Dlouhé nekódující RNA – současné možnosti detekce a využití v klinické praxi

Souhrn

Východiska: Dlouhé nekódující RNA (long non-coding RNA – lncRNA) jsou RNA molekuly o délce větší než 200 nukleotidů, které ovlivňují řadu fyziologických funkcí a mají významnou regulační roli v buňkách. Jejich hladiny jsou často změněny u různých malignit, a představují tak slibný biomarker pro diagnostiku, prognózu nebo rekurenci nádorových onemocnění. Díky důležitosti těchto molekul výrazně roste i počet publikací na toto téma. Mezi nejčastěji studované lncRNA patří např. HOTAIR, MALAT1 a PCA3.

Cíl: V současné době jsou vyvíjeny různé metody pro analýzu či detekci lncRNA, obvykle založené na optických metodách pro detekci mediátorové RNA (mRNA), např. polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí, fluorescenční in situ hybridizace nebo sekvenování nové generace. Je však potřeba dbát na rozdíly ve struktuře mRNA a lncRNA. V této práci popisujeme nejenom standardní metody, ale i nové přístupy pro detekci lncRNA zahrnující např. chemiluminescenční a elektrochemické techniky.

Závěr: I navzdory pokrokům a velkému množství publikovaných prací existuje pouze jeden schválený diagnostický test založený na detekci lncRNA, a to PCA3 test pro diagnostiku karcinomu prostaty analýzou moči. Ostatní jsou v současnosti pouze ve fázi vývoje a bude potřeba je validovat. Diagnostika založená na lncRNA i tak skýtá obrovský potenciál, a je proto velmi pravděpodobné, že se v blízké době objeví další diagnostické testy cílící na jiné typy lncRNA.

Klíčová slova:

dlouhá nekódující RNA – nádorové biomarkery – karcinogeneze – biosenzory

Úvod

I když pouze 2 % lidského genomu tvoří geny kódující proteiny, velká většina genomu (> 70 %) je transkripčně aktivní, dávající vznik různým formám tzv. nekódujících RNA s významnými regulačními funkcemi [1,2]. Mezi ně patří krátké nekódující RNA o délce menší než 200 nukleotidů (nt, obvykle kolem 20–30 nt), zejména mikroRNA, malé interferující RNA nebo Piwi-interagující RNA a též rozsáhlá skupina tzv. dlouhých nekódujících RNA (long non-coding RNA – lncRNA) o délce větší než 200 nt (často až 100 000 nt). Dle NONCODE databáze [3] se v lidském genomu nachází více než 96 000 genů pro lncRNA a až 172 000 transkriptů těchto genů; naopak LNCipedia [4] udává střízlivější odhad, zaokrouhlený na cca 55 000 genů [5]. Tyto geny se nacházejí v různých oblastech genomu, a to jak v nekódujících regionech, tak i v intronech genů kódujících proteiny. Navíc mohou být přepisovány nejenom ze stejného řetězce jako protein-kódující geny (tzv. „sense“ transkripty), ale i z řetězce opačného („antisense“ transkripty), či dokonce mohou sdílet promotor s protein-kódujícím genem v opačném řetězci (divergentní lncRNA). Transkripty lncRNA jsou obvykle generovány RNA polymerázou II, obdobně jako mRNA mají většinou na 5’-konci metylguanozinovou čepičku, na 3’-konci poly (A) konec a podstupují sestřih. Na rozdíl od mRNA ovšem postrádají otevřený čtecí rámec, takže nemohou být překládány do proteinů.

