Diabetes mellitus - laboratorní diagnostika a sledování stavu pacientů

1. Laboratorní diagnostika a sledování stavu pacientů

1.1. Stanovení glukózy jako nástroje pro určení diagnózy diabetu mellitu

Koncentrace FPG je nástrojem pro:

• určení diagnózy diabetu mellitu
• vyhledávání osob se zvýšeným rizikem diabetu mellitu

• 1.1.1. Diagnostická kritéria diabetu [1, 2, 3]
• Kombinace klinických symptomů s náhodným stanovením koncentrace glukózy v plazmě ≥ 11,1 mmol/l.
• Koncentrace glukózy v plazmě nalačno ≥ 7,0 mmol/l.
• Koncentrace glukózy v plazmě při orálním glukózovém tolerančním testu ≥ 11,1 mmol/l.

K učinění závěru o diagnóze diabetu je nezbytné potvrdit výsledek opakovaným měřením z dalšího odběru v některém z příštích dnů.

Grafické schéma rozhodovacího algoritmu pro laboratorní screening DM u dospělých uvádí Příloha 1.

Vyhledávání osob se zvýšeným rizikem diabetu

Zvýšené riziko diabetu je charakterizováno hodnotami FPG v intervalu hodnot 5,6 – 7,0 mmol/l. Tento stav je označovaný jako Impaired Fasting Glucose (IFG), zvýšená koncentrace glukózy nalačno, případně jako prediabetes.

• 1.1.2. Vztahy mezi koncentrací glukózy v krvi (B-glukóza), plazmě (FPG) a séru (S-glukóza) [6]

FPG = 1,11 · B-glukóza

jestliže je vzorek krve před analýzou ředěn hemolyzačním nebo deproteinačním činidlem

FPG = 0,94 · B-glukóza

jestliže je vzorek krve měřen bez ředění

Naprostá většina literárních dat považuje hodnoty koncentrací glukózy v plazmě a séru za rovnocenné. Doporučení WHO a ADA zmiňují pouze použití plazmy a vůbec nezmiňují krevní sérum.

Rozdíl mezi žilní a kapilární krví je dále uveden v kapitole Glukózový toleranční test (oGTT).

• 1.1.3. Rozhodovací meze

Protože hodnota intraindividuální biologické variability činí v průměru 5 %, je nezbytné provést diagnostický závěr na podkladě aspoň dvou výsledků nezávislých měření.

Hodnoty FPG 5,6 mmol/l a vyšší by měly být vždy opakovány pro podezření z možného potvrzení diagnózy diabetu mellitu, respektive pacienti s takovými hodnotami by měli být vyšetřováni s vyšší frekvencí.

• 1.1.4. Vyšetření v těhotenství

U všech žen je doporučeno, co nejdříve na začátku těhotenství stanovit koncentraci glukózy nalačno v žilní plazmě standardní laboratorní metodou.

Při hodnotě koncentrace glukózy nalačno ≥ 7,0 mmol/l (nebo HbA_1c ≥ 48 mmol/mol) se jedná o zjevný diabetes mellitus (overt diabetes) v těhotenství.

Gestační diabetes mellitus (GDM) je diagnostikován při opakovaném zjištění FPG v rozmezí 5,1 – 6,9 mmol/l.

Diagnózu DM či GDM lze stanovit na základě stanovení FPG v případě dvou pozitivních nálezů (nelze stanovit týž den). V případě jednoho pozitivního a jednoho negativního nálezu je indikovaný orální glukózový toleranční test (oGTT odstavec 9.3.)

• 1.1.5. Požadavky na průkaz analytické způsobilosti laboratoře

Doložená úspěšná účast v programu externího hodnocení kvality akreditovaném dle ISO 17043 (minimálně 2x ročně).

1.2. Glykovaný hemoglobin HbA_1c

Koncentrace HbA_1c v krvi je považována za rutinní a efektivní nástroj sledování průběhu DM. Hodnotu glykovaného hemoglobinu je možno použít v rámci screeningu poruch glukózové homeostázy, zejména ve vztahu k prediabetu. Představuje vhodný způsob kontroly koncentrací glukózy u diabetiků, neboť je považována za její vážený dlouhodobý průměr.

Koncentrace HbA_1c v krvi je v současnosti velmi často považována za nástroj screeningu prediabetu. Ke zvýšení citlivosti diagnózy diabetu je výhodné kombinovat stanovení FPG (případně s 2hod -oGTT) se stanovením HbA_1c.

• 1.2.1. Jednotky měření

Jednotkou měření je mmol/mol.

