích i v dechu zcela zdravých jedinců, zatímco koncentrace některých jiných látek je významně zvýšena v dechu pacientů s určitými chorobami. Dobře známým příkladem takového stopového biomarkeru je aceton způsobující sladký (ovocný) zápach dechu pacientů s dekompenzovaným diabetem [15,16]. Dalšími příklady takových biomarkerů jsou amoniak u ledvinné nedostatečnosti, oxid dusný u astmatu a ethan nebo pentan u oxidačního stresu [12]. Spektrum detekovaných sloučenin je velmi široké, od dvojatomového oxidu dusného, přes metan a amoniak [17], až po molekuly, jako jsou metanol, etanol, propanol, aldehydy (včetně acetaldehydu), aceton a jiné ketony. V komplexu vydechovaného vzduchu se vyskytuje i velmi malý podíl úhlovodíků s C4–C12 řetězcem a mnohé další druhy organických sloučenin. Vývoj nových technik přináší další analytické možnosti v identifikaci a stanovení koncentrace stopových plynů a hledání nových biomarkerů v dechu. Nicméně pouze u několika málo molekul bylo dosaženo spolehlivého a přesného měření koncentrace. V případě pozitivní identifikace specifického biomarkeru ve výzkumu může být monitorace jeho koncentrace využita pro klinickou diagnostiku. Z experimentálního diagnostického přístroje může být vyvinut klinicky ověřený diagnostický přístroj pro monitoraci jednoho specifického biomarkeru. V případě oxidu dusného (N₂O) jako biomarkeru astmatu trval vývoj klinicky ověřeného příručního diagnostického přístroje více než 10 let od objevení NO v dechu astmatiků v roce 1991 [18]. V současné době je již tento přístroj standardně užíván v ordinacích pneumologů a alergologů [19].

Hmotnostní spektrometrie v proudové trubici s vybranými ionty, SIFT-MS [10,11] představuje poměrně novou analytickou techniku pro okamžité a přesné měření koncentrací stopových plynů a par ve vzduchu a lidském dechu. Tato metoda používá chemickou ionizaci v přístroji SIFT a je založená na původních experimentech provedených v roce 1995 [20]. Výhody použití této metody pro dechové testy spočívají zejména v její neinvazivnosti, jednoduchosti, rychlosti a bezbolestnosti. Konkrétní přínos SIFT-MS pro analýzu dechu je v tom, že umožňuje přesnou kvantifikaci několika stopových plynů přítomných v lidském dechu současně, a to v koncentracích v současnosti nad 10 nmol/mol (tj. jedna molekula látky na sto milionů molekul vzduchu). Kromě analýzy dechu je možno tuto metodu použít pro rozbor těkavých látek vypařovaných z kapalin jako moč nebo sérum. Ve světě v současnosti probíhá několik výzkumných programů zaměřených na použití SIFT-MS pro diagnostiku konkrétních nemocí (cystická fibróza, rakovina plic a jícnu, kardiovaskulární nemoci a další).

Předchozí studie zabývající se možnostmi využití exhalovaných a střevních plynů v IBD diagnostice ukazují, že by se mohlo jednat o slibné téma výzkumu, rozsáhlejší práce na reprezentativním počtu pacientů dosud nebyly publikovány. Recentní práce Bodeliera [6] zahrnuje víceméně semikvantitativní analýzu vydechovaného vzduchu a prokázala nejméně šest těkavých sloučenin perspektivně použitelných v diagnostice IBD.

Zvýšená koncentrace acetonu ve vydechovaném vzduchu je způsobena nedostatečnou výživou, a to buď akutně kvůli přípravě na kolonoskopické vyšetření anebo také v důsledku aktivity IBD. Zvýšená koncentrace pentanu je způsobená zánětlivým procesem a potvrzuje předchozí výsledky stanovené pomocí jiných analytických metod [4,5,7–9].

Výsledky našeho pilotního projektu přináší velmi nadějné výsledky opravňující považovat metodu za perspektivně přínosnou v diagnostice i monitorování aktivity choroby u chronických střevních onemocnění. Vysoká koncentrace pentanu je signifikantní pro přítomnost CD. Identifikované sloučeniny a výsledky měření jsou dobrým základem pro design dalších, tentokrát již cílených projektů, které musí nutně následovat. Jejich výsledkem by mělo být vytvoření reprodukovatelného protokolu odběru vydechovaného vzduchu a určení prediktivní hodnoty identifikovaných těkavých organických sloučenin v neinvazivní diagnostice a monitoraci aktivity IBD. V neposlední řadě plánujeme ověřit původ těchto látek ve střevním plynu jeho analýzou při koloskopii a komparací získaných dat s plynem exhalovaným.

Dále bude nutné standardizovat dietní přípravu před dechovým testem – v prováděné studii byl pouze vyloučen alkohol den před a v den provedení dechového testu a dlouhodobá restrikce příjmu potravy, získaná data (koncentrace acetonu a propanolu jsou signifikantně zvýšené u pacientů, kteří v den dechového testu absolvovali kolonoskopické vyšetření) však ukazují i na vliv byť jen krátkodobého lačnění při přípravě k endoskopickému vyšetření.

