Potenciál survivínu pre liečbu gynekologických tumorových ochorení

Souhrn

Cieľ práce:

Cieľom tohto článku je zosumarizovať známe fakty o survivíne, jeho vplyve na priebeh apoptózy, tumorigenézu konkrétnych typov gynekologických tumorov a možnostiach inhibície jeho aberantnej aktivity.

Typ štúdie:

Prehľadový článok.

Názov a sídlo pracoviska:

Divízia Molekulová Medicína, Martinské centrum pre biomedicínu JLF UK, Martin, Slovenská republika; Gynekologicko-pôrodnícka klinika JLF UK a UNM, Martin, Slovenská republika; Divízia Onkológia, Martinské centrum pre biomedicínu JLF UK, Martin, Slovenská republika.

Metodika štúdie:

Analýza publikácií vyhľadaných vo viacerých databázach, zameriavajúcich sa na aberantné fungovanie survivínu v rôznych, primárne však gynekologických rakovinových ochoreniach a pojednávajúcich možnostiach jeho inhibície.

Výsledky a záver:

Survivín je najmenším členom rodiny inhibítorov apoptózy (IAP). Aj napriek svojej veľkosti a príslušnosti k danej rodine, je spektrum jeho pôsobení omnoho širšie. Okrem primárnej funkcie - inhibície apoptózy sa podieľa na riadení procesu bunkového delenia, DNA reparácii a angiogenéze. Vyššie hladiny expresie survivínu sú za fyziologických podmienok späté s fetálnymi tkanivami počas intauterinného vývinu. V zdravých diferencovaných tkanivách zostávajú hladiny survivínu minimálne, v prípade rôznych typov rakovinových ochorení, vrátane gynekologických, však dochádza naopak k aberantnej expresii survivínu. Vo všeobecnosti je možné asociovať vysoké hladiny survivínu so zlou prognózou, vyššou mierou rekurencie ako aj zvýšenou rezistenciou na chemoterapiu a rádioterapiu.

Klúčové slová:

survivín, BIRC5, gyneologické tumory, apoptóza, inhibícia

ÚVOD

Survivín, kódovaný génom BIRC5, predstavuje najmenšieho člena IAP génovej rodiny, napriek tomu však zastáva v bunke viacero esenciálnych úloh. Možno ho lokalizovať v jadre aj v cytoplazme, resp. mitochondriách [10], pričom jadrový survivín by mal primárne vplývať na kontrolu bunkového delenia, zatiaľ čo cytoplazmatický survivín by mal pôsobiť primárne cytoprotektívne, teda regulovať apoptózu. Za fyziologických podmienok je v zdravých tkanivách survivín exprimovaný minimálne, mierne zvýšenú hladinu vykazujú iba T-lymfocyty, hematopoetické bunky a vaskulárne endoteliálne bunky [31]. Na druhej strane je survivín výrazne exprimovaný vo fetálnych tkanivách a v prípade rôznych rakovinových typov [2]. Survivín taktiež podlieha rôznemu zostrihu, v dôsledku čoho existuje až v podobe 6 proteínových variant [30]. Popri spomenutých funkciách sa predpokladá, že survivín zastáva dôležitú funkciu aj pri oprave DNA [43] a angiogenéze [24]. Primárne však možno o survivíne tvrdiť, že je anti-apoptotický proteín.

Apoptóza je vysoko komplexný proces, na ktorom sa podieľa množstvo faktorov vo viacerých molekulárnych kaskádach [16]. Vonkajšie faktory vedúce k apoptóze primárne iniciujú naviazanie vybraných ligandov na tzv. death receptory [1]. Vnútorne dráhy vznikajú naopak najmä v dôsledku pôsobenia stresových faktorov vo vnútri bunky [1]. Druhé menované dráhy následne vo väčšine prípadov iniciujú uvoľnenie cytochrómu c do cytozolu, čo aktivuje apoptozóm [6]. Survivín je schopný interagovať s oboma hlavnými apoptotickými dráhami [6].V prípade vnútornej aktivácie pôsobí inhibične na aktivitu cytochrómu c, ako aj kaspáz -3, -7 aj -9 [36]. Inhibícia týchto kaspáz však neprebieha v dôsledku ich priamej väzby so survivínom, ale v dôsledku interakcie survivínu a ďalšieho člena IAP rodiny – XIAP, ktorý je schopný priamej väzby na kaspázy. Survivín pôsobí ako protektor XIAP [7].

