Srovnání vybraných parametrů oxidačního stresu ve folikulární tekutině u žen s poruchou plodnosti a u zdravých fertilních dárkyň oocytů

Souhrn

Cíl studie:
Vývoj oocytu je ovlivňován prostředím, zvláště folikulární tekutinou (FT). Narušení její homeostázy má zásadní vliv na vývojový potenciál vajíčka. Cílem této studie bylo srovnání hladin vybraných markerů oxidačního stresu ve FT žen s poruchou plodnosti a zdravých plodných dárkyň oocytů.

Typ studie:
Retrospektivní komparativní studie.

Název a sídlo pracoviště:
Lékařská fakulta v Plzni, Univerzita Karlova v Praze; Institut reprodukční medicíny a endokrinologie, IVF Centra Prof. Zech, Plzeň.

Metodika:
Ve FT byly analyzovány hladiny homocysteinu (HCy), malondialdehydu (MDA), glutathionperoxidázy (GPx), celkové antioxidační kapacity (AOK) a celkové bílkoviny (CB). Celkem bylo vyšetřeno 146 žen – 74 pacientek léčených pro neplodnost (průměrný věk 31 let, SD = 4,65) a 72 zdravých plodných žen, dárkyň oocytů (průměrný věk 26 let, SD = 4,44). U každé ženy byly použity vzorky FT ze všech folikulů dohromady, tedy ve společném poolu. Ze studie byly vyloučeny vzorky, ve kterých se vyskytla příměs krve.

Výsledky:
Studie prokázala statisticky signifikantně vyšší hladiny HCy (p < 0,0001) ve FT u zdravýchplodných žen oproti skupině s poruchou plodnosti, a to jak bez ohledu na věk, tak ve skupinách neplodných kontrol ve stejném věkovém rozmezí (u věkové skupiny mezi 20 až 29 lety jep = 0,0002, ve věku 30 až 39 let je p < 0,0001). Při rozdělení souborů do výše popsaných věkových pásem jsme prokázali statisticky signifikantně vyšší hladinu MDA u kontrolní skupiny ve věku 20 až 29 let oproti stejně starým ženám léčeným pro neplodnost (p = 0,0374) a statisticky signifikantně vyšší hodnotu AOK u neplodných žen mezi 30. až 39. rokem života oproti zdravým plodným dárkyním oocytů(p = 0,0458).

Závěr:
Přítomnost, či naopak nepřítomnost prooxidačních parametrů ve FT má důležitou úlohuve schopnosti koncepce a následném vývoji embrya.

Klíčová slova:
folikulární tekutina, homocystein, oxidační stres, neplodnost, dárkyně oocytů.

ÚVOD

Folikulární tekutina (FT) zajišťuje charakteristické mikroprostředí pro vývoj oocytu. Biochemické složení FT hraje zásadní roli pro kvalitu oocytu, zvláště pro jeho schopnost fertilizace a následný vývoj embrya. FT ovlivňuje maturaci oocytu a viabilitu embrya svým hormonálním složením, interleukiny, ale i hladinou oxidačního stresu [5, 8, 12]. Bylo prokázáno [2], že pro zdárný vývoj by lidský folikul měl být v průběhu svého zrání dostatečně chráněn vůči kyslíkovým a dusíkovým radikálům, což znamená, že by volné radikály a antioxidanty měly být v rovnováze [1]. Je známo [30], že nezastupitelnou ochranitelskou roli plní např. buňky cumulus oophorus.

