Aktualizace poznatků o stavu měření 25-hydroxyvitaminu D v séru/plasmě. Minirewiew 2015 - 2016.

Souhrn

Cíl:
Aktualizace problémů měřením 25-hydroxyvitaminu D v séru

Metoda:
Informace z webových stránek a dokumentů mezinárodního programu standardizace vitaminu D (VDSP) a přehled recentních prací, týkajících se tématu.

Výsledky:
Prozatímní pozitivní efekt výsledků standardizace vitaminu D v programu VDSP není po cca jednom roce výrazný ani v preciznosti, ani v hodnotách bias měření. Vcelku podle očekávání mají větší problémy s analytickou kvalitou imunochemické metody než separační. Proces standardizace pokračuje v roce 2016 testováním komutability kontrolních materiálů CAP USA a DEQAS UK, které jsou plánovány jako nástroje verifikace standardizačního procesu v rutinních klinických laboratořích. Velké úsilí je věnováno negativním vlivům na kvalitu a ovlivnění imunochemických metod, kterých je celá řada. Tyto vlivy jsou o to složitější, že jsou velmi rozdílné u různých imunochemických metod. Patří sem různá úroveň křížových reakcí u 25-hydroxyvitaminu D2, interference 24, 25-dihydroxyvitaminu D, vliv vazebného proteinu pro vitamin D (VDBP) a rozdílná reaktivita imunochemických metod pro 3-epi-25-hydroxyvitamin D3.

Diskuse:
Diference hodnot bias způsobují významné diference v počtech jedinců při klasifikaci deficience vitaminu D, vliv 3-epi-25-OH D3 může dělat problémy při měření a klasifikaci u dětí a ovlivnění výsledků VDBP problematizuje používání imunochemických metod u dialyzovaných pacientů.

Klíčová slova:
VDSP, VDBP, 25-hydroxyvitamin D, 25-hydroxyvitamin D2, 24, 25-dihydroxyvitamin D, 3-epi hydroxyvitamin D3

Mezinárodní standardizační program VDSP/VDSCP (Vitamin D standardization program/vitamin D standardization certification program)

Poznatky o mezinárodním standardizačním procesu při měření vitaminu D jsou k nalezení na volně přístupném a obsahově aktualizovaném webu https://ods.nih.gov.

Z obsahu stránek vyjímáme pro naše sdělení některá data.

Reference

Systém VDSP používá dvou referenčních metod. Metody NIST [1] a metody GHENT [2]. Metoda Ghent dosahuje preciznosti 1 - 2,5 % a kombinované nejistoty 3 - 4 %, metoda NIST uvádí preciznost v intervalu CV= < 1 – 2 %. Metody stanovují souběžně 25-hydroxyvitamin D3 a 25-hydroxyvitamin D2. Certifikovanými referenčními materiály, na kterých je založena kalibrace referenčních metod systému VDSP jsou SRM 972a NIST a SRM 2972 NIST.

Cíle VDSP

• Tvorba referenčního měřícího systému
• Kalibrace komerčních kitů pomocí referenčního měřícího systému
• Verifikace standardizace v laboratořích pomocí systémů EQA/PT CAP a DEQAS (na oba uvedené systémy EQA/PT by měly navázat i ostatní národní systémy a být s nimi kompatibilní)

Hlavní organizátoři

• NIH ODS (National Institutes for Health-Office for Dietary Supplements
• NIST
• CDC (Centers for Diabetes Control and Prevention)
• DEQAS
• AACC
• IFCC
• a další

Organizátoři představují velmi autoritativní mezinárodní instituce a jejich závěry by měly být brány s odpovídající pozorností.

Komutabilita-Studie 2

Cílem studie je získání komutabilních kontrolních materiálů programů EHK, jmenovitě programů EQA/PT CAP US a DEQAS UK. Výsledky studie mají být podle plánu zveřejněny v září-říjnu 2016 na webech NIST (http://www.nist.gov) a NIH-ODS (https://www.ods.nih.gov). Provedení studie je podrobně popsáno na https://federalregister.gov a v práci [3].