Geny kódující lncRNA jsou často pojmenovány dle sousedících protein-kódujících genů [6]. Jejich klasifikace je relativně složitá, dají se dělit např. dle umístění v genomu, způsobu aktivace nebo dle mechanizmu účinku. Hlavní třídy lncRNA, detailněji popsané v přehledném článku Šány et al [7], jsou mj. mezigenové lncRNA (umístěné mezi dvěma geny), intronové lncRNA (umístěné uvnitř intronů genů), lncRNA asociované s telomerami nebo pseudogeny (kopie genů neschopné kódovat proteiny). I když funkce většiny lncRNA transkriptů nejsou známy, lze obecně říci, že jejich úloha spočívá v regulaci genové exprese, modulaci proteinové aktivity či remodelaci chromatinu, příp. slouží jako prekurzory krátkých nekódujících RNA nebo jsou součástí systému jejich umlčení [8]. Obr. 1 naznačuje, že mechanizmus účinku lncRNA je závislý na vazbě na DNA, RNA nebo protein. Vzhledem k jejich roli při regulaci genové exprese není překvapivé, že při patogenních stavech jsou pozorovány změny jejich hladin, které mohou být detekovatelné dříve než viditelné morfologické změny. Tato skutečnost dělá z lncRNA ideální kandidáty nejen na biomarkery nádorových onemocnění [1,7,9–11], ale např. i kardiovaskulárních chorob [12] nebo Alzheimerovy choroby [13]. Díky důležitosti těchto molekul tak roste i počet publikací na toto téma; jenom v roce 2018 jich bylo přes 4 000 (graf 1). Bližší informace o funkci, klasifikaci nebo struktuře několika hlavních skupin lncRNA je možné najít v článcích publikovaných v dřívějších ročnících Klinické onkologie [7,9]; v tomto článku se chceme zaměřit především na nejnovější poznatky v oblasti metod detekce a jejich aplikace do klinické praxe.

Role lncRNA v karcinogenezi a její aplikace do klinické diagnostiky

Dnes už není pochyb o tom, že deregulace lncRNA je implikována v různých patologických stavech a může vést až k maligní transformaci buněk. Role lncRNA přitom byla prokázána v podstatě u všech charakteristických znaků rakoviny (hallmarks of cancer) definovaných ve dvou dnes již legendárních článcích Hanahana et al [14,15]. Některé konkrétní lncRNA a jejich asociace s těmito znaky jsou blíže popsány v tab. 1. Jde např. o aktivaci proliferačních signálních drah, deregulaci nádorových supresorových drah nebo o účast při metastazování [11,16].

Jednou z nejvíce studovaných lncRNA je HOTAIR (HOX antisense intergenic RNA). Tato lncRNA s délkou cca 2,2 kb reguluje dynamiku chromatinu a ovlivňuje transkripci jiných genů vazbou na histon metylázu PRC2 a histon demetylázu LSD1 [17,18]. Množství studií prokázalo deregulaci HOTAIR v desítkách nádorů, vč. nádorů prsu [19], tlustého střeva [20], slinivky břišní [21], vaječníků [22] nebo prostaty [23]. U nádorů tlustého střeva korelovala zvýšená hladina HOTAIR nejenom s progresí onemocnění, ale zvýšila se i chemorezistence k cytostatikům [24].

Další diagnosticky zajímavou lncRNA je PCA3 (prostate cancer antigen 3), jejíž hladina je zvýšená u více než 90 % mužů s karcinomem prostaty [25]. V roce 2012 americký Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (FDA) schválil použití PCA3 diagnostického testu v moči mužů nad 50 let s předchozí negativní biopsií prostaty, který by tak mohl snížit počet opakovaných biopsií a zároveň poskytnout doplňkové informace ke standardnímu testu prostatického specifického antigenu (prostate specific antigen – PSA). Test na PCA3 má sice nižší citlivost než PSA test, na druhé straně vykazuje vyšší specificitu, a může tak predikovat karcinom prostaty u případů, kdy PSA test selhává [26]. Hladina PCA3 byla ve více než 90 % studovaných případů karcinomu prostaty asi 60–100× vyšší než ve zdravé prostatické tkáni [27] a zároveň nedetekovatelná v jiných typech nádorů [28]. PCA3 také může sloužit jako indikátor agresivity rozvíjejícího se nádoru prostaty [29]. Přes značné výhody tohoto biomarkeru se v ČR toto vyšetření zatím takřka neprovádí.

Některé lncRNA mohou dokonce indikovat metastatický potenciál nádoru. Mezi ně patří např. MALAT1 (metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1), obvykle s vysokou koncentrací v jádře, kde reguluje prometastatické geny [30]. MALAT1 je vysoce konzervovaná lncRNA, jejíž umlčení vede ke snížení proliferace a migrace nádorových buněk [31] a k aktivaci tumor-supresorového genu TP53 [32]. U některých typů nádorů byla pozorována zvýšená hladina MALAT1 korelující s progresí metastáz a celkově horší prognózou, např. u plicního adenokarcinomu, kolorektálního karcinomu, karcinomu slinivky břišní, karcinomu močového měchýře, karcinomu jícnu nebo gliomu [1,33–36]. Souhrnná analýza několika nezávislých studií prokázala, že tato lncRNA je spojená s horší prognózou, kratším přežíváním a rekurencí onemocnění [37]. Nicméně data z nedávné studie provedené na myších modelech naznačila, že v prsních nádorových buňkách má MALAT1 opačný, tj. potlačující účinek na vznik metastáz, a autoři tak navrhují zpřesnění zažitého modelu definující MALAT1 jako prometastatické lncRNA [38].

