Význam receptorů NK buněk u alogenních transplantací krvetvorných buněk u pacientů s akutní myeloidní leukemií

Souhrn

NK buňky hrají u alogenní transplantace kostní dřeně významnou roli, nejen při eradikaci zbývajících nádorových buněk, ale ovlivňují i rozvoj reakce štěpu proti hostiteli. Je tedy třeba porozumět jejich regulaci a tomu, jakým způsobem může reakce imunitního systému pacienta NK buňky dárce ovlivňovat. Inhibice a aktivace NK buněk je řízena celou řadou receptorů, které reagují na široké spektrum ligandů. Ať už inhibičních, které signalizují NK buňkám, že je cílová buňka v pořádku nebo aktivačních, které vyjadřují nějaké poškození cílové buňky. Mezi nejprozkoumanější receptory patří KIR a dále NKG2D se svými ligandy MICA a MICB. Přehledu jejich role v transplantaci kostní dřeně se věnuje tato práce.

Klíčová slova:

akutní myeloidní leukemie – KIR – NKG2D – MICA – MICB

ÚVOD

Akutní myeloidní leukemie (AML) je nejčetnějším typem akutních leukemií dospělých (až 80 %) [1]. Současně s tím má AML z leukemií nejkratší celkové přežití [2]. AML je v současné době vyléčitelná u 30–45 % pacientů ve věku do 60 let, ale se stoupajícím věkem úspěšnost léčby klesá až na 15–5 %.

Léčba AML spočívá v indukční chemoterapii a konsolidační terapii a u pacientů se středním a vysokým rizikem relapsu je, v případě dovolujícího zdravotního stavu pacienta, jako konsolidace indikována alogenní transplantace hematopoetických buněk (HSCT) [3,4].

Cílem HSCT je vytvoření nové nemaligní krvetvorby, která následně vede také k likvidaci reziduálních leukemických buněk. Kmenové leukemické buňky nicméně vykazují schopnost na svém povrchu nevystavovat antigeny potřebné k navození specifické odpovědi imunitního systému a unikají tak nejen chemoterapii, ale i imunitnímu dohledu [5]. V takové situaci lze využít mechanismu přirozeného imunitního systému, konkrétně NK (natural killer, přirození zabíječi) buněk, které při setkání s jinou buňkou vyhodnocují přítomnost nebo absenci HLA třídy I (human leukocyte antigen, dále HLA-I) komplexu na buňce. V případě, že je HLA-I komplex přítomen, přijímá NK buňka set signálů, které vedou skrz inhibiční receptory (primárně KIR, killer-cell immunoglobulin-like receptor), k inhibici reakce NK buňky. V případě absence HLA-I dochází k tzv. missing-self efektu, kdy NK buňka nedostává inhibiční signál a rovnováha buňky se posouvá směrem k její aktivaci skrz aktivační receptory [6]. Na aktivaci buňky se podílí také okolní prostředí – cytokiny, kostimulační receptory či T lymfocyty [7].

NK buňky na základě recentních dat hrají roli nejen při odpovědi na transformované buňky, ale také v rozvoji GVHD (graft versus host disease, reakce štěpu proti hostiteli) [8,9]. Jejich přesná role a to, jakým způsobem mohou NK buňky ovlivňovat výsledek transplantace, je nyní předmětem intenzivního zkoumání, na kterém se podílí i naše pracoviště.

 

RECEPTORY NK BUNĚK A JEJICH LIGANDY

Každá zralá NK buňka má svůj specifický set receptorů, které řídí její aktivitu směrem k inhibici nebo aktivaci. Nejlépe prozkoumanými NK receptory jsou tzv. KIR receptory, kterým jako ligandy slouží primárně HLA-I proteiny (seznam známých receptorů NK buněk a jejich ligandů dle Boudreau et al., 2018 a Sivori et al., 2019 lze najít v tab. 1 a 2 [10,11]). Mezi nejvýznamnější aktivační receptory patří vedle KIR také NKG2D, jehož ligandy MICA a MICB vykazují zvýšenou expresi v rámci stresové odpovědi [12].