V neposlednom rade, survivín reguluje mieru apoptózy aj cestou, ktorá je nezávislá na aktivite kaspáz, a to interakciou s mitochondriálnym apoptózu indukujúcim faktorom (AIF) [26]. Zmeny v aktivite tohto faktoru sa prejavia primárne vo zvýšení miery fragmentácie DNA [26]. K prevažne aberantnej aktivácii survivínu môže dochádzať aj pôsobením rôznych rastových faktorov spriahnutých s PI3K/AKT BIRC5 bunkovou dráhou [18]. Na zmene v regulácii expresie génu v tumorových bunkách sa taktiež podieľajú zmeny v MAPK/ERK signalizácii [45] ako aj aberantná aktivita Ras a STAT3 [13]. Zároveň sa predpokladá, že aberantne aktivovaný survivín môže inhibovať apoptózu mediovanú FAS ligandom, ktorý prislúcha do TNF rodiny [37], prípadne môže inhibovať expresiu BAX [2]. Asociácia medzi mutáciami vo veľmi dôležitom tumor-supresorovom géne p53 a zvýšenou mierou expresie survivínu boli viacnásobne preukázané [42].

VPLYV SURVIVÍNU NA ROZVOJ RAKOVINY TELA MATERNICE, KŔČKA MATERNICE A VAJEČNÍKOV

Tumory tela maternice prestavujú veľmi heterogénnu skupinu ochorení. V závislosti na postihnutej vrstve tkaniva ich možno rozdeliť do dvoch hlavných skupín, na endometriálne a mezenchymálne tumory. Mezenchymálne tumory ďalej pozostávajú z relatívne bežných, benígnych leiomyómov, ako aj veľmi vzácnych, ale zároveň veľmi agresívnych malígnych typov – sarkómov [21, 38]. Hoci je survivín považovaný primárne za marker agresívnych tumorov so zlou prognózou, bola pozorovaná jeho aberantná hladina aj u leiomyómov. Konkrétne, po analýze hysterektomických vzoriek leiomyómov metódou western-blot [34] bolo preukázané, že expresia survívinu bola v ich prípade vyššia v porovnaní so zdravým myometriom.

Zaujímavým zostáva fakt, že po rádiofrekvenčnej ablácii niekoľkých myómov bolo možné pozorovať, že miera expresie survivínu zostávala priamo úmerne vyššia so vzdialenosťou od centra zásahu. Inač povedané, rádiofrekvenčná ablácia (aspoň teoreticky) znižovala hladinu expresie survivínu (minimálne na úrovni proteínov). Vo všeobecnosti, s využitím imuno-histologického značenia je možné pozorovať žiadne, respektíve minimálne hladiny survivínu v zdravých tkanivách tela maternice, zatiaľ čo u oboch – endometriál­nych karcinómov ako aj sarkómov býva hladina expresie výrazne vyššia [41]. Rovnako, RNA transkripty survivínu sú nadexprimované omnoho výraznejšie v agresívnejších tumorových typoch a čo je zaujímavé, výraznejšia miera expresie bola pozorovaná aj u rekurentných endometriálnych tumorov v porovnaní s primárnymi tumormi [41]. S vyššou mierou expresie survivínu býva asociovaná aj výraznejšia T-lymfocytová odpoveď [41]. Naopak, B-lymfocytová odpoveď nebýva pozorovaná takmer vôbec [41]. Ďalšia štúdia [19], založená na využití western-blotovej technológie preukázala, že survivín bol nadexprimovaný takmer v 90 % prípadov bunkových línií endometriálnych karcinómov. Pozoruhodne, vo väčšine týchto bunkových línií došlo k indukcii apoptózy po vyradení funkcie BIRC5 génu.

