Analýza metalothioneinu u pacientů se zhoubnými nádory jater

Souhrn

Východiska: Zhoubné nádory jater jsou agresivní a mají špatnou prognózu přežití. Metalothionein (MT) je nízkomolekulární intracelulární protein, jehož primární funkcí je udržení homeostázy těžkých kovů v živých organizmech. Molekulární mechanizmus exprese MT je velmi málo prostudován. Nedávné výzkumy ukazují na jeho významný vztah ke karcinogenezi, spontánní mutagenezi a účinnosti protinádorových léčiv. Již v předchozích studiích bylo dokázáno, že hladiny MT stoupají u nádorového onemocnění. Cílem naší práce bylo studium MT za účelem zvýšení efektivity diagnostiky zhoubných nádorů jater. Metody: V pilotní studii (2022–2023) byla sledována skupina 15 pacientů s hepatocelulárním karcinomem (hepatocellular carcinoma – HCC, diagnóza C220) a skupina 15 pacientů s hepatoblastomem (diagnóza C222). Kontrolní skupina byla vybrána ze zdravých probandů (n = 20). Pro analýzu byla použita námi vyvinutá modifikovaná metoda. Vzorky krevních sér probandů byly tepelně denaturovány (99 ˚C, 20 min). MT byl stanoven pomocí elektrochemie. Získaná data byla uložena a zpracována v laboratorním informačním systému QINSLAB. Výsledky: U vzorků denaturovaných krevních sér byly získány voltametrické křivky MT. Stanovením plochy pod křivkou (area under the curve – AUC) byly vypočteny koncentrace MT. Pro porovnání normální a abnormální hladiny MT byla použita kontrolní séra zdravých probandů (n = 20) se zjištěným průměrným množstvím MT 2,0 ± 1,3 µg/l a mediánem 1,9 µg/l. U skupiny pacientů s HCC bylo zjištěno průměrné množství MT 9,1 ± 6,5 µg/l a medián 9,0 µg/l. Tzv. receiver operating characteristic (ROC) analýza ukázala AUC 0,864 (95% CI 0,736–0,992), senzitivitu 0,74 a specificitu 0,75. U pacientů s hepatoblastomem bylo zjištěno průměrné množství MT 11,5 ± 7,5 µg/l a medián 10,9 µg/l. ROC analýza ukázala AUC 0,868 (95% CI 0,751–0,993), senzitivitu 0,84 a specificitu 0,86. V korelační analýze byla pozorována korelace MT ke karcinoembryonálnímu antigenu (CEA) (r = 0,99), kyselině močové (r = −0,86) a iontům draslíku (r = −0,94). Závěr: V této pilotní studii se podařilo sledovat pravděpodobnou asociaci hladiny MT u probandů se zhoubnými nádory jater. Z publikovaných prací je známo, že hladiny MT jsou dlouhodobě zvýšené a předpokládáme, že souvisí se zvýšenou metabolickou aktivitou nádorových buněk. Studie bude dále pokračovat na větším souboru pacientů.

Klíčová slova:

cílená terapie – biomarker – zhoubné nádory jater – Brdičkova reakce – elektrochemie

Úvod

Incidence zhoubných nádorů jater se v Evropě neustále zvyšuje. Zhoubné nádory jater a malignity žlučového stromu se vyznačují rezistencí na léčbu a špatnou prognózou (5leté přežití je < 20 %) [1–4]. Hepatocelulární karcinom (hepatocellular carcinoma – HCC, diagnóza C220) je nejčastější primární variantou maligního nádoru jater [1]. HCC vytváří kulovitá ložiska v obou jaterních lalocích (multinodulární HCC) nebo formuje jeden velký shluk nádorových buněk, který má další satelitní ložiska. Typické pro tento tumor je vytváření metastáz na plicních uzlinách [1]. Hepatoblastom (diagnóza C222) je další varianta vysoce maligního nádoru jater, který se nejčastěji vyskytuje u dětí mladších 15 let [5]. Kromě toho je tento nádor často diagnostikován ihned po narození nebo již v děloze. Rychle roste, poté se rozšiřuje do plic a dále do celého organizmu. Předpokládaný mechanizmus nádorové transformace u jaterních buněk mohou vyvolávat různí činitelé, jako jsou toxický efekt alkoholu, aflatoxinů, zvýšené ukládání železa nebo metabolické procesy spojené s obezitou či cukrovkou. Významný biologický potenciál hraje infekce způsobená viry. Byly prokázány souvislosti mezi infekcí viry hepatitidy B a C (obr. 1A).