KIR RECEPTORY

KIR receptory jsou exprimovány primárně na NK buňkách a v nižším množství také na NKT buňkách [13]. Tyto receptory jsou kódovány celou rodinou KIR genů, které se nacházejí na chromosomu 19. K dnešnímu dni známe 15 KIR genů, konkrétně 2DL1-5 (L1, L2/3, L4, L5A a L5B), 3DL1-3 (L1, L2, L3), 2DS1-5 (S1, S2, S3, S4, S5) a 3DS1, a dále 2 pseudogeny, 2DP1 a 3DP1 [14].

KIR geny se skládají z 9 exonů, exony 1 a 2 kódují vedoucí sekvenci, exon 3 doménu D0, exon 4 doménu 1, exon 5 doménu 2 a exony 6–9 pak transmembránovou a cytoplasmatickou část proteinu. Všechny geny nemusejí obsahovat všechny exony a stejně tak se mohou lišit délky jednotlivých exonů (obr. 1).

Názvosloví KIR genů odpovídá jejich proteinové struktuře, kdy první číslo, 2 nebo 3, značí počet extracelulárních domén a písmena S a L pak délku intracelulární části proteinu (short-krátká/long-dlouhá). S délkou intracelulární části je spojena i funkce proteinu. KIR proteiny s dlouhou intracelulární doménou – L – mají na svém konci zpravidla navázán ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibititory motif) a jsou tudíž inhibiční, KIR proteiny s krátkou intracelulární doménou – S – mají navázaný ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) a jsou aktivační. Jedinou výjimkou je KIR 2DL4, který může být jak inhibiční, tak aktivační. KIR geny mají vysokou alelickou variabilitu, konkrétně bylo k 05/2023 popsáno 1617 alel [15] (pozn. v roce 2020 jich bylo uvedeno ve stejné databázi IPD-KIR 1100 [16], dá se proto očekávat, že uvedené číslo ještě zdaleka není konečné). Nejvíce alel je popsáno u 3DL3 (229 alel kódujících 113 proteinů), ale nejvíce proteinů je tvořeno alelami genu 3DL2 (116 proteinů, které kóduje 168 alel).

KIR geny jsou děděny v tzv. haplotypech, které známe v základu dva, haplotyp A a haplotyp B. Každý z nich obsahuje 2 různé sety genů, ale oba haplotypy obsahují tzv. framework geny, tj. geny, které rámují začátek a konec oblasti KIR genů – 3DL3, 3DP1, 2DL4 a 3DL2. Haplotyp A pak obsahuje pouze jeden aktivační KIR receptor – 2DS4. Ne vždy je ale tento protein nakonec exprimován na povrchu buňky a homozygoti pouze s haplotypem A tak na povrchu svých NK buněk nemusejí mít ve výsledku žádný aktivační KIR receptor [17].

Zatímco je variabilita haplotypu A postavena na alelické heterogenitě, variabilita haplotypu B je dána především kompozicí (přítomností či absencí) genů. Nejvíce zatím známých proteinů tvoří framework geny přítomné jak u haplotypu A, tak i B – 3DL2 (116 proteinů), 3DL3 (113) a 2DL1 (74), 3DP1 je framework pseudogen, proto proteiny netvoří. Další gen s nejčetnějším počtem proteinů je 3DL1, který se nachází jak v haplotypu A, tak i B, který tvoří 94 proteinů (známé k 05/2023) [18].

Stejně jako u dalších genů, ovlivňují genetické polymorfismy také expresi a funkci KIR genů. Již bylo zmíněno, že některé alely 2DS4 nevedou k proteinu exprimovanému na povrchu buňky [17]. Týká se to ale i například 2DL4 [19], 2DL2 [20], 2DL1 [20] nebo 3DL1 [21]. Některé polymorfismy vedou k předčasnému ukončení překladu při tvorbě proteinu, tj. k tzv. null alelám. Nejvíc null alel, 22, má gen 2DS4 (54 % z celkových 41 alel), následovaný genem 2DL1, který jich má ale výrazně méně, 7 ze 185 (4 %) [18]. Další polymorfismy pak mohou ovlivňovat hladinu exprese na povrchu buňky nebo mohou ovlivňovat sílu vazby receptoru k ligandu, obojí například u 3DL1 [22,23].