Tumory kŕčka maternice predstavujú, aj napriek veľmi rozsiahlym možnostiam prevencie na území Českej a Slovenskej republiky veľmi časté ochorenie [29]. Možno ich rozdeliť do dvoch základných skupín, na častejšie epidermoidné karcinómy a adenokarcinómy [5]. Druhé menované sú vo všeobecnosti považované za tumorové typy s horšou prognózou, schopné sa rýchlo šíriť a taktiež rezistentnejšie na chemoterapiu [5]. Možno teda očakávať, že survivín ako potenciálny marker agresívnych rakovinových typov bude výraznejšie exprimovaný práve u adenokarcinómov. Pre potvrdenie tohto predpokladu bola vykonaná imuno-histochemická esej [47]. Survivín bol podľa očakávania omnoho výraznejšie exprimovaný v prípade adenokarcinómov. Expresia survivínu taktiež korelovala s progresiou od CIN 1 lézii až po rozvinuté karcinómy. Okrem iného, CIN lézie vykazovali približne polovičnú mieru expresie survivínu oproti rozvinutým epidermoidným karcinómom kŕčka maternice [50]. Pri komparačných analýzach v rámci vzoriek cervikálnych ektropií, eskvamóznych metaplázií, cervikálnych intraepiteliálnych neoplázií ako aj rozvinutých epidermoidných karcinómov bolo pozorované [27], že zvýšena miera expresie survivínu negatívne koreluje s mierou expresie PTEN génu. Tá kontinuálne klesala od zdravého epitelu smerom ku epidermoidným karcinómom, zatiaľ čo expresia survivínu progresívne stúpala v rovnakom smere. Taktiež v prípade cervikálnych intraepiteliálnych neoplázií ako aj rozvinutých epidermoidných karcinómoch bolo imuno-histochemické značenie survivínu asociované s veľkosťou tumoru, respektíve klinickým štádiom. Ďalej, pozitívna expresia survivínu u šíriacich sa tumorov, ktoré dosiahli panvové lymfatické uzliny, bola zreteľne vyššia.

Rakovina vaječníkov je typ rakovinového ochorenia s vysokou mortalitou. Je tomu tak aj z dôvodu, že v mnohých prípadoch zostáva asymptomatická, až pokiaľ nie je dosiahnuté pokročilé štádium [3]. Neskorá diagnóza je do veľkej miery zapríčinená faktom, že každý histotyp sa môže vyskytovať v benígnej, hraničnej aj malígnej forme [49]. V prípade rakoviny vaječníkov boli pozorované rozdiely v expresii survivínu na úrovni mRNA aj proteínov [32]. Na jednej strane metóda qPCR preukázala, že miera hladiny expresie survivínu bola zvýšena (približne 5-násobne), na druhej strane western-blot preukázal ešte omnoho výraznejšie zvýšenie miery expresie (približne 100-násobne), v porovnaní so zdravým tkanivom. Tieto rozdiely vznikajú s najvyššou pravdepodobnosťou v dôsledku rozdielneho zastúpenia nukleárneho a cytoplazmatického survivínu v bunke. Vo všeobecnosti, pozitívne cytoplazmatické imunoznačenie je percentuálne častejšie ako nukleárne imunoznačenie [9]. O tom, či je však vhodnejšie ho použiť s vyššou istotou ako vhodný prognostický marker, je možné polemizovať. Každopádne, zmeny v hladine expresie, či už cytoplazmatického alebo aj nukleárneho survivínu sú vo väčšej či menšej miere charakteristické pre väčšinu vzoriek ovariálnych tumorov [32].

Zmena expresie koreluje jednak s horšou prognózou a s výskytom mucinóznych typov ovariálnych tumorov [32]. Veľmi často koreluje expresia survivínu u ovariálnych tumorov s vyššou expresiou COX2 génu [4]. Táto spojená nadexpresia je typická iba pre tumory so zlou prognózou [4]. Zvýšená miera expresie survivínu je taktiež v mnohých prípadoch rakoviny vaječníkov asociovaná s cisplatinovou/taxolovou rezistenciou [48], pričom pri aplikácii transferovaných buniek s cDNA survivínu nedochádza k zmene senzitivity na tieto agensy [48]. Naopak, aplikácia shRNA survivínu zapríčinila pozitívnu zmenu na citlivosť ovariálnych bunkových línií na paklitacel a vo všeobecnosti dochádzalo k modulácii expresie survivínu [17].

Inhibícia T-typov Ca2+ kanálov s mibefradilom [8] zapríčiňovala supresiu rastu ovariálnych tumorov, pričom súbežne dochádzalo k zvýšeniu miery apoptózy a poklesu expresie BIRC5 génu. Táto inhibícia indukovala zmeny v hladinách FOXO proteínov, ktoré môžu interferovať s promótorom survivínu. Možno teda konštatovať, že zmeny vo funkcii T-typov Ca2+ kanálov pravdepodobne ovplyvňujú proces ovariálnej tumorigenézy, profliferáciu a reguláciu bunkových dráh cestou FOXO-survivín interakcie [8].