VDSCP (Vitamin D standardizační certifikační program)

Kritéria certifikace jsou převzata z práce [4]. Požadovaná hodnota bias b% ≤ 5,0 (od referenčních metod NIST a GHENT), hodnota preciznosti CV% ≤ 10,0. Níže uvedené údaje se zdají být v praxi rutinních laboratoří momentálně nedosažitelné. V současné době byly vydány kromě řady měření metodami LC-MS/MS také certifikáty pro imunochemické automatizované metody Abbott Architect, DiaSorin Liaison, Siemens Advia Centaur, Roche, IDL iSYS (Abbott pro koncentrace nad 32,5 nmol/l).

Platnost certifikátů imunochemických metod končí v únoru 2016. Je vhodné zmínit se, že certifikace se nevztahuje na změnu šarží reagencií. Integrita výsledků při změně je věcí laboratoře a dále se nevztahuje na koncentrace mimo rozmezí 22,5 - 275 nmol/l. Není tedy udělení certifikátu automatickou zárukou kvality výsledků laboratoře, která certifikovanou metodu používá.

Vliv VDSP na výsledky v programu DEQAS u metod s certifikátem VDSCP

Preciznost 2015

Uvedené hodnoty preciznosti jsou převzaty z programů EHK RfB Německo a SEKK Česká republika. Výsledky SEKK prezentují preciznost ve skupinách CV = 10 – 28 %. Vše nad 10 %. Preciznost u programu DEQAS v říjnu 2015 (tedy již po zahájení certifikačního procesu VDSCP) byla po vyhodnocení 5 vzorků, 7 skupin metod (z toho 6 automatizovaných imunochemických) CV% > 10. U programu RfB 2015 v roce 2015 byla celková preciznost (mezilaboratorní reprodukovatelnost cca CV% = 20, hodnoty CV% jednotlivých skupin metod byly vždy > 10 % (včetně LC-MS/MS).

Pravdivost 2014 - 2015

Hodnoty bias před zahájením činnosti VDSP jsou uvedeny v Tabulce 1, v období první certifikační periody (2014 - 2015) v Tabulce 2.

Změny hodnot bias v období 2012-2015 nejsou navzdory probíhajícímu VDSP výrazné.

Imunochemické metody a diference mezi nimi

K dosavadním již zavedeným imunochemickým metodám přibyly dvě nové: VIDAS BioMérieux a Fujirebo. Výsledky testování byly nedávno publikovány. Metoda VIDAS v práci [5], metoda Fujirebo v práci [6]. Testování dvou nových imunochemických metod měření poskytla příležitost k posouzení úrovně srovnatelnosti mezi rutinními metodami a k potvrzení existence řady problémů analytických a z nich plynoucích problémů interpretačních. Diference jednotlivých imunochemických metod Fujirebo, Roche, Abbott a Beckman od metody LC-MS/MS v době prováděných experimentů programu VDSP jsou stále velmi významné. Číselně v intervalu -16 až 10 % u sér pacientů a -14 až 4 % u kontrolních materiálů. Výsledků pod 50 nmol/l (deficitní hodnoty) bylo podle metody v intervalu 11 - 21 %. Při testování VIDAS metody se korelační koeficienty imunochemických metod s LC-MS/MS metodou pohybovaly v intervalu 0,85 - 0,95 a směrnice kalibračních funkcí v intervalu 0,90 - 1,01.

Diference mezi rutinními metodami se závažnými klinickými důsledky jsou v rutinních laboratořích pozorovány i mezi imunochemickými a separačními metodami. V práci [7] je vyhodnoceno, že hodnoty bias mezi rutinní metodou LC-MS/MS (12,8 mmol/l) a imunochemickou metodou DiaSorin (-10,6 mmol/l), vypočtené jako diference od referenční ID-LC-MS/MS metody změnily hodnotu frekvence deficience vitaminu D z 12 % (rutinní LC-MS/MS) na 41 % (DiaSorin)