 

ROLE HAPLOTYPU, POLYMORFISMŮ KIR RECEPTORŮ A SHODY A NESHODY KIR-HLA PŘI HSCT

Haplotyp A je složen převážně z inhibičních KIR, zatímco haplotyp B obsahuje více aktivačních KIR, v teoretické rovině by proto měl štěp dárce s haplotypem B vést k silnější reakci štěpu proti leukémii. U pacientů s AML, kteří podstoupili transplantaci s dárcem s alespoň jedním B haplotypem bylo skutečně pozorováno nižší riziko relapsu [24,25]. Také transplantace štěpů od dárců s nižším zastoupením inhibičních receptorů vedly k nižšímu výskytu relapsů a delšímu přežití [26].

Roli hrají ale také jednotlivé alely či polymorfismy daných genů. Typ aminokyseliny na pozici 245 KIR 2DL1 ovlivňuje míru inhibiční funkce tohoto receptoru. Ve studii Bariho a kolektivu bylo prokázáno, že pacienti, kteří dostali štěp od dárce s 2DL1 se silnější inhibiční funkcí, vykazovali lepší přežití a nižší riziko relapsu [27]. Autoři dále popisují, že u buněk se slabší inhibiční funkcí 2DL1 pozorovali u NK buněk signifikantně méně degranulace a sekrece IFN- g [28]. S úplně opačným výsledkem přišel tým Boudreauho et al. [29]. Ti u pacientů se štěpem od dárce s alelami genu 3DL1 vedoucími k slabé nebo žádné inhibici (*005, *007 nebo *004) pozorovali signifikantně nižší riziko relapsu a delší OS oproti pacientům se štěpem se silně inhibičními alelami (*001, *002) [29]. Podobných výsledků se dobrali Schaffer et al. [30, 31]. Alely 2DL1*003 a 2DL3*003 hrály roli v případě přítomnosti v haploidentickém štěpu pro pacienty s AML. Jejich přítomnost vedla k nižšímu výskytu relapsu [32].

 

VLIV KIR – HLA SHODY A NESHODY NA HSCT

KIR – HLA shodu/neshodu mezi dárcem a pacientem lze posuzovat dle více přístupů na základě toho, zda dochází k typizaci pouze HLA pacienta, dárce nebo zda je zahrnuta i typizace KIR. Přítomnost jednotlivých ligandů a receptorů, a tedy i případnou aloreaktivitu lze zkoumat jak genotypizací, tak ale i fenotypizací či funkčními testy NK buněk [33].

V případě, že máme informaci pouze o HLA pacienta, je využit model „chybějícího ligandu“ (missing ligand), kdy nepřítomnost některého z ligandů (HLA-C1, HLA-C2 či HLA-Bw4) pro inhibiční KIR může vést k aloreaktivitě (NK nedostává inhibiční signál) v případě přítomnosti takového KIR u dárce. Tuto reakci ale pouze předpokládáme, protože nemáme jistotu, že dárce příslušný inhibiční KIR receptor má [34]. Tuto metodu lze využít v případě haploidentických transplantací, kdy dárce není vždy otypizován kompletně z důvodu předpokladu dědičnosti HLA.

Pokud máme informaci o HLA jak dárce, tak pacienta a u pacienta chybí HLA, které je přítomné u dárce, mluvíme o missing-self (nebo také KIR-ligand nebo ligand-ligand missing) neshodě. Pro představu, dárcovský štěp od dárce s HLA-C1 i HLA-C2 bude postrádat inhibiční signál od pacienta, který má pouze HLA-C1 a dojde tak k aloreaktivitě [34]. Stejně jako v předchozím případě, i zde tuto reakci pouze předpokládáme. Tento model je využíván v nepříbuzenských transplantacích, kde jsou pacienti i dárci pro HLA plně typizováni.

Třetím modelem je model neshody receptoru a ligandu (receptor-ligand mismatch). V tomto případě známe HLA pacienta a KIR receptory dárce a minimálně jeden inhibiční KIR zůstává bez příslušného ligandu (například přítomnost KIR2DL1 u dárce, ale absence HLA-C2 u pacienta) [35].

Posledním modelem je „přítomnost aktivačního KIR“. Tento model pracuje s předpokladem, že vedle chybějícího inhibičního signálu je potřeba také přítomnost aktivačního signálu pro aktivaci NK buňky. Zde je tedy třeba znát typ aktivačního KIR a přítomnost jeho ligandu u pacienta [36].