Hledání vhodných chemických a molekulových markerů je stále klíčovou otázkou. Pro tyto účely se využívají různé typy molekul. Jsou popsány jak molekuly peptidové nebo proteinové povahy, tak nukleové kyseliny jako malé RNA [6–10]. Byly popsány různé metabolické dráhy, které by mohly mít asociaci k nádorům jater (obr. 1B) [11]. Typickým nádorovým markerem pro HCC a hepatoblastom je alfa-fetoprotein (AFP) [12–15]. Vysoké hladiny AFP po narození přirozeně rychle klesají, nicméně u dětí s nádorovým onemocněním přetrvávají.

V naší práci se dlouhodobě zabýváme asociací thiolových sloučenin (obr. 1C) a metalothioneinů (MT) k nádorovým onemocněním [9,16]. Metalothioneiny jsou malé proteiny o velikosti 6–14 kDa s hlavní biologickou funkcí udržovat hemostázu iontů kovů (obr. 1D) [8]. Díky vysoké afinitě k těžkým kovům je jejich hlavní funkcí homeostatická kontrola a detoxikace těchto těžkých kovů. Molekulárního mechanizmu regulace hladiny MT se s nejvyšší pravděpodobností účastní samotný kov. Iont kovu aktivuje transkripční faktor MTF-1, který se váže na metal responzivní element (MRE). Transkripční faktor MTF-1 po navázání strukturního genu umožní vazbu DNA polymerázy a následnou syntézu MT [8]. V práci autorů Zhang et al. bylo bioinformatickým přístupem hodnoceno transkriptomické riziko vzniku HCC. Jako potenciální rizikový faktor byla zjištěna upregulovaná exprese MT1M [17]. U kazuistiky hepatocelulárního karcinomu byly v imunohistologickém hodnocení vzorků jaterní tkáně pozorovány zvýšené exprese AFP a difuzně MT [18]. Kromě hladiny MT by mohla být také významná hladina biologicky významných prvků. Ve studiích je ukázána souvislost mezi hladinami mědi a zinku a zhoubnými nádory jater [11,19]. Snížená hladina zinku je často pozorována u pacientů s chronickým onemocněním jater, zejména s cirhózou [19], a navíc úzce souvisí s rozvojem jaterní fibrózy a zvýšeným rizikem karcinogeneze jater [19]. Stanovením hladin MT v dostupných biologických vzorcích, jako je krev, sérum, plazma nebo moč, se příliš mnoho výzkumných skupin nezabývá. V našich experimentálních studiích jsme se této problematice intenzivně věnovali a vypracovali postupy pro analýzu MT a tuto metodu jsme aplikovali u vybraných skupin pacientův séru [9,20,21]. Horáková et al. ve svém přehledu popisuje MT jako potenciální onkomarker [10]. S ohledem na souvislost MT s léčivy je třeba zvažovat i jejich duální roli a příp. uvažovat o možnostech ovlivnění jejich přirozené exprese [22].

Cílem této práce byla pilotní studie zaměřená na prvotní informace o hladinách MT u pacientů s hepatoblastomem a HCC.

Materiál a metody

Použité chemikálie

MT byl zakoupen od společnosti Sigma-Aldrich (USA) a ostatní chemikálie použité pro analýzu byly zakoupeny od společnosti Merck (Darmstadt, Německo) v čistotě p. a. Pro chemicko-biochemickou analýzu byly využity pracovní roztoky od společnosti Siemens (USA).

Biologické vzorky

Všechna vyšetření jsou v souladu se zásadami Helsinské deklarace. Vzorky séra byly získány ze zbytků séra jako anonymní vzorky před jejich likvidací (Motol Ref. No.: EK-1422/13; Ref. No.: EK-223/24) a jejich použití je v souladu s vnitřními předpisy FN. Kontrolní skupina probandů byla ve věku od 4–31 let (n = 20). Testovaná skupina probandů byla rozdělena do kategorií HCC (n = 15; věk 9–77 let) a hepatoblastom (n = 15; věk 0–20 let). Rozdělení do jednotlivých věkových kategorií bylo sestaveno podle doporučení WHO.