Zdroje systematických diferencí

24,25-dihydroxyvitamin D3

Přídavek 24,25-dihydroxyvitaminu D působí pozitivní bias při měření 25-hydroxyvitaminu D. Jeho hodnota je u jednotlivých imunochemických metod velmi odlišná. U separačních metod není tento vliv pozorován. V programu DEQAS (vzorek 465 z října 2014) byla hodnota celkového bias po spikování vzorku 24,25 dihydroxyvitaminu D o 48 % vyšší, než u vzorků bez spikování (obr. 1). Graf však ukazuje, nakolik byl vliv tohoto přídavku rozdílný u různých metod. Vliv vyjádřen růzností hodnot bias. Poměr 24,25-dihydroxyvitamin D / 25-hydroxyvitamin D má být údajně cenným ukazatelem stavu nedostatku vitaminu D při sledování jeho suplementace [8]. Samotné stanovení 24,25-dihydroxyvitaminu dosahuje zatím podle údaje z programu DEQAS (duben 2015, říjen 2015) nedostatečné úrovně preciznosti (CV% = 25 - 55 v dubnu 2015 a 27 - 33 v říjnu 2015).

3-epi-25-OH D3

3-epi-25-hydroxyvitamin D3 je známým interferentem stanovení 25-hydroxyvitaminu D. Z výsledků DEQAS v období 2014 - 2015, kdy byly koncentrace 3-epi-hydroxyvitaminu D3 ve vzorcích známé, lze usoudit, že do cca hodnot 6 nmol/l není vliv na bias měření 25-hydroxyvitaminu D významný. Problémem mohou být materiály dětí s typicky vyššími hodnotami 3-epi, dosahujícími někdy až 50 % hodnoty celkového 25-hydroxyvitaminu D. Imunochemické metody prakticky na přídavek 3-epi-25-OH D3 nereagují, pro separační metody není přítomnost 3-epi problémem, lze ji vyřešit uspořádáním separace. Například způsobem, popsaným v referenční metodě Ghent [2].

25-hydroxyvitamin D2 vs 25-hydroxyvitamin D3

Přídavek směsi endogenního 25-hydroxyvitaminu D2 a 25-hydroxyvitaminu D3 ve vzorcích DEQAS způsobil zvýšení hodnoty bias celkem až na 48 % (diference průměru všech měření proti hodnotě referenční metody), ovšem s obrovskou variabilitou u různých metod a i u vzorků. Výsledky u vzorku z října 2015 jsou uvedeny v grafu (obr. 2) (-9 až -31 %). Výsledky u vzorku z října 2014 dokonce ukázaly interval bias -17 až 123 %: metody LC-MS/MS na tento přídavek významně nereagují. Protože různé imunochemické metody mají velmi různou úroveň křížových imunoreakcí u vitaminu D2, lze předpokládat poměr vitaminů D2/D3 za další významný faktor hodnoty bias u imunochemických metod.

VDPB

Další pozorovanou a potvrzenou příčinou diferencí bias imunochemických metod vůči referenční LC-MS/MS metodě je vazebný protein VDSP, jak jeho koncentrace, různá u různých pacientů, tak i efektivita uvolňování vitaminu D z této vazby!

Imunochemické metody vykazují vlivem VDBP [9] velmi významné diference u dialyzovaných pacientů ve srovnání s ostatními [10]. Autoři pozorovali nárůst bias u Abbottu v průměru o 49 %. Nárůsty u iSYS a Roche byly nižší, ale rovněž významné.

Závěr

• Program standardizace VDSP probíhá a pokračuje.
• Vliv standardizace je zatím nedostatečný.
• Je řada faktorů nepříznivě ovlivňujících analytickou kvalitu imunochemických metod.
• Imunochemické metody mohou zkreslovat klinické závěry, např. při klasifikaci nedostatku u dětí, nebo u dialyzovaných pacientů.
• Separační metody vykazují podstatně vyšší analytickou robustnost.

Podpořeno MZ ČR - RVO (FNHK, 00179906)

Do redakce došlo 19. 1. 2016

Adresa pro korespondenci:

RNDr. Bedřich Friedecký, Ph.D.

ÚKBD FN Hradec Králové

Sokolská 581

500 05 Hradec Králové