Oxidační stres je definován jako nárůst koncentrace reaktivních forem kyslíku a dusíku, kdy dojde k převaze těchto volných radikálů nad účinkem endogenních antioxidantů. Jejich patologický efekt vyplývá z poškozování lipidů v buněčné membráně, nukleových kyselin, proteinů a dalších buněčných materiálů [14]. In vivo se poškozujícímu efektu volných radikálů předchází nebo je efekt limitován pomocí endogenních antioxidantů, které se podle biologické funkce dělí na enzymové, jako je např. superoxiddismutáza (SOD), glutathionperoxidáza (GPx), glutathiontransferáza (GST) nebo kataláza (KAT), a nízkomolekulární, rozpustné ve vodě nebo v tucích, jako je kyselina askorbová, tokoferoly, karotenoidy, flavonoidy, glutathion, kyselina lipoová, koenzym Q, bilirubin a kyselina močová [16]. Na možnost, že by kyslíkové radikály mohly být spojovány s lidskou reprodukcí, bylo poprvé ukázáno před sedmdesáti lety [17]. Roli volných radikálů a antioxidantů ve vztahu k ženským reprodukčním funkcím je, na rozdíl od mužských, věnována malá pozornost, ačkoliv je prokázán jak fyziologický, tak patologický efekt [13].

S oxidačním stresem úzce souvisí hladina homocysteinu (HCy). Jeho vliv na homeostázu byl nejprve studován v souvislosti s kardiovaskulárním systémem, nyní je však známo jeho široké působení i mimo tento systém, např. na ženský reprodukční systém [11].

Zvýšená hladina HCy (hyperhomocysteinémie) působí škodlivě více směry. Volné radikály pocházející z oxidace HCy jsou toxické pro cévní endotel, narušuje se koagulační kaskáda a endotel, který má za normálních okolností převážně antitrombotické vlastnosti, se stává více tromboticky aktivní [27]. Dalším negativním vlivem Hcy na cévní endotel je snížení syntézy oxidu dusnatého (NO) a jeho biologická dostupnost. NO se podílí téměř na všech fázích ženské reprodukce, jako je ovulace, implantace embrya, regulace arteriálního tlaku nebo kontrakce dělohy. Důležité je, aby fyziologické koncentrace NO byly v úzkém pásmu, protože jak nadbytek, tak nedostatek vyvolávají nežádoucí účinky při reprodukci [18].

Hladina HCy koreluje s hladinou estrogenu [20], a mění se tedy nejen v závislosti na fázi menstruačního cyklu, ale i v průběhu těhotenství, kdy dochází k jejímu snížení [10, 15, 28].

Hyperhomocysteinémie je známým rizikovým faktorem těhotenských komplikací [29]. Při folikulogenezi může zvýšená hladina HCy aktivovat apoptózu vedoucí k folikulární atrézii [11]. Byla prokázána [9] negativní korelace mezi hladinou HCy ve FT a stupněm zralosti získaných oocytů a kvalitou embrya ve třetím dni in vitro kultivace. Naopak pozitivní korelace byla popsána mezi hladinou folikulárního HCy a průměrem folikulu [6]. Hyperhomocysteinémie ovlivňuje výsledek in vitro fertilizace – u žen se zvýšenou hladinou HCy byla prokázána nižší úspěšnost v dosažení těhotenství [25].

SOUBOR ŽEN A METODIKA

Studovaný soubor tvořilo 146 žen, z toho bylo 74 pacientek (průměrný věk 31 let, SD = 4,65) léčených pro neplodnost v Institutu reprodukční medicíny a endokrinologie – IVF Center Prof. Zech. Kontrolní skupinu tvořilo 72 zdravých plodných žen, dárkyň oocytů (průměrný věk byl 26 let, SD = 4,44). V našem souboru pacientek bylo 13 žen, které kouřily 2–10 cigaret za den, ostatní byly nekuřačky. Podobně v souboru plodných dárkyň bylo 26 žen, které kouřily 5–15 cigaret za den, ostatní byly nekuřačky. Po detailním seznámení s problematikou a po podpisu informovaného souhlasu byla ženám odebírána FT v době odběru oocytů v průběhu jejich léčby neplodnosti metodami asistované reprodukce. Vyšetřovány byly pooly FT, tedy směs ze všech folikulů, u nichž nedošlo ke kontaminaci krví v průběhu odběru oocytů. Ve FT byly stanoveny hladiny homocysteinu, glutathionperoxidázy, malondialdehydu, celkové antioxidační kapacity a celkové bílkoviny.