Paralelně s touto jednotkou zůstává v platnosti jednotka % NGSP. Ta se vypočítá z hodnot v jednotce mmol/mol podle vztahu:

výsledek_NGSP = (0,09148 x výsledek_IFCC) + 2,152

• 1.2.2. Nejistota výsledků měření

Hodnota intraindividuální biologické variability CV_i = 2 % je významně nižší než u FPG (CV_i = 5 %). Na základě kombinace dílčích nejistot odpovídajících soudobým úrovním preciznosti, bias a hodnotě CV_i lze odhadnout, že výsledná kombinovaná nejistota výsledku měření HbA_1c (odpovídající 95% intervalu spolehlivosti) U_c leží v intervalu 3 až 5 mmol/mol HbA_1c.

• 1.2.3. Rozhodovací meze

Sledování stavu choroby

Literární údaje týkající se rozhodovacích mezí se mnohdy liší. Příčinou těchto rozdílů je i nejistota stanovení HbA_1c, která v závislosti na zvolené měřicí technice může dosahovat maximální velikosti U_c = 5 mmol/mol.

Plná krev odebraná ze žíly nebo kapilární krev odebraná po vpichu z prstu jsou rovnocenné materiály.

Diagnóza diabetu

• 1.2.4. Požadavky na průkaz analytické způsobilosti

Doložená účast v programu externího hodnocení kvality akreditovaném dle ISO 17043 (minimálně 2x ročně).

1.3. Preanalytika

Správný odběr krve a minimalizace glykolýzy ve vzorcích v době mezi odběrem a měřením koncentrace glukózy jsou zcela zásadním požadavkem, který ovlivňuje kvalitu diagnostiky diabetu. Minimalizace glykolýzy je možné dosáhnout:

• a) uložením odebraných vzorků do ledové tříště
• b) použitím antiglykolytického přípravku
• c) oddělením plazmy od krevních elementů do 30 minut od odběru

Pokud není možné zajistit oddělení plazmy od elementů do 30 minut, pak se vzorek žilní krve vždy odebírá do odběrové nádobky s obsahem inhibitoru glykolýzy. Nejvhodnější alternativou je odběr do nádobek obsahujících kromě fluoridu a EDTA i citrát sodný (k dosažení pH 5,7).

Takové odběrové zkumavky nabízí téměř všichni distributoři uzavřených odběrových systémů.

Další požadavky na preanalytickou fázi u jednotlivých analytů a možné interference jsou uvedeny v Příloze 4.

1.4. POCT

Koncentrace glukózy v kapilární krvi, stanovená pomocí osobního glukometru, je nástrojem sledování stavu všech diabetiků závislých na inzulinu (diabetes 1. typu) a některých vybraných skupin diabetiků 2. typu. Toto sledování nehraje žádnou roli v diagnostice diabetu a nemá s ní ani žádnou spojitost.

• 1.4.1. Základní požadavky na glukometry

Na trhu jsou k dispozici desítky různých typů glukometrů produkovaných řadou výrobců. Úroveň shody mezi výsledky dosaženými různými typy glukometrů je však doposud nedostatečná [10, 11]. Rozhodující při volbě glukometru je splnění požadavků na kvalitu podle kritérií normy ISO 15197:2013 [23], která vymezuje všechny zásadní požadavky. Základní analytické požadavky na glukometry jsou shrnuty v Doporučení k použití, výběru a kontrole glukometrů [24]. Další významné požadavky jsou:

• Používání nových typů instrumentace s vyloučením nutnosti odstraňovat přebytek krve, s akustickou kontrolou objemu vzorku, s automatickým časováním doby reakce, se čtečkou čárového kódu, s možností ukládat data výsledků vzorků a kontrolních analýz do paměti glukometru.
• Preferování glukometrů, uvádějících v průvodní dokumentaci základní metrologická data měření (preciznost, maximální bias, měřicí rozsah, způsob a možnosti provádění VKK a EHK).

• Preferování glukometrů, certifikovaných některým z k tomu pověřených institutů:

Scandinavian evaluation of laboratory equipment for primary health care - SKUP http://www.skup.nu

Referenční laboratoř ÚLBLD VFN a 1. LF UK, Praha. (http://ulbld.lf1.cuni.cz/referencni-lab)

Hodnoty rozhodovacích mezí a četnost měření nejsou striktně definovány.

Kontroly osobních glukometrů srovnáním s měřením v laboratoři se doporučuje provádět v pravidelných časových intervalech minimálně jednou ročně.

• 1.4.2. Požadavky na průkaz analytické způsobilosti
• Zavedený a fungující systém vnitřní kontroly kvality.
• Systém zácviku a prověřování jeho účinnosti u osob používajících glukometry (zdravotnického nelaboratorního personálu a pacientů).
• Doložená účast v programu externího hodnocení kvality akreditovaném dle ISO 17043 (2 účasti ročně).
• Používání glukometru v souladu s Doporučením o POCT [13].