MOŽNOSTI KLINICKEJ REGULÁCIE AKTIVITY SURVIVÍNU

Napriek tomu, že survivín predstavuje významný marker agresívnych tumorových typov, akákoľvek snaha o jeho inhibíciu na molekulárnej úrovni sa zatiaľ pohybuje prevažne iba v rovine predklinických štúdií. V prípade, že dôjde na aplikáciu týchto inhibítorov na klinickej úrovni, zväčša nie je prekonaná druhá fáza klinických skúšaní. Rovnako, väčšina vykonaných predklinických štúdií nezahŕňala bunkové línie pochádzajúce z tkanív ženského pohlavného ústrojenstva.

Najrozsiahlejšie analyzovaný a testovaný inhibítor aktivity survivínu nesie označenie YM155. Na jednej strane tento inhibítor preukázateľne nereguluje aktivitu ďalších členov IAP rodiny (konkrétne CIAP2 a XIAP), pokiaľ je aplikovaný v limitovaných koncentráciach – do 100 nM [29]. Predpokladá sa, že by nemal ovplyvňovať ani aktivitu zvyšných členov IAP rodiny mimo survivínu [22]. Na druhej strane, dostačujúca účinnosť tohto inhibítora bola preukázaná iba v rámci I. fázy klinických skúšaní. Počas II. etapy klinických skúšaní dochádzalo iba u 3 % pacientov (s diagnostikovaným III a IV štádiom melanómov) k zmenšovaniu nádorovej masy [22]. Podobne neuspokojivo dopadla aj II. etapa klinických skúšaní, ktorá zahŕňala IIIb/IV pacientov s malobunečným karcinómom pľúc. K redukcii veľkosti tumorov dochádzalo iba u 5,8% pacientov [12].

Testovanie ďalšieho syntetického inhibítoru survivínu s označením GDP366 bolo vykonané [37] na myších líniách s odstráneným týmusom (tzv. nude mouses). V prípade takejto aplikácie bolo zaznamenaných viacero pozitívnych zistení. Táto molekula bola schopná znížiť hladiny survivínu na úrovni mRNA tak aj proteínu. K inhibícii dochádzalo aj na in vitro úrovni. Pozitívne, inhibičný efekt fungoval v nezávislosti na aktivite p53 i p21. Taktiež, GDP366 indukoval polyploiditu vo viacerých rakovinových bunkových líniách, čo viedlo k zvýšenej chromozomálnej instabilite a indukovanej bunkovej senescencii cestou inhibície telomerázovej aktivity. Každopádne, klinické štúdie na humánnych objektoch stále neboli vykonané.

Oligonukleotid, identický s vybraným úsekom mínus vlákna DNA survivínu, označený ako LY2181308, v prvotných predklinických štúdiách, ako aj v I. etape klinických skúšaní vykazoval vysoký potenciál na inhibíciu survivínu, najmä z dôvodu, že preukázateľne znižoval hladiny jeho mRNA [40]. V druhej etape klinickej štúdie však bol jeho výsledný efekt výrazne nižší. Na tomto fakte sa nič nezmenilo ani po súbežnej aplikácii docletaxelu alebo prednisonu [46].

Ďalším oligonukleotidom, navrhnutým tak, aby inhiboval okrem iného aj survivín, je SPC3042. Tento inhibítor pôsobi na zastavenie bunkového rastu, zvyšuje mieru apoptózy a znižuje hladinu expresie survivínu. Tak ako v predošlých prípadoch, aj tento agens sa javil pozitívne v rámci I. etapy klinických skúšaní [14, 44], obsiahlejší výskum však doposiaľ nebol vykonaný.

Posledným syntetickým inhibítorom survivínu, ktorý bol doposiaľ testovaný iba na myších líniách nesie označenie FL118. Daný inhibítor dokáže inhibovať expresiu ako p53 nezávisly agens [25] tým, že interaguje priamo s promótorovým regiónom survivínu. Táto molekula rovnako znižovala aktivitu ďalších agensom asociovaných s rakovinovým bujnením ako Mcl-1, XIAP alebo CIAP2. Každopádne, hoci dochádzalo k výraznému zmenšovaniu tumoru po aplikácii tohto inhibítoru, dialo sa tak iba na zvieracích modeloch, teda sú nutné ďalšie klinické štúdie.