Příprava roztoků a vzorků

Primární vzorek krve byl odebírán do zkumavek Vacuette s akcelerátorem hemokoagulace. Následnou centrifugací (Avanti J-15R, Beckman Coulter (USA), 1 500 g, 4 °C, 10 min) bylo odděleno krevní sérum pro biochemickou analýzu. Individuální vzorky pro stanovení MT byly ve zkumavkách smíchány s ultračistou vodou (objem min. 500 µl; poměr ředění 10×). Následně byl biologický vzorek denaturován (termomixer, 99 °C, 20 min, zkumavka Eppendorf), poté byl centrifugován (14 000 g, 4 °C, 30 min, zkumavka Eppendorf). Pro elektrochemickou analýzu byl použit supernatant [21].

Chemická analýza

Ultračistá voda byla připravena na zařízení ELGA (Londýn, Spojené království), pH bylo kontrolováno na pH metru (VWR, USA). Pro chemickou fotometrickou analýzu vzorků byl použit analyzátor Atellica Solutions CH 930 (Siemens, USA). Vybrané nádorové markery AFP, CEA, CA 19-9 a CA 125 byly analyzovány na Atellica Solutions IM1600 (Siemens, USA). Pro detekci iontů bylo využito integrované multisenzorové technologie (IMT) na tištěných elektrodách zařízení Atellica Solutions CH 930 (Siemens, USA).

Imunologická analýza virů hepatitidy B (HBV) a hepatitidy C (HCV)

Detekce přítomnosti virových antigenů anti-HBV a anti-HCV byla provedena na analyzátoru ARCHITECT 4000 (Abbott, USA).

Stanovení hladiny MT

Elektrochemická analýza byla provedena na AUTOLAB Analyser (Metrohm, Herisau, Switzerland) ve spojení s VA-Stand 663 (Metrohm, Herisau, Switzerland). Vzorky byly měřeny diferenční pulzní voltametrií (DPV). Parametry DPV byly následující: počáteční potenciál byl –0,6 V a konečný potenciál byl –1,9 V, modulační čas byl 0,057 s a interval 0,2 s, step potenciál byl 1 mV/s, modulační amplituda 250 mV a akumulační čas 240 s. Základní elektrolyt (Brdičkův roztok) 1 mmol/l Co (NH₃) 6Cl₃, 1 mol/l NH₃ (aq) a 1 mol/l NH₄Cl, pH = 9,6. Další podrobnosti k metodě jsou popsány v našich pracích [16,21,23,24].

Statistické a matematické vyhodnocení

Veškerá analyzovaná data byla převedena do laboratorní databáze QINSLAB a statisticky vyhodnocena. Všechny elektrochemické analýzy byly provedeny minimálně v pěti opakováních. Analytické parametry mez detekce (limit of detection – LOD) a mez stanovitelnosti (limit of quantification – LOQ) byly vypočítány podle práce autorů Hubaux a Vos [25].

Výsledky

Popis sledované skupiny pacientů

V naší pilotní studii se podařilo v období leden 2022 až září 2023 identifikovat více než 10 pacientů s hepatoblastomem podle diagnózy dostupné v laboratorním informačním systému [26]. U více než 80 % identifikovaných pacientů se pak podařilo zachytit vzorek krevního séra pro další laboratorní testování. Pro účel této studie byla vytvořena kontrolní skupina co nejvíce se přibližující zkoumanému souboru probandů s nádory. V kontrolní skupině byli zastoupeni zdraví probandi ve věku 5–30 let, 60 % žen a 40 % mužů. Šedesát procent probandů bylo ve věku do 18 let (obr. 2A). Ve skupině probandů s HCC (n = 15) bylo 53 % žen a 47 % mužů. Věkové zastoupení je ukázáno na obr. 2Ba. V souboru vidíme klastr ve věkové skupině 10–20 let a klastr ve věkové skupině 60–80 let. Ve skupině probandů s hepatoblastomem (n = 15) bylo 40 % žen a 60 % mužů s 93% zastoupením osob v mladé dospělosti (obr. 2Ca). Většina probandů byla ve věku 1–6 let, jak je pro tuto skupinu nádorů typické. U 30 % probandů z kontrolní skupiny, 66 % probandů s HCC a 53 % s hepatoblastomem byly dostupné údaje k vyšetření hladiny protilátek proti viru hepatitidy A (HAV) a dále protilátek proti HBV a HCV. Protilátky jsme zahrnuli z důvodu podání kompletních informací o potenciálních virových infekcích. Byla prokázána 50% pozitivita HBV jak ve skupině probandů s HCC, tak ve skupině s hepatoblastomem. Ostatní hepatitidy nebyly potvrzeny (tab. 1).