Bylo popsáno, že pacienti s AML nebo myelodysplastickým syndromem (MDS), kteří měli KIR – HLA neshodu, měli signifikantně delší přežití bez nemoci (disease-free survival, DFS) i celkové přežití (overall survival – OS) a nižší riziko relapsu. V případě, že se pacient s dárcem navíc neshodovali nejen v jednom, ale ve dvou ligandech, bylo dosahováno ještě lepšího DSF a OS [37].

Ruggeri s kolektivem sledovali 5leté přežití u pacientů s AML, kteří byli transplantovaní s nebo bez KIR – HLA neshody. V případě neshody byla pravděpodobnost 5letého přežití kolem 60 %, v opačném případě to bylo méně než 5 % [38]. Podobný efekt – vyšší pravděpodobnost OS ve 4,5 letech v případě neshody (87 vs. 48 %; p = 0,006) a vyšší pravděpodobnost DFS (87 vs. 39 %; p = 0,0007) sledoval tým Sebastiana Giebela [39]. Ruggeri et al. popsali tentýž trend také u haploidentických transplantací [35]. Ne všechny práce tento efekt potvrdily. Beelen et al. nepozorovali žádný benefit v případě aloreaktivity [40] podobně jako Bornhäuser s kolektivem [41]. Rozdíl ve studiích se dá nepochybně vysvětlit rozdílnou populací pacientů, ale efekt by mohla hrát i KIR – HLA neshoda v případě aktivačních KIR. Tyto receptory by v případě shody naopak měly protektivní efekt s ohledem na relaps [42].

Z toho vyplývá, že interakce mezi KIR a HLA je důležitým faktorem při transplantaci kostní dřeně a je tedy vhodné tento parametr sledovat. To vedlo ke vzniku kalkulátoru shody KIR-HLA (https: //www.ebi.ac.uk/ipd/kir/matchi- ng/ligand/), který umožňuje pracovištím tuto interakci sledovat na základě zadání HLA pacienta a HLA dárce. Slabinou tohoto kalkulátoru je ale to, že sleduje primárně interakci (shodu/neshodu) mezi inhibičními KIR a HLA, což ovšem vychází i z toho, že ligandy pro inhibiční receptory jsou známé lépe než pro aktivační KIR. Tento fakt ale může zkreslit výsledný způsob reakce NK buněk na buňky pacienta a je třeba se lepšímu prozkoumání aktivačních KIR věnovat.

 

NKG2D RECEPTOR A JEHO LIGANDY

NKG2 (natural killer group 2) receptory jsou transmembránové molekuly typu II s doménou lektinového typu C, které mohou (ale nemusí) dimerizovat s proteinem CD94 na buněčném povrchu. Bylo popsáno 7 typů těchto receptorů, NKG2A, B, C, D, E, F a H [43,44]. NKG2A a NKG2B jsou receptory inhibiční. Ostatní receptory z této rodiny jsou aktivační [45–47]. Tato rodina proteinů je přítomná na NK buňkách, ale i na CD8+ a CD4+ T lymfocytech [43,48,49].

NKG2D receptor, kódovaný genem KLRK1, vykazuje oproti KIR receptorům poměrně malou genetickou variabilitu, přesto byly popsány čtyři alely tvořící dva typy haplobloků, které mají vliv na cytotoxicitu buňky. Jedná se o alely LNK1, LNK2, HNK1, a HNK2. To, jestli je alela LNK1 nebo HNK1 je určeno na základě SNP (single nucleotide polymorphism) rs1049174 (na této pozici je buď C nebo G). LNK2 vs HNK2 je určeno polymorfismem rs2255336 (G ® A). Jak již název napovídá (LNK – low NK), spouští LNK alela oproti HNK (high NK) alele nízkou cytotoxicitu. Haploblok Hb-1 obsahuje LNK1 a HNK1, které se mohou nacházet ve třech kombinacích – LNK1/LNK1, HNK1/HNK1 a LNK1/HNK1 a stejně tak u haplobloku Hb-2 jde o kombinace LNK2/LNK2, HNK2/HNK2 a LNK2/HNK2 [50]. Hayashi et al popsali, že kombinace HNK1/HNK1 vede ke sníženému riziku rozvoje nádorového onemocnění oproti kombinaci LNK1/LNK1 [50]. Espinoza s kolektivem došli k podobnému výsledku u HSCT, kdy pacienti se štěpem od dárců s HNK1/HNK1 dosahovali lepšího celkového přežití a nižší mortalitě způsobené transplantací [51]. V našem souboru dat nicméně žádný efekt haplotypu NKG2D na výsledek transplantace nebyl pozorován [52].