Další efekt lncRNA je možné pozorovat na úrovni telomer, a to prostřednictvím tzv. TERRA (telomere repeat-containing RNA) molekul, které obsahují telomerové repetice UUAGGG na svém 3’-konci a podílejí se na regulaci telomerové homeostázy [39]. Vzhledem k tomu, že až 85 % lidských nádorů překoná replikační limit daný délkou telomer (tím, že reaktivují expresi enzymu telomeráza), jeví se regulační role TERRA lncRNA jako zásadní [7]. Sampl et al zjistili, že expresní hladina TERRA negativně koreluje s malignitou gliomů [40]. Přesná role TERRA jakožto negativního regulátoru telomeráz in vivo však stále zůstává nejasná [41]. V tab. 2 jsou uvedeny příklady studií využívajících početnější soubory klinických vzorků pro validaci různých druhů lncRNA.

Metody detekce

V současné době existuje pouze jeden lncRNA test schválený pro klinickou diagnostiku, a to výše zmíněný PCA3 test (s názvem Progensa PCA3 Assay) od firmy Hologic, využívaný pro diagnostiku karcinomu prostaty. Detekce probíhá v moči po masáži per rectum, aby došlo k uvolnění buněk prostaty. Moč je následně modifikována přidáním média, které lyzuje uvolněné buňky a stabilizuje RNA. Princip samotného testu spočívá v hybridizaci cílové RNA na povrch magnetických kuliček, které slouží pro separaci cílové RNA. Dále proběhne reverzní transkripce pomocí první sady primerů a RNA amplifikace pomocí další sady primerů. Dochází tedy nejprve k přepisu lncRNA do komplementární DNA (complementary DNA – cDNA) a dále k její amplifikaci pomocí DNA dependentní RNA polymerázy T7. V závěru jsou RNA amplikony detekovány pomocí chemiluminiscenčně značené DNA sondy komplementární k RNA. Kvantifikace se provádí měřením intenzity produkovaného záření a jejím porovnáním s referenčními vzorky, které jsou součástí diagnostické sady. Daný produkt je nabízen v lehce obměněné verzi specificky i pro PSA. Obě laboratorní stanovení se tedy dají provádět současně, a je tak možné PCA3 hodnoty vztáhnout k hladině PSA [42].

PCA3 je možné detekovat také pomocí klasické imunoenzymatické metody (enzyme-linked immuno sorbent assay – ELISA). Tuto možnost komerčně nabízí společnost MyBioSource pod názvem PCA3 ELISA Kit. Ten je ovšem určený pouze pro výzkumné účely a nemá oprávnění pro použití v klinické diagnostice. Princip metody vychází z klasické sendvičové ELISA. PCA3 je zachycena pomocí PCA3-specifické protilátky a poté označena další specifickou protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou. Na základě enzymatické reakce peroxidázy se substrátem vzniká barevný produkt, který je kvantifikován měřením absorbance při 450 nm [43].

I ostatní vyvíjené metody jsou určené pouze pro výzkumné účely, obvykle se jedná o modifikaci metod pro detekci dlouhých RNA obecně, i když ne všechny jsou použitelné. Některé z nich určené pro izolaci, identifikaci nebo nespecifickou amplifikaci mRNA např. využívají přítomnosti poly (A) konce na 3’-konci mRNA. Vzhledem k tomu, že ne všechny lncRNA nesou poly (A) konec [44], může tak při vysokokapacitních analýzách docházet k zatížení velkými chybami. Technologie sekvenování nové generace přitom často využívá záchyt mRNA pomocí poly (T) oligonukleotidů. Společnost Novogene [45] tak nabízí protokol a reagencie k vytváření knihoven a sekvenací profilů lncRNA a firma Roche pod označením SeqCap lncRNA probes [46] nabízí doplňkové sondy lncRNA pro kompletní profilaci celého transkriptomu. Oproti tomu společnost Illumina v rámci standardního protokolu využívá metodu přípravy sekvenční knihovny z depletované RNA (celkové RNA zbavené ribozomální RNA), a tudíž nedochází ke ztrátě informace o lncRNA bez poly (A) konců. Tento postup tedy umožňuje celkovou analýzu lncRNA profilu bez nutnosti pořízení dodatečných reagencí nebo obměny protokolu [47].