1.5. Kontinuální monitorování glukózy

Zvláštní problematiku tvoří používání systémů pro kontinuální monitoraci koncentrace glukózy, které pacientům poskytují dynamické informace o vývoji koncentrace glukózy a umožňují bezpečnější dosažení lepší kompenzace diabetu. Systém pro kontinuální monitorování koncentrace glukózy (CGM) měří koncentraci glukózy v reálném čase po 24 hodin denně. CGM se skládá ze snímače glukózy zavedeného pod kůži, který měří koncentraci glukózy, vysílače, který vysílá informace ze snímače do inzulinové pumpy a inzulinové pumpy, která zobrazuje koncentraci glukózy na displeji pumpy. Systém používá časné upozornění blížících se nízkých a vysokých hodnot a alarm při nízkých a vysokých hodnotách. Tyto systémy v současné době vyžadují denně kalibraci pomocí osobního glukometru.

Diference výsledků CGM od referenční hodnoty, stanovené laboratorní metodou v plazmě by měly být nižší než 15 %.

1.6. Albumin v moči

Měření koncentrace albuminu v moči diabetiků vykazuje významnou schopnost včasné predikce diabetické nefropatie a stanovení kardiovaskulárního rizika (parametr endotelové dysfunkce). Zvýšené vylučování albuminu močí, které předpovídá stav nefropatie, ale které není detekovatelné kvalitativními metodami realizovanými běžnými testovacími proužky pro průkaz proteinů v moči či jinými metodami kvalitativní analýzy, se dříve označovalo jako mikroalbuminurie.

Pacienti s diabetem by měli být testováni na přítomnost diabetického onemocnění ledvin jednou ročně. Screening je doporučen u pacientů s diabetem mellitem 1. typu (děti a adolescenti) od 5. roku od zjištění diagnózy diabetu každý rok. U pacientů s diabetem mellitem 2. typu je doporučeno provádět vyšetření 1x ročně.

• 1.6.1. Screening

Screening zahrnuje stanovení poměru albumin/krea-tinin v prvním ranním vzorku moči. Vyšetření albuminu v moči sbírané 24 hodin se nedoporučuje, je však možné vyšetřit albuminurii ve vzorku moči sbíraném během klidu na lůžku v noci; výsledek je pak vydáván v μg/min. V praxi se však dává přednost vyšetření v jednorázovém vzorku moči, výsledek se vztahuje ke koncentraci kreatininu v moči (g/mol kreatininu). Vzhledem k vysoké intraindividuální variabilitě (až 30 %) by pro diagnózu albuminurie měly být pozitivní alespoň 2 ze 3 po sobě následujících vzorků moči analyzovaných v intervalu 3 až 6 měsíců [1, 2].

Vyšetření by nemělo být prováděno při současné infekci močových cest, po zvýšené fyzické námaze a při menses.

Hodnoty přesahující horní hranice rozhodovacích mezí jsou označovány jako proteinurie. Ty lze již spolehlivě detekovat kvalitativními zkouškami na celkové bílkoviny prováděnými testovacími proužky. Naopak analýza vzorků s proteinurií je zcela nevhodná ke stanovení albuminurie imunochemickými metodami (je překročen pracovní rozsah měření a může dojít k „hook efektu“).

Kvalitativní a semikvantitativní zkoušky nejsou dostatečně citlivé, při pozitivním výsledku je nutno tento nález vždy ověřit v laboratoři. Kvalitativní detekce albuminurie může hrát roli pouze jako nástroj screeningu, avšak každý pozitivní nález musí být potvrzen kvantitativním měřením.

Podrobněji viz společné doporučení České společnosti klinické biochemie a České nefrologické společnosti Doporučení k diagnostice chronického onemocnění ledvin (odhad glomerulární filtrace a vyšetřování proteinurie) a mezinárodní doporučení KDIGO 2012 [25, 26].

Jestliže je výsledek měření vyšší než hodnota rozhodovacího limitu, je diagnostický závěr možné učinit až na podkladě tří opakovaných měření.

• 1.6.2. Diabetická nefropatie

Diabetická nefropatie je klinický syndrom charakterizovaný persistentní albuminurií (> 300 mg/24 hod nebo > 200 µg/min) prokázanou při alespoň dvou stanoveních, mezi kterými uplynulo 3 až 6 měsíců. Tento nález odpovídá nálezu proteinurie > 500 mg/24 hodin. U pacientů s diabetickou nefropatií se v průběhu onemocnění vyvíjí hypertenze (která může být přítomna již v době diagnózy), narůstá proteinurie a dochází k progresivnímu poklesu glomerulární filtrace a nakonec vývoji terminálního selhání ledvin.

• 1.6.3. Požadavky na průkaz analytické způsobilosti

Doložená účast v programu externího hodnocení kvality akreditovaném dle ISO 17043 (2 účasti ročně).

1.7. Koncentrace glukózy v moči

Stanovení glukózy v moči není doporučeno pro diagnostiku a sledování pacienta s diagnózou DM. Pohled na glykosurii se však zásadně mění v souvislosti s recentním používáním terapie pomocí inhibice Na-glukózového kotransportéru SGLT 2, kdy zvýšená exkrece glukózy močí je důsledkem této léčby [27].