Hladina HCy byla stanovena enzymaticky kitem Liquid Stable (LS) 2-Part Homocysteine Reagent (Axis-Shield Diagnostics Ltd., UK) na přístroji Olympus AU400. Vázaný HCy nebo ve formě dimeru (oxidovaná forma) se redukuje na volný HCy prostřednictvím tris(2-karboxyethyl)fosfinu (TCEP). Takto vzniklý volný HCy poté reaguje se serinem za katalýzy cystathionin beta-syntázou (CBS) za vzniku cystathioninu. Cystathionin je postupně rozkládán na HCy cystathionin betalyázou (CBL), kdy při tomto procesu vzniká i pyruvát a amoniak. Pyruvát se poté konvertuje pomocí laktát-dehydrogenázy (LDH) na laktát s nikotinamid adenin dinukleotidem (NADH) jakožto koenzymem. Rychlost konverze NADH na NAD+ je sledována spektrofotometricky při 340 nm a je přímo úměrná koncentraci HCy.

Malondialdehyd (MDA) a jiné degradační produkty peroxidace lipidů reagují s dvěma molekulami kyseliny thiobarbiturové (TBA) v kyselém prostředí na barevný produkt, který se po extrakci n-butanolem měří při 532 nm použitím Elisa-readeru. MDA se stanovuje jako součást sloučenin reagujících s thiobarbiturovou kyselinou, tzv. TBARS (ThioBarbituric Acid Reactive Substances). Glutathionperoxidáza (GPx) katalyzuje oxidaci glutathionu kumen hydroperoxidem. V přítomnosti glutathionreduktázy a NADPH se oxidovaný glutathion ihned redukuje, přičemž NADPH se oxiduje na NADP. Pokles absorbance se stanovuje na analyzáoru OLYMPUS AU 400 optickým testem při 340nm. GPx byla stanovena kitem RANSEL (Randox Laboratories Ltd., UK). Celková antioxidační kapacita (AOK) je definována jako schopnost vzorku zhášet volné radikály. Její stanovení je založeno na vlastnostech sloučeniny ABTS (2,2‘-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonová) kyselina), která po inkubaci s peroxidázou a peroxidem vodíku tvoří radikál ABTS+. Ten je relativně stabilní a je možné ho měřit spektrofotometricky při 600 nm. Antioxidanty FT potlačují vznik tohoto radikálu. AOK je vyjadřována jako ekvivalent standardu Troloxu (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylová kyselina), což je syntetický analog vitaminu E. Měření bylo prováděno na analyzátoru Olympus AU 400. AOK byla stanovena kitem TAS (Randox Laboratories Ltd., UK). Celková bílkovina (CB) a peptidy poskytují s biuretovým činidlem fialový komplex vhodný k fotometrickému stanovení. Absorbance byla stanovena při 546 nm na analyzátoru Olympus AU 2700 soupravou TP 300 (Lachema, CZ).

Tato studie byla schválena etickou komisí Lékařské fakulty UK v Plzni.

Statistické hodnocení

Výsledky byly statisticky hodnoceny pomocí Wilcoxonova neparametrického testu (nepárová varianta) a dále analýzou rozptylu (ANOVA, post hoc analýza pomocí Tukeyovy metody mnohonásobného porovnávání). Hodnoty p < 0,05 byly považovány za statisticky signifikantní.

VÝSLEDKY

Hladiny HCy, MDA, GPx, AOK a CB jsme porovnali ve skupinách žen léčených pro neplodnost a kontrolních plodných dárkyň oocytů. Z tabulky 1 a obrázku 1 je zřejmé, že u kontrolní skupiny žen byla naměřena signifikantně vyšší hladina homocysteinu (p < 0,0001). Tuto vyšší hodnotu jsme prokázali i při rozdělení pacientek a kontrol do jednotlivých věkových skupin – u věkové skupiny mezi 20 až 29 lety je p = 0,0002 a ve věku 30 až 39 let p < 0,0001.

Při tomto rozdělení našeho souboru jsme prokázali rovněž vyšší hladinu MDA u kontrolní skupiny ve věku 20 až 29 let (p = 0,0374) oproti neplodným ženám stejného věku a AOK u neplodných žen mezi 30. až 39. rokem života (p = 0,0458) oproti věkově stejné skupině zdravých plodných dárkyň. Úplný přehled mediánů naměřených hodnot společně se statistickou významností a interkvartilovým rozpětím shrnuje tabulka 2.