Hladiny MT ve sledovaných skupinách pacientů

Dlouhodobě je pro kvantitativní stanovení MT využíváno Brdičkovy reakce [27–29]. V naší nejnovější studii autorů Melich et al. je popsáno využití tohoto postupu u biologických vzorků pacientů se zhoubnými nádory [21]. Na obr. 3A jsou ukázány typické voltamogramy studovaných sér pacientů s HCC a hepatoblastomem. Na obr. 3B jsou distribuční histogramy MT v sledovaných souborech. U HCC můžeme sledovat vyšší četnost hladiny MT < 10 µg/l (obr. 3Ba). U skupiny probandů s hepatoblastomem byly pozorované koncentrace posunuty k vyšším hodnotám. Většina analyzovaných vzorků vykazovala hladiny MT > 10 µg/l (obr. 3Bb). Na obr. 3C jsou krabicové grafy porovnávající kontrolní skupinu probandů s testovanou skupinou probandů s HCC a hepatoblastomem. Kontrolní skupina probandů měla průměrné množství MT 2,0 ± 1,3 µg/l s mediánem 1,9 µg/l. U skupiny probandů s diagnózou HCC bylo zjištěno průměrné množství MT 9,1 ± 6,5 µg/l s mediánem 9,0 µg/l. U probandů s hepatoblastomem bylo zjištěno průměrné množství MT 11,5 ± 7,5 µg/l s mediánem 10,9 µg/l. Skupina probandů s HCC a skupina s hepatoblastomem byla statisticky vysoce významně rozdílná v porovnání s kontrolní skupinou (p < 0,001). Na obr. 3D je korelační analýza průměrných hodnot analyzovaných chemických a biochemických parametrů k hladinám MT. V korelační analýze byla pozorována pozitivní korelace MT k CEA (r = 0,99), negativní korelace k hladině kyseliny močové (r = −0,86) a iontům draslíku (r = −0,94).

Na obr. 4 je ukázána prahová operační charakteristika, tzv. receiver operating characteristics (ROC). Z dostupných dat byla regresním modelem vypočtena ROC křivka mezi skupinami probandů s HCC, hepatoblastomem a kontrolní skupinou. ROC analýza ukázala u probandů s HCC hodnotu AUC 0,864 (kvalita testu: dobrá, 95% CI 0,736–0,992), senzitivitu 0,74 a specificitu 0,75. U probandů s hepatoblastomem ROC analýza ukázala AUC 0,868 (kvalita testu: dobrá, 95% CI 0,751–0,993), senzitivitu 0,84 a specificitu 0,86. Při hodnocení kontrolní skupiny a skupin se zhoubnými nádory jater byla AUC 0,868 (kvalita testu: dobrá, 95% CI 0,754–0,983), specificita 0,78 a senzitivita 0,81. Hodnota cut-off se pohybovala na 95% hladině spolehlivosti – kolem 1 µg/l MT.

 

Hladiny biochemických parametrů ve sledovaných skupinách pacientů

Ve sledovaných velmi heterogenních skupinách byly analyzovány hladiny iontů, jaterní enzymy a další chemické parametry se vztahem k jaterním funkcím. Jak je ukázáno v tab. 2, ve skupině probandů se zhoubnými nádory byly hladiny jaterních enzymů v porovnání s kontrolní skupinou zvýšené (aspartátaminotransferáza (AST) > 0,8 µkat/l, alaninaminotransferáza (ALT) > 0,6 µkat/l, gamaglutamyltransferáza (GGT) > 0,7 µkat/l a alkalická fosfatáza (ALP) > 4,6 µkat/l). Dále byly stanoveny další základní biochemické parametry, jak je ukázáno v tab. 3. Podle očekávání byly ve skupinách probandů pozorovány rozdíly. Významné změny byly v hladinách celkového bilirubinu, přičemž u skupiny s HCC byla hladina kolem 28 µmol/l a u skupiny s hepatoblastomem kolem 8 µmol/l. U skupiny s hepatoblastomem byly pozorovány změny hladin u kyseliny močové, močoviny a kreatininu. Vysvětlení těchto pozorovaných rozdílů s ohledem na pilotní studii (malá skupina probandů) a výraznou různorodost (stadium onemocnění, průběh léčby atd.) je velmi obtížné a vyžaduje další podrobné studium. U námi sledované skupiny pacientů se podařilo analyzovat širší spektrum nádorových markerů (CEA, CA 19-9, CA 125 a AFP), jak je ukázáno v tab. 4. Ze získaných dat zkoumaných skupin probandů byla provedena ROC regresní analýza u hladin jaterních enzymů GMT, ALT, AST, ALP a C-reaktivního proteinu (CRP) u nádorových markerů CEA, CA 19-9, CA125, AFP. Pro vyhodnocení byla kontrolní skupina označena jako negativní a skupiny probandů s HCC a hepatoblastomem jako pozitivní (tab. 5).