1.8. Koncentrace ketolátek v moči a krvi

Stanovení ketolátek v krvi a moči má význam pro diagnózu diabetické ketoacidózy. Ketolátky mají být stanovovány u diabetických pacientů s hodnotou glukózy nad 16,7 mmol/l a též při výskytu klinických symptomů diabetické ketoacidózy. V krvi a moči jsou přítomny tři ketolátky: kyselina acetoctová, aceton a kyselina β-hydroxymáselná (3 hydroxybutyrát). Klasické testovací proužky jsou však schopné detekovat pouze kyselinu acetoctovou a aceton (ketony), nikoliv kyselinu β-hydroxymáselnou. Za normálního stavu jsou kyselina acetoctová a β-hydroxymáselná přítomny v krvi a moči v ekvimolárních množstvích. Avšak při tkáňové hypoxii je kyselina acetoctová redukována na kyselinu β-hydroxymáselnou a v důsledku toho klasické testovací proužky významně podhodnocují celkovou koncentraci ketolátek.

Shrnutí klinické interpretace

• Stanovení ketonů v moči klasickými metodami není podloženo důkazy při diagnostice diabetické ketoacidózy ani k sledování jejího průběhu.
• Stanovení ketonů v krvi klasickými metodami lze použít v procesu diagnózy diabetické ketoacidózy, nikoliv však k sledování jejího průběhu.
• Stanovení kyseliny β-hydroxymáselné lze doporučit jak k diagnostikování, tak ke sledování průběhu diabetické ketoacidózy, avšak případné výhody tohoto přístupu vůči tradičním metodám také nejsou dostatečně podloženy důkazy.

1.9. Glukózový toleranční test (oGTT)

Orální glukózový toleranční test se používá k potvrzení diagnózy diabetes mellitus v případě, že diagnóza není jednoznačně potvrzena nálezem FPG vyšším než 7,0 mmol/l. Jde jednak o stavy IFG (zvýšená glykemie nalačno) s hodnotami FPG 5,6 až 7 mmol/l, jednak v situacích s FPG nižší než 5,6 mmol/l, při nichž bylo vysloveno podezření na poruchu tolerance glukózy z předchozích vyšetření nebo jedná-li se o jedince se zvýšeným rizikem vzniku diabetu. Při nálezu porušené glukózové tolerance se oGTT opakuje ve dvouletých intervalech.

• 1.9.1. Provedení a vyhodnocení

Podle doporučení WHO lze oGTT doporučit jako doplňující diagnostickou zkoušku v případech, kdy se hodnota FPG pohybuje v intervalu 5,6 až 7,0 mmol/l. oGTT se však doporučuje k potvrzení diagnózy prediabetu a slouží k diagnóze gestačního diabetu.

• 1.9.2. Rozhodovací meze

Koncentrace plazmatické glukózy v plazmě žilní krve po 2 hodinách po zátěži 75 g glukózy.

K vyslovení diagnózy musí být překročení rozhodovacího limitu potvrzeno opakovaně.

• 1.9.3. oGTT u dětí

U dětí se standardně (dle WHO i ADA) počítá použitá dávka glukózy pro oGTT 1,75 g/kg tělesné hmotnosti do maxima 75 gramů.

• 1.9.4. oGTT a diagnostika gestačního diabetu

Používá se zátěž 75 g glukózy a hodnotí se koncentrace glukózy v plazmě před zátěží, 1 a 2 hodiny po zátěži. Gestační diabetes je laboratorně diagnostikován, je-li dosaženo aspoň jednoho ze tří uvedených kritérií:

• FPG ≥ 5,1 mmol/l
• P-glukóza po 1 hodině ≥ 10,0 mmol/l
• P-glukóza po 2 hodinách ≥ 8,5 mmol/l

oGTT se provádí ve 24. - 28. týdnu gravidity u všech těhotných žen, u nichž byl screening GDM na začátku těhotenství negativní.

Grafické schéma algoritmu pro laboratorní screening gestačního DM – viz Příloha 2.

1.10. C-peptid a inzulin

Stanovení C-peptidu a inzulinu není zakotveno v žádném doporučení pro diagnostiku diabetu a nemá význam při rutinním sledování pacientů s DM. Stanovení C-peptidu se provádí při rozhodování o vhodnosti volby terapie inzulinem u diabetu 2. typu, tj. při podezření na selhání sekrece inzulinu. Vyšetření inzulinu má význam při podezření na inzulinovou rezistenci u syndromu polycystických ovárií a při diagnostice inzulinomu.