Protože plodnost žen je silně ovlivněna věkem a protože naše skupiny plodných a neplodných se liší věkovým složením, porovnali jsme ještě také hladiny mezi plodnými a neplodnými ženami stejné věkové skupiny – výsledky jsou shrnuty v tabulkách 3 a 4. Prokázali jsme zde statisticky významný rozdíl v hodnotách AOK u kontrolní skupiny zdravých dárkyň. Jak vyplývá z tabulky 4, nejvyšší hladina AOK je u žen mezi 20. až 29. rokem, u žen mladších a starších se tato hladina významně snižuje (p = 0,0450).

DISKUSE

U zdravých žen je lidský folikul během svého zrání dostatečně chráněn proti toxickému poškození v důsledku oxidačního stresu [2]. Stoupající aktivita kyslíkových radikálů může být jedním z důvodů neplodnosti i poklesu úspěšnosti IVF u žen se vzrůstajícím věkem, kdy dochází k progresivnímu poklesu kvality a kvantity oocytů [7, 31]. Toto vše může být ještě umocněno životosprávou ženy a jejím aktivním nikotinismem [26]. Na hladinu HCy má velký vliv plazmatická koncentrace folátu (kyselina listová – vitamin B₉), který po své modifikaci na tetrahydrofolát působí jako kofaktor enzymu methylentetrahydrofolát reduktázy (MTHFR) v remetylační cestě přeměny HCy na aminokyselinu methionin. Nikotin a pravděpodobně i sekundární kouř mají vliv na hladinu folátu, jehož nízká koncentrace je spojena právě s hyperhomocysteinémií. Kuřáci mají také tendenci k menší konzumaci na folát bohatého ovoce a zeleniny. Je však třeba poznamenat, že vztah mezi kouřením a hladinou folátu není jednoznačný a některé studie prokazují jejich nezávislost [22]. Tento fakt je jistě závislý také na intenzitě kouření. V naší studii jsme prokázali, že neexistuje signifikantní spojitost mezi neplodnými ženami kuřačkami a nekuřačkami ani zdravými dárkyněmi oocytů kuřačkami a nekuřačkami v žádném sledovaném parametru.

Foláty snižují hladinu HCy jak v krvi, tak ve folikulární tekutině [11], což významně koreluje jak s kvalitou oocytu, tak s vývojovým potenciálem embrya [5, 21]. I když stále probíhá diskuse [3, 23, 24] o spojitosti mezi AOK FT a etiologií infertility, je jisté, že vliv volných radikálů je zapojen do patofyziologických mechanismů mnoha chorob souvisejících s neplodností, kde je zapotřebí léčby IVF. Pacientky s endometriózou mají ve srovnání s pacientkami s jinými diagnózami statisticky signifikantně zvýšené hladiny HCy [9].

Protože hladiny HCy jsou ovlivňovány ovariální hyperstimulací [4, 6] a protože schopnost metylace souvisí s riziky metod asistované reprodukce [19], je další výzkum v této oblasti se zapojením zkoumání zdravých plodných dárkyň přínosem.

ZÁVĚR

Naše studie potvrzuje roli HCy a dalších parametrů oxidačního stresu v ženské reprodukci. Přítomnost či naopak nepřítomnost prooxidačních vlivů ve FT má důležitou úlohu ve schopnosti koncepce a následném vývoji embrya.

Tato studie je podporována projektem OP VaVpI PO 2Biomedicínské centrum CZ.1.05/2.1.00/03.0076, grantem GA UK 696212 a projekty specifického vysokoškolského výzkumu (SVV 264 808 a 264 804).

Adresa pro korespondenci:

Ing. Václav Babuška, Ph.D.

Ústav lékařské chemie a biochemie

LF UK Plzeň

Karlovarská 48

301 66 Plzeň

e-mail: vaclav.babuska@lfp.cuni.cz