Závěr

Na základě výsledků našeho pilotního projektu považujeme užití dechové analýzy pomocí SIFT-MS za perspektivní a přínosné v diagnostice a monitorování aktivity IBD. Signifikantní rozdíly v koncentracích několika sledovaných metabolitů přinášejí slibné vyhlídky na budoucí užití metody v neinvazivním sledování pacientů s IBD. Další studie by měly ověřit použitelnost metody v klinické praxi a zkoumat původ těchto stopových metabolitů.

Projekt byl realizován s podporou nadačního fondu IBD – Comfort.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Doručeno: 10. 1. 2012

Přijato: 31. 1. 2012

MUDr. Luděk Hrdlička

Klinické a výzkumné centrum pro střevní záněty, ISCARE a 1. LF UK v Praze

Jankovcova 1569/2C

170 04 Praha 7

ludek.hrdlicka@post.cz

Zdroje

1. Lukas M, Bortlik M, Maratka Z. What is the origin of ulcerative colitis? Still more questions than answers. Postgrad Med J 2006; 82(972): 620–625.

2. Hanauer SB, Sandborn WJ, Rutgeerts P et al. Human anti-tumor necrosis factor monoclonal antibody (adalimumab) in Crohn's disease: the CLASSIC-I trial. Gastroenterology 2006; 130(2): 323–332.

3. Kirsner J, Sartor R, Sandborn W. Kirsner's inflammatory bowel diseases 6-th edition. Edtion ed.: Saunders 2004.

4. Kokoszka J, Nelson RL, Swedler WI et al. Determination of inflammatory bowel-disease activity by breath pentane analysis. Dis Colon Rectum 1993; 36(6): 597–601.

5. Ondrula D, Nelson RL, Andrianopulos G et al. Quantitative-determination of pentane in exhaled air correlates with colonic inflammation in the rat colitis model. Dis Colon Rectum 1993; 36(5): 457–462.

6. Bodlier A, Pierik MJ, Dallinga JW et al. Analysis of Volatile Organic Compounds in Exhaled Air As a Non Invasive Biomarker for Inflammatory Bowel Disease (IBD). Gastroenterology 2009; 136(5): A35.

7. Sedghi S, Keshavarzian A, Klamut M et al. Elevated breath ethane levels in active ulcerative-colitis – evidence for excessive lipid-peroxidation. Am J Gastroenterol 1994; 89(12): 2217–2221.

8. Pelli MA, Trovarelli G, Capodicasa E et al. Breath alkanes determination in ulcerative colitis and Crohn's disease. Dis Colon Rectum 1999; 42(1): 71–76.

9. Probert CSJ, Ahmed I, Khalid T et al. Volatile Organic Compounds as Diagnostic Biomarkers in Gastrointestinal and Liver Diseases. J Gastrointestin Liver Dis 2009; 18(3): 337–343.

10. Smith D, Spanel P. Selected ion flow tube mass spectrometry (SIFT-MS) for on-line trace gas analysis. Mass Spectrom Rev 2005; 24(5): 661–700.

11. Spanel P, Smith D. Progress in SIFT-MS; breath analysis and other applications. Mass Spectrom Rev 2011; 30(2): 236–267.

12. Amann A, Smith D. Breath Analysis for Clinical Diagnosis and Therapeutic Monitoring. In. Singapore: World Scientific 2005: 536.

13. Smith D, Spanel P. The challenge of breath analysis for clinical diagnosis and therapeutic monitoring. Analyst 2007; 132(5): 390–396.

14. Miekisch W, Schubert JK, Noeldge--Schomburg GFE. Diagnostic potential of breath analysis – focus on volatile organic compounds. Clin Chim Acta 2004; 347(1–2): 25–39.

15. Tasspou CN, Barnett D, Fraser TR. Breath-acetone and blood-sugar Measurements in diabetes. Lancet 1969; 1(7609): 1282–1286.

16. Turner C, Spanel P, Smith D. A longitudinal study of ammonia, acetone and propanol in the exhaled breath of 30 subjects using selected ion flow tube mass spectrometry, SIFT-MS. Physiol Meas 2006; 27(4): 321–337.

17. Hibbard T, Killard AJ. Breath Ammonia Analysis: Clinical Application and Measurement. Critical Reviews in Analytical Chemistry 2011; 41(1): 21–35.

18. Gustaffson LE, Leone AM, Persson MG et al. Endogenous nitric oxide is present in the exhaled air of rabbits, guinea pigs and humans. Biochem Biophys Res Commun 1991; 181(2): 852–857.

19. Sachs-Olsen C, Carlsen KCL, Mowinckell P et al. Diagnostic value of exhaled nitric oxide in childhood asthma and allergy. Pediat Allergy and Immunol 2010; 21(1): E213–E221.

20. Spanel P, Smith D. Selected ion flow tube: A technique for quantitative trace gas analysis of air and breath. Med Biol Eng Comput 1996; 34(6): 409–419.