Další metodou z klasického portfolia pro studium mRNA je polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí. Touto metodou nejprve dochází k přepisu RNA do cDNA a ta je následně amplifikována. V reálném čase je zaznamenáván nárůst fluorescence, který koresponduje s množstvím DNA ve vzorku. Některé společnosti vyvinuly reagencie pro přepis do cDNA pomocí univerzálních poly (T) primerů, které se vážou na poly (A) konce. Tento přístup je pro komplexní analýzu lncRNA nevhodný, dá se ovšem modifikovat jednoduchou kombinací poly (T) primerů a tzv. random hexamers (využívaných v nespecifické reverzní transkripci). Tuto vylepšenou a zjednodušenou variantu pro studium lncRNA nabízí např. společnost BioRad [48].

Klasickou metodou pro kvantifikaci lncRNA in situ je i fluorescenční in situ hybridizace (FISH), která využívá fluorescenční hybridizační sondu komplementární ke studované lncRNA a umožňuje kvantifikaci a lokalizaci pomocí fluorescenčního mikroskopu. Firma LGC Biosearch Technologies nabízí sadu reagencií pod názvem Stelaris® RNA FISH a fluorescenčně značené sondy pro nejčastěji studované lncRNA vč. možnosti značení různými fluorofory pro simultánní detekci více biomolekul současně [49].

Další možnost kvantifikace lncRNA představuje elektrochemie, která nabízí relativně levné a nenáročné přístrojové vybavení, možnost miniaturizace a paralelního měření. Zajímavým příkladem je elektrochemický biosenzor založený na izotermální amplifikaci s dUTP značeným biotinem [50]. Amplikony byly přes vazbu streptavidin-biotin navázány na streptavidinové magnetické kuličky a zároveň označeny peroxidázou konjugovanou s biotinem (obr. 2). Výsledný komplex byl inkubován s tetrametylbenzidinem, jehož oxidovaný produkt vykazuje modré zbarvení pozorovatelné pouhým okem. Autoři kvantifikovali HOTAIR lncRNA spektrofotometricky při 652 nm a paralelně i elektrochemicky pomocí chronoamperometrie. Metoda byla vyvinuta na ovariálních nádorových liniích a validována na vzorcích plazmy od tří pacientek s epiteliálním ovariálním karcinomem a dvou benigních kontrol. Ještě novější je biosenzor pro detekci lncRNA MALAT1 pomocí zlatých nanočástic, polyamid-aminu, detekční sondy a peroxidázy [51]. Autoři zde demonstrovali použití biosenzoru na jaterních nádorových liniích, avšak použili vzorky krevní plazmy pouze pro hledání případných interferencí s detekční metodou přídavkem syntetické molekuly MALAT1 do vzorků plazmy.

Závěr

Přítomnost, a tudíž snadná detekovatelnost lncRNA nejen v tkáních, ale především v tělních tekutinách nabízí možnost širokého využití lncRNA jako prognostického a prediktivního biomarkeru. Velké množství lncRNA skýtá obrovský potenciál k diagnostickému využití, avšak dobře prostudovaných mechanizmů působení a funkcí lncRNA je doposud objasněno jen několik set. Díky tkáňové specificitě hladin lncRNA lze vybrat vhodné kandidáty pro včasný záchyt onkologických onemocnění i pro doplnění panelu již existujících biomarkerů za účelem zpřesnění diagnostiky. V posledních letech se provádějí zejména meta-analýzy kombinující výsledky jednotlivých studií, hledající na základě chování nádoru vhodný biomarker predikující jeho vlastnosti. I přes důležitost lncRNA bude pro jejich zařazení mezi klinicky relevantní biomarkery důležité vyvinout spolehlivé metody jejich detekce a prokázat, že hladiny studovaných lncRNA skutečně korelují s karcinogenezí, prognózou nebo rekurencí nádorového onemocnění.

Práce byla podpořena projekty MŠMT – NPU I – LO1413 a GAČR 17-08971S.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do bi omedicínských časopisů.

Mgr. Martin Bartošík, Ph.D.

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e-mail: martin.bartosik@mou.cz

Obdrženo/Submitted: 28. 5. 2019

Přijato/Accepted: 30. 7. 2019