Diskuze

MT zasahuje do celé řady buněčných procesů vlivem jeho regulační role v udržování homeostázy iontů kovů [30,31]. Analýza sérových koncentrací MT byla velmi dlouhou dobu opomíjena [10,32]. Důvodem je značná obtížnost analytické detekce MT [33]. Ve 30. letech 20. století Rudolf Brdička naznačil potenciál využití elektrochemie v nádorové diagnostice [27,28]. V práci Petrlová et al. jsme ukázali a popsali metodický postup pro analýzu MT v komplikované biologické matrici, jakou je krevní sérum [23]. Optimalizovaná metodika nám umožnila detailnější studium získaných voltametrických křivek ve spojitosti s analyzovaným biologickým vzorkem [34]. Zjistili jsme, že tyto průběhy je možné matematicky popsat a vyhodnocovat [35]. Předpokládáme, že takto získaný průběh křivky může být využit pro jednoznačnou identifikaci (tzv. fingerprint) hledané biologické vlastnosti [34]. Vyhodnocování takových záznamů společně s prvky umělé inteligence by mělo zlepšit diagnostiku těchto nádorových onemocnění. Díky našemu snažení v této oblasti analýzy MT se dané problematice věnuje více výzkumných skupin [36]. Z histochemických a molekulárně-biologických studií víme, že MT má asociaci s nádorovým onemocněním [30]. Navíc lze pozorovat i asociaci MT se závažností onemocnění. O dynamice sérových hladin MT v závislosti na věku neexistují prakticky žádné studie. V této studii byla prokázána zvýšená hladina MT (> 5 µg/l) s extrémními hodnotami kolem 10–20 µg/l. K podobným závěrům jsme dospěli v dalších studiích [9,16,37,38]. Samozřejmě byly zjištěny asociace mezi hladinou MT a molekulami spojenými s jaterním metabolizmem [39]. Jak je známo, HCC se více vyskytuje u dospělých a hepatoblastom u dětí. V naší studii však mezi skupinami nebyly pozorovány významné rozdíly (průměrné hladiny a mediány byly velmi podobné). Lze jen obecně předpokládat, že hladiny MT budou asociovány s buněčnou metabolickou aktivitou [31]. Získané závěry ROC analýzy naznačují, že výzkum v této oblasti by mohl přinést slibné výsledky. Zcela nezbytné však bude pozorovanou skupinu pacientů rozšířit. Vzhledem k tomu, že hladiny MT jsou asociovány s celou řadou přirozených biologických procesů, je využitelnost v běžné klinické praxi obtížně realizovatelná (jak je u řady nádorových markerů známo) [40]. V případě, že budeme sledovat více ukazatelů a využijeme nejmodernější přístupy ve vyhodnocování dat, lze očekávat mnohem více vypovídající informace o průběhu onemocnění.

 

Závěr

V naší pilotní studii na vzorku 30 probandů byly studovány hladiny MT s případnou asociací se zhoubnými nádory jater. Zjistili jsme, že hladiny MT byly u sledovaných skupin v porovnání s kontrolní skupinou zvýšené. Započatá studie bude dále pokračovat na větším souboru pacientů s přihlédnutím ke klasifikaci nemoci a léčebným zákrokům.

Poděkování

Práce je součástí pracovních aktivit v projektu COST CA22125/ENS-CCA a je podporována projektem Liga proti rakovině Praha 2399011548. Naše speciální poděkování patří panu RNDr. Josefu Růžičkovi za rozvoj laboratorního informačního systému.