NKG2D receptor rozeznává ligandy MICA, MICB a ULBP1-6, které jsou exprimované na buňkách v případě, že buňky zažívají buněčný stres (tepelný šok, oxidativní stres, radiace), virovou infekci nebo nádorovou transformaci [49]. Tyto ligandy se mohou vyskytovat i na zdravých buňkách (proliferující buňky, myeloidní progenitorové buňky či zdravé intestinální epiteliální buňky a buňky opravující poškozenou tkáň [49]), ale v takovém případě se předpokládá, že samotná přítomnost ligandu není pro reakci buněk s NKG2D receptorem dostatečná a převažuje množství inhibičních signálů [53].

Ligandy MICA a MICB patří do rodiny MIC (MHC class I-related chain), ULBP1-6 do rodiny ULBP/RAET (human cytomegalovirus Unique Long 16-binding protein/Retinoic acid early transcript). Obě tyto rodiny jsou příbuzné s HLA-I proteiny, ale na rozdíl od nich neasociují s b2-mikroglobulinem a není o nich známo, že by na svém povrchu prezentovaly antigen [54]. Žádný antigen tak neovlivňuje způsob jejich vazby na receptor. NKG2D ligandy hrají zásadní roli v regulaci imunitní reakce, proto se cílové buňky naučily různým způsobem ovlivňovat jejich přítomnost na svém povrchu. Geny obou ligandů se skládají z vedoucí sekvence, kódované exonem 1, extracelulárních domén alpha1-3 (exony 2–4) a transmembránové a cytoplazmatické části (exony 5–6) (obr. 2) [55,56].

Oba geny jsou velmi polymorfní, k 03/2023 je v databázi sekvencí IMGT/HLA (https: //www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/about/statistics/) 531 alel pro MICA a 244 pro MICB. Alel ale bude, stejně jako v případě KIR, nepochybně přibývat, v roce publikačního výstupu naší pracovní skupiny, tj. v roce 2021, bylo alel MICA 223 a MICB 138 [49].

 

POLYMORFISMY NKG2D LIGANDŮ A JEJICH VLIV NA HSCT

Na základě teorie o shodě mezi ligandy a receptory by měla neshoda mezi dárcem a pacientem v NKG2D ligandech vést k neschopnosti NK buněk tyto ligandy rozeznat a tím vést i k nižší reakci štěpu proti leukemii (GVL), ale na druhou stranu i k nižšímu riziku rozvoje GVHD [49]. Přesto tomu data neodpovídají. Práce kolektivů kolem Simrit Parmar, Raphaela Carapita a Daniela Fuersta popisují, že naopak shoda mezi dárcem a pacientem u MICA vede k nižšímu rozvoji aGVHD [57–59]. A stejně tak nižšímu cGVHD [57]. To může být vysvětleno tím, že primárně způsobují GVHD aloreaktivní ab T lymfocyty, které neshodné NKG2D ligandy rozeznávají jako alo-antigeny a přistupují k buňkám stejně jako v případě neshody v HLA na antigen-prezentujících buňkách [58,60].

U relapsu, tj. při nedostatečné reakci štěpu proti leukémii, ovšem nejsou data tak konsistentní. Parmar a Carapito se svými týmy pozorovali v případě neshody mezi dárcem a pacientem v MICA nižší riziko relapsu [57,58]. Fuerst s kolektivem naopak pozorovali v případě neshody mezi dárcem a pacientem vyšší riziko relapsu. Jejich studie ale byla, na rozdíl od dvou předchozích, postavená na shodě a neshodě v jedné aminokyselině, konkrétně na přítomnosti valinu nebo methioninu na pozici 129 (MICA-129Val/Met) [59].