1.11. Autoprotilátky

Tyto testy nejsou doporučovány jako nástroje rutinní diagnózy diabetu mellitu, ale jsou vhodné při podezření na autoimunitní původ diabetu. Slouží zejména při podezření na diabetes LADA (latentní autoimunitní diabetes dospělých, tj. pomalu progredující diabetes 1. typu) a dále též k vyhledávání vhodných dobrovolných dárců k provedení transplantace částí pankreatu pro indikované případy terapie diabetiků 1. typu. Protilátky jsou často prokázány dříve, než se klinicky projeví onemocnění. U 1 až 2 % populace se vyskytuje jeden typ protilátky a při tomto nálezu je riziko vzniku auto-imunitního diabetu nízké. Při nálezu více autoprotilátek riziko stoupá až na 90 %. Vysokou výpovědní hodnotu má kombinované vyšetření tří autoprotilátek anti IAA, anti GAD a anti IA-2.

Screening autoprotilátek u příbuzných pacientů s diabetem mellitem 2. typu není doporučený.

Diabetes mellitus se může sdružovat s tyreopatiemi v rámci tzv. sdružených autoimunit. Přítomnost tyreopatie pak případně může ovlivnit i stav jeho kompenzace. Vzhledem k často subklinickému průběhu je screening tyreopatií vhodný. U každého diabetika má být vyšetřen TSH a v případě diabetu 1. typu se provádí vyšetření protilátek proti tyreoglobulinu (anti TG) a proti tyroidální peroxidáze (anti TPO).

Riziko asymptomatické, němé formy celiakie je v populaci 1:200. U diabetu mellitu 1. typu, podobně jako u jiných autoimunitních onemocnění, je toto riziko 10x větší a popsaná incidence je 1:20.

Význam diagnostiky celiakie je doložen pozitivním efektem dodržování bezlepkové diety. Při dodržování bezlepkové diety klesá riziko malignit zažívacího traktu a dochází ke zlepšení kontroly vlastního diabetu.

2. Teoretické podklady a analytické podmínky

2.1. Glukóza

• 2.1.1. Eliminace vlivu glykolýzy ve vzorcích odebrané krve

Glykolýza snižuje významně koncentraci glukózy ve vzorcích odebraných krví. Inhibice glykolýzy pomocí fluoridu sodného + EDTA je nedostatečná, zejména v první hodině po odběru. Přesto se této neúčinné inhibice v laboratořích i nadále používá. V roce 1988 byla vyvinuta a v USA patentována pro potřebu firmy Terumo zlepšená inhibice glykolýzy přidáním citrátu sodného a kyseliny citronové. Podstatou zlepšení je snížení pH v odběrové směsi na hodnotu 5,3 - 5,9. Enzymy závislé na pH, které způsobují glykolýzu ihned po odběru (hexokináza a fosfofruktokináza), jsou deaktivovány nízkým pH citrátu, zatímco fluoridy deaktivují jen enolázu (fosfopyruvát hydratáza), která je téměř na konci glykolytické metabolické cesty.

Na trhu je několik odběrových nádobek používajících zlepšené antiglykolytické směsi NaF, citrátu, EDTA (tyto jsou uvedeny v příloze 4 doporučení). Urgentní potřebu vyřešení problému glykolýzy a stability glukózy v krvi potvrzuje i článek uveřejněný v časopise Diabetes Care [33]. K dosažení minimalizace negativních efektů glykolýzy na diagnostiku diabetu jsou k dispozici účinné nástroje. Jejich obecné používání narazí na řadu organizačních a technických problémů, ale ty nepředstavují závažný důvod minimalizaci glykolýzy nedoporučit a neřešit.

• 2.1.2. Požadavky na analytickou kvalitu měření

Z dat uvedených v tabulce plyne hodnota six-sigma σ ≥ 2,0.

• 2.1.3. Metrologická návaznost

Referenční metody měření FPG jsou založeny na principu ID-GC(LC)/MS. Tyto referenční metody slouží pomocí nepřerušovaného řetězce metrologické návaznosti ke stanovení hodnot glukózy v referenčních materiálech, používaných ke kalibraci rutinních metod měření.

Certifikované referenční materiály mají hodnoty koncentrace glukózy stanovené referenční metodou v referenční laboratoři - disponují certifikovanými hodnotami koncentrace glukózy včetně nejistoty této hodnoty a mají být testované na komutabilitu (má být prokázáno, že vlivy matrice jsou minimalizovány - zanedbatelné).

Klinické laboratoře mají používat pouze takové kalibrátory, jejichž výrobci jsou schopni dokumentovat v souladu se Směrnicí 98/79 ES a s nařízením vlády České republiky 458/2004 Sb., že hodnoty koncentrace glukózy v nich jsou určeny srovnáním s certifikovanými referenčními materiály. To značí, že kalibrátory rutinních metod mají mít dokumentovanou metrologickou návaznost na referenční metodu ID GC/MS. Výrobci mají uvádět nejistoty hodnot těchto kalibrátorů.

Hodnoty preciznosti a bias jsou odvozeny z hodnot biologických variabilit. Při dosažení těchto hodnot preciznosti a bias je dosaženo vysoké pravděpodobnosti, že četnost falešných diagnostických klasifikací nepřekročí hodnotu 5 % [7] pokud jsou provedena dvě nezávislá měření u jednoho pacienta.

• 2.1.4. Požadavky na analytickou kvalitu měření - POCT systémy

Celková chyba měření je vypočtena jako odchylka od výsledku akreditované klinické laboratoře při měření FPG: [12].

Tyto požadavky jsou převzaty z normy ISO 15197 (22) a mohou sloužit jako základní orientace při výběru osobních glukometrů v souladu s doporučeními POCT vypracovanými výborem České společnosti klinické biochemie [13].

• 2.1.5. Kontinuální monitorování glukózy (CGM)

Systém CGM se skládá z invazivního senzoru na jedno použití, který měří po dobu šesti (senzory Enlite, Medtronic) nebo sedmi dnů (senzory Platinum, Dexcom), dále transmiteru napojeného na senzor (vysílá data do přijímače) a vlastního přijímače, který signál vyhodnocuje a podle typu CGM buď data pouze uchová, nebo pacientovi v reálném čase ukazuje hodnoty glykémie včetně trendů a vydává varování při dosažení kritické koncentrace glukózy nebo rychlosti její změny. Přijímačem signálu může být i inzulínová pumpa (Paradigm Veo a 640G, Medtronic nebo Animas Vibe, Johnson&Johnson). Pumpy výrobce Medtronic mohou na základě uživatelského nastavení při současném použití senzoru zastavit podávání inzulínu při hypoglykémii (Paradigm Veo), nebo na základě predikce trendu ještě před ní (640G). Přesnost senzoru se v závislosti na typu senzoru a času od jeho zavedení pohybuje typicky v hodnotách MARD 10 – 15 %.

V současnosti jsou systémy CGM používány dvěma způsoby. Profesionální CGM je prováděno lékaři a probíhá v tzv. zaslepeném módu. Pacient se chová běžným způsobem, hodnoty koncentrace glukózy systém neukazuje a průběh monitorace je zjištěn až lékařem po stažení dat ze systému CGM. Na základě výsledků je možné provádět např. diagnostiku nočních a nerozpoznaných hypoglykémií nebo hodnotit compliance pacienta. Tento nástroj lze s výhodou použít k rozhodnutí o úpravě terapie a hodnocení jejího efektu. Druhým způsobem použití je monitorace glukózy v reálném čase. Pacient je nepřetržitě (k aktualizaci hodnot dochází v pětiminutových intervalech) informován o aktuální hodnotě koncentrace glukózy, trendech a dosažení kritických hodnot. Tento způsob CGM je spojen se snížením výskytu hypoglykémií a glykemické variability, zvýšením podílu času stráveném v cílovém rozmezí glykémie a vede k poklesu hodnoty HbA_1c, ovšem pouze za podmínky, že je používán více než přibližně polovinu času.

Technologie CGM je velmi perspektivní a dá se očekávat, že v relativně blízké budoucnosti dojde k jejímu většímu rozšíření. Zatím mu na straně pacientů brání především vysoké náklady na trvalé použití a psychologické bariéry související s nutností věnovat systému CGM prakticky neustálou pozornost.

2.2. Glykovaný hemoglobin HbA_1c

Glykovaný hemoglobin HbA_1c vyjadřuje dlouhodobý stav glykémie za 8 až 12 týdnů, hodnota FPG zachycuje okamžitý stav glykémie. Okamžitá hodnota glykémie je ovlivněna řadou vnějších faktorů, hodnota HbA_1c může být zkreslena (snížena) vlivem zkrácení doby života erytrocytů.

• 2.2.1. Výhody stanovení glykovaného hemoglobinu HbA_1c ve srovnání s FPG
• není nutné lačnění pacienta
• odběr lze provést kdykoliv bez nějaké přípravné doby
• preanalytické podmínky jsou při stanovení HbA_1c mnohem jednodušší než u stanovení glukózy (například stabilita v čase, žádná glykolýza)
• biologická variabilita HbA_1c je významně příznivější (CV_i = 2,0 %), než u FPG (CV_i = 5,0 %)

• 2.2.2. Nevýhody stanovení glykovaného hemoglobinu HbA_1c ve srovnání s FPG
• změna střední doby života erytrocytu (zatím není spolehlivá metoda jejího měření)
• interference patologických hemoglobinů jsou závislé na metodě/přístroji a postupně jsou úspěšně řešeny. Aktualizované informace lze nalézt na http://www.ngsp.org

Rozdíly mezi stanovením HbA_1c a FPG ale nejsou důvodem k odmítnutí HbA_1c jako diagnostického nástroje diabetu, zachycují jen problémy mezi oběma analyty v celé šíři při všech jejich možných použitích. Také dále uvedený vliv doby života erytrocytů ovlivňuje HbA_1c jak při použití pro sledování, tak i pro diagnostiku diabetu.

Střední doba života erytrocytů se pohybuje v rozmezí 100 až 140 dnů s průměrem 120 dnů. V literatuře je uváděna obvykle jako 120 ± 10 dnů. Již tento rozptyl údajně způsobuje významnou variabilitu hodnot HbA_1c (viz tabulka).

Změny hodnot HbA_1c pro střední hodnotu HbA_1c = 53 mmol/mol při zvolené střední době života erytrocytů 120 dnů.

• 2.2.3. Požadavky na analytickou kvalitu měření

Hodnoty indikátorů analytické kvality měření jsou převzaty z dat IFCC Task Force On Implementation of HbA_1c Standardization [30, 31] jsou uvedeny v následující tabulce:

Z dat uvedených v tabulce plyne hodnota six-sigma σ ≥ 2,0.

Tyto požadavky bylo schopno v roce 2014 splnit 77 % laboratoří Nizozemska, Belgie, Finska a Řecka a 12 testovacích souprav z 26 použitých (program CAP NGSP USA).

Existují diference mezi úrovní kvality dosažené různými diagnostiky a metodami.

Pořadí metod podle kvality lze v současnosti stanovit následovně (v uvedené řadě hodnoty indikátorů kvality klesají):

• kapilární elektroforéza
• afinitní HPLC
• ionexová HPLC
• imunoanalytické metody.

Podobný obraz byl získán při individuálním hodnocení jednotlivých laboratoří a také podle výsledků PT CAP / NGSP USA GH 2014 (www.ngsp.org).

Program RCPA Austrálie považuje za kritérium kvality hodnotu TE = 4 mmol/mol (pro HbA_1c ≤ 45 mmol/mol a 8 % (pro HbA_1c > 45 mmol/mol).

Program CAP/NGSP používá kritérium D_max = 6 % pro jednotky NGSP, což odpovídá hodnotě D_max = 8 % pro výsledky v jednotkách IFCC (mmol/mol).

• 2.2.4. Přepočtové vztahy pro výsledky uvedené v jiných jednotkách

Přepočet z jednotky % IFCC (v ČR používána do 31. 12. 2011) na jednotku mmol/mol:

X_mmol/mol = 10 · X_%IFCC

Přepočet z jednotky % NGSP/DCCT (jednotka % NGSP/DCCT zůstává nadále v platnosti a používá se zejména v USA. V ČR není používána od 1. 1. 2004) na jednotku mmol/mol:

X_mmol/mol = (X_%NGSP/DCCT – 2,152) / 0,09148

• 2.2.5. Metrologická návaznost

Rutinní metody měření mají vykazovat metrologickou návaznost na referenční metodu IFCC [7]. Referenční metoda IFCC je založena na principu HPLC/MS nebo alternativně HPLC/CE. Certifikované referenční materiály mají hodnoty HbA_1c stanovené referenční metodou - disponují tedy certifikovanými hodnotami HbA_1c včetně nejistoty této hodnoty a mají být testované na komutabilitu. Klinické laboratoře mají používat kalibrátory, jejichž výrobci jsou schopni dokumentovat v souladu se Direktivou 98/79 ES a s nařízením vlády České republiky 458/2004 Sb., že hodnoty HbA_1c v nich jsou určeny srovnáním s certifikovanými referenčními materiály.

Metody POCT jsou považovány až na výjimky za orientační a měly by být pravidelně ověřovány srovnáním s výsledky klinických laboratoří

• 2.2.6. Standardizace stanovení HbA_1c

Je založena na celosvětovém konsensu pěti mezinárodních lékařských organizací [8], zabývajících se diabetem:

• IDF (International Diabetes Federation)
• ADA (American Diabetes Association)
• EASD (European Association for the Study of Diabetes)
• IFCC (International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine)
• ISPAD (International Society for Pediatric and Adolescent Diabetes)

Uvedený konsenzus byl uveřejněn v roce 2010.

Hlavními rysy tohoto konsenzu jsou:

• Celosvětová platnost
• Jednotný referenční systém měření
• Použití základní jednotky měření mmol/mol HbA_1c
• Možnost přepočtu výsledků v měření v mmol/mol na jednotku % NGSP podle vzorce: % NGSP = (0,0915 x IFCC) +2,15

Referenční systém měření sestává z [28, 29] :

• referenční metody IFCC na bázi HPLC-MS (HPLC-CE)
• certifikovaných referenčních materiálů IRMM/IFCC 467 a 468
• sítě mezinárodních referenčních laboratoří (uvedena na http://www.ngsp.org).

Klinická hodnota stanovení HbA_1c spočívá v:

• monitorování dlouhodobé hodnoty koncentrace glukózy v krvi
• nastavení odpovídající terapie DM
• posouzení kvality péče o diabetika
• hodnocení rizika vývoje mikrovaskulárních komplikací
• screeningu rizika diabetu a v diagnóze diabetu.

• 2.2.7. Doporučení WHO 2011 o diagnóze diabetu (stanovení HbA_1c)

Považuje stanovení HbA_1c za základní nástroj diagnózy diabetu. Rozhodovacím limitem pro diagnózu je hodnota HbA_1c ≥ 48 mmol/mol.

Zmiňuje se také o použití POCT v diagnostice a konstatuje jeho striktní omezení na přístroje procházející úspěšně a dlouhodobě kontrolou kvality prováděnou srovnáním s hodnotami referenčních metod a s použitím komutabilních kontrolních materiálů. V současnosti se spektrum vhodných POCT přístrojů omezuje pouze na POCT systémy Afinion – ALERE a Siemens DCA Vantage. Nově jsou pozitivně testovány i POCT systémy B-Analyst (Menarini) a Cobas B101 (Roche), ale na jejich prověření se čeká.

Doporučení WHO 2011 však zpochybňuje použití glykovaného hemoglobinu HbA_1c k diagnóze v řadě případů:

• u dětí a adolescentů
• v těhotenství
• u renálních chorob
• u pankreatitidy
• u diabetu mellitu I
• v období akutní choroby (až do jejího odeznění)
• u anemických stavů.

WHO doporučení 2011 bylo přijato britskými diabetology (UK Department of Health Advisory Committee on Diabetes) a publikováno [32].

2.3. Albumin

Současné imunochemické metody poskytují výsledky, které jsou dostatečně kvalitní pro diagnostická rozhodování. Imunoturbidimetrie a imunonefelometrie převládá při stanovení albuminu v moči.

Vylučování albuminu močí, které může predikovat nefropatii, má být stanovováno v laboratoři metodami s těmito parametry:

Jako referenční metoda je navržena metoda LC-MS/MS.

Akceptovatelné hodnoty bias mají být zabezpečeny realizací metrologické návaznosti rutinní metody na mezinárodní referenční materiál ERM-DA470k/IFCC.

2.4. Ketolátky

Při diabetické ketoacidóze dochází ke tkáňové hypoxii, proto má pro její diagnózu mnohem větší význam stanovení kyseliny β-hydroxymáselné než klasické stanovení ketolátek standardními testovacími proužky.

Při stanovení ketonů v krvi klasickými testovacími proužky nebo tabletami na bázi nitroprussidové barevné reakce není kyselina β-hydroxymáselná detekována. K dispozici již jsou metody určené přímo k měření kyseliny β hydroxymáselné v krvi. Validní data o analytických znacích metody a ukazatelích analytické kvality nejsou dosud k dispozici nebo jsou kontroverzní.

2.5. C-peptid a inzulin

Oba parametry se stanovují imunoanalytickými metodami a výsledky závisí na použité metodě. Standardizace výsledků měření obou analytů je v současné době ve vývoji.

Pro stanovení C-peptidu se používá standard WHO IRR 84/510 [17]. Mezilaboratorní experiment, provedený ve 20 laboratořích s použitím 12 vzorků a 8 různých metod, ukázal rozdíly mezi výsledky metod měření C-peptidu až 90 % a nárůst chyby s rostoucí koncentrací. Souběžně prováděné přepočty na referenční materiál WHO IRR 84/510 nevedly k podstatnému zlepšení [20]. Studie stanovení C peptidu na analyzátoru Architect ukázaly preciznost 2,1 - 6,5 % a hodnotu recovery 99 až 112 % [21]. Jiné údaje o imunochemických stanoveních C-peptidu došly k hodnotám preciznosti 8 – 12 % a chybě měření 25 %.

Pro inzulin byla navržena referenční metoda na principu ID LC/MS/MS. Bias rutinních metod pro stanovení inzulinu před standardizací byl vyšší než 16 %. Standardizace vedla ke zlepšení pouze po přepočtu na soupravu sér s hodnotami stanovenými metodou ID-MS [18]. Marcovinová a spol. udávají preciznost mezi metodami v intervalu 12 % až 66 % a celkovou chybu u sedmi z deseti testovaných souprav nad 32 % (což je hodnota odvozená z biologických variabilit) [22].

3. Zkratky

ACE-I Inhibitory angiotenzin konvertujícího enzymu

ACR albumin-creatinine ratio (poměr koncentrace albuminu a kreatininu)

ADA American Diabetes Association (Americká diabetologická společnost)

CRM Certified Reference Material (Certifikovaný referenční materiál)

CV Coefficient of Variation (variační koeficient, relativní směrodatná odchylka)

CV_a Analytická preciznost vyjádřená jako variační koeficient (odhad preciznosti výsledků měření)

CV_g Interindividuální biologická variabilita vyjádřená variačním koeficientem

CV_i Intraindividuální biologická variabilita vyjádřená variačním koeficientem

DCCT Diabetes Control and