Popri syntetických inhibítoroch na zníženie aktivity survivínu možno využiť aj látky prírodného charakteru, získane z rastlinných produktov, v mnohých prípadoch bežne a ľahko dostupných. V prvom rade však treba podotknúť, že dané látky nie sú špecifické na inhibíciu survivínu a ich výsledný efekt možno považovať za sekundárny, pokiaľ nie náhodný. Relatívne bežne dostupná látka kurkumín, obsiahnutá v koreni rastliny Curcuma longa vykazoval schopnosť inhibovať survivín (v rámci predklinických štúdií), nezávisle na aktivite p53, cestou aktivácie p38/MAPK signálnej dráhy [19], respektíve inaktiváciou NF-κB a STAT3 signálnej dráhy [28]. Kurkumín vo všeobecnosti pôsobí pozitívne na priebeh programovanej bunkovej smrti, pravdepodobne v dôsledku aktivácie kaspáz -3 a -9 [28]. Resveratrol, fytoalexín prítomný v hrozne a vo víne má schopnosť inhibovať rast v bunkách napadnutých lymfotropnými vírusmi a okrem toho aj znižuje hodnoty expresie survivínu [15]. Aplikácia ďalšieho rastlinného extraktu, quercitínu zvyšuje uvoľnovanie cytochrómu c cestou TRAIL stimulácie [20]. Tento proces rezultuje v zvýšení apoptického potenciálu mitochondrií a znížení hladín expresie survivínu na úrovnimRNA. Záverom, silibinín pôsobí preukázateľne negatívne na aktiváciu MAPK/ERK signálnej dráhy, zvyšuje expresiu p53 a znižuje expresiu survivínu, minimálne v prípade ľudských Caki-1 buniek. Deje sa tak súbežne s aktiváciou kaspáz, a teda indukciou apoptózy [23].

Okrem inhibítorov na báze DNA a inhibítorov získaných z rastlinných produktov je možné na reguláciu aktivity survivínu potenciálne využiť aj krátke nekódujúce RNA, ktoré slúžia ako interferujúce agensy. Každopádne, tento postup predstavuje stále iba výzvu do budúcnosti. Doposiaľ boli zaznamenané iba čiastočné úspechy pri aplikácii siRNA pre survivín v kombinácii s cis-platinou na bunkové línie malobunečného karcinómu pľúc [11]. Po aplikácii anti-survivínovej siRNA došlo ku želanému vyradeniu aktivity génu, a teda aj zníženiu aktivity survivínu u niekoľkých bunkových línii, ktoré za normálnych okolnosti survivín výrazne exprimujú. Išlo konkrétne o bunkové línie A549, HeLa a MCF-7.

ZÁVER

Survivín predstavuje multifunkčný proteín, ktorý sa v bunkách podieľa na regulácii esenciálnych procesov. Tieto procesy zahŕňaju inhíbiciu apoptózy, reguláciu mitózy, a teda aj bunkového delenia, angiogenézu alebo DNA opravy. Za fyziologických podmienok je úloha survivínu najdôležitejšia počas intrauterinného vývinu, kedy je tento protein aj výrazne nadexprimovaný. Naopak, v diferencovaných tkanivách by mali byť hladiny expresie survivínu striktne regulované v závislosti na bunkovom cykle. K zmene tohto stavu dochádza v mnohých prípadoch rakovinových ochorení, vrátane gynekologických.

Zvýšené hladiny survivínu sú vo väčšine prípadov asociované so zlou prognózou a taktiež rezistenciou na konvenčné terapie, ako je radioterapia alebo chemoterapia. Zároveň, hladiny miery expresie sa môžu líšiť v závislosti na lokalizacii survivínu, teda či je sledovaná miera expresie nukleárneho alebo cytoplazmatického survivínu. V súčasnosti je známych viacero inhibítorov survivínu, či už ide o molekuly založené na báze DNA, krátkych nekódujúcich interferujúcich RNA alebo rastlinné extrakty. Prevažná väčšina týchto inhibítorov preukazovala dostatočné vlastnosti iba v predklinických štúdiach, respektíve počiatočných etapách klinických štúdií. Možnosť cielenej terapie s využitím inhibičných agensov survivínu teda v súčasnosti stále zostáva výzvou do budúcnosti. Vo všeobecnosti však modulácia aberantnej aktivity survivínu skrýva veľký potenciál pre zlepšenie terapii rakovinových ochorení.

Táto práca bola podporená projektom Martinské centrum pre biomedicínu - BioMed [ITMS 26220220187], grantom UK/22/2018 a grantom UK/20/2018.

RNDr. Dušan Braný

Divízia Molekulová Medicína

Martinské centrum pre biomedicínu

JLF UK

Malá Hora 4C

036 01 Martin

Slovenská republika

e-mail: brany@jfmed.uniba.sk