Tento polymorfismus pak byl sledován v dalších pracích, a to i bez ohledu na shodu mezi dárcem a pacientem. Ligand MICA, který má na pozici 129 methionin, se váže k NKG2D receptoru s vyšší afinitou oproti MICA-129 s valinem, což vede k rozdílné síle i délce trvání odpovědi NK buňky. Zjednodušeně lze říci, že MICA-129Met se naváže silněji, díky čemuž spustí silnější reakci a o to dříve pak dojde k vyčerpání NKG2D receptoru a NK buňky. Homozygotní MICA-129 Met/Met pacienti pak mají z toho důvodu vyšší riziko aGVHD [61]. Naopak, u MICA-129Val je vazba k receptoru slabší, ale o to delší, a je tedy vyšší riziko cGVHD, což potvrdil Boukouaci s týmem [62]. Stejný tým také prokázal vliv solubilních MICA na vyšší riziko rozvoje cGVHD [62]. V našem datasetu hrál roli polymorfismus MICA-14, kdy podání štěpu od dárce s alespoň jednou kopií MICA-14Gly (místo MICA-14Trp) vedlo k signifikantně kratšímu celkovému přežití (p = 0,0071) [52].

Co se týče MICB, neshoda v rámci polymorfismu na pozici 98 (MICB-98Ile/Met) zvyšuje riziko rozvoje chronického i akutního GVHD v případě, že dárce a příjemce jsou jinak MICA a HLA shodní a pacient je přitom zároveň CMV pozitivní [63]. V případě, že byl pacient CMV negativní, nehrála neshoda takovou roli a v případě shody v MICB-98, nehrál zase roli CMV status pacienta [63]. V naší studii jsme pozorovali vliv polymorfizmu MICB-58, kde přítomnost alespoň jedné kopie MICB-58Lys u pacienta vedla k nižšímu riziku relapsu než v případě, že MICB-58Lys přítomno nebylo. Toto pozorování nicméně nebylo potvrzeno statisticky (p = 0,069) z důvodu nedostatečně velkého souboru pacientů.

ZÁVĚR

Z uvedeného vyplývá, že receptory NK buněk hrají v transplantaci kostní dřeně důležitou roli. Mezi ty zásadní patří shoda mezi dárcem a pacientem v HLA a inhibičními KIR vedoucí k slabší reakci štěpu proti leukémii, byť tento efekt není potvrzen všemi dostupnými pracemi. Taktéž se uvádí, že lepším dárcem pro pacienta s AML je dárce s KIR haplotypem B pro přítomnost většího množství aktivačních KIR oproti haploidentickému dárci s haplotypem A. Popsáno bylo i několik alel a polymorfismů KIR genů, které ovlivňovaly výsledek allo-HSCT, ale tyto informace vyžadují další potvrzení na dostatečně velkém souboru pacientů. Podobné je to s alelami a polymorfismy receptoru NKG2D (LNK/HNK) a jeho ligandů MICA a MICB. Bylo popsáno několik polymorfismů (MICA-129, MICA-14, MICB-98, MICB-58), které se zdají mít na allo-HSCT vliv, ale stejně jako v případě KIR je potřeba dané efekty potvrdit ve studii zahrnující dostatečný počet pacientů. V každém případě ale platí, že si receptory NK buněk a jejich ligandy zaslouží další pozornost.

 

PODÍL AUTORŮ NA RUKOPISU

AM – hlavní autor

PP, TD, PJ, MH – revize dokumentu

 

PODĚKOVÁNÍ

Práce byla podpořena grantem ministerstva zdravotnictví – číslo NV18-03-00277 a projektem institucionálního výzkumu MZČR – FNPI, 00669806.

 

ČESTNÉ PROHLÁŠENÍ

Autoři práce prohlašují, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku nejsou ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou společností.

Doručeno do redakce dne: 30. 5. 2023.
Přijato po recenzi dne: 15. 6. 2023.

Mgr. Alena Machuldová
Laboratoř nádorové biologie a imunoterapie
Biomedicínské centrum
LF UK v Plzni
Alej Svobody 76
301 00 Plzeň
a Ústav histologie a embryologie
LF UK v Plzni
Karlovarská 48
301 00 Plzeň
e-mail: alena.machuldova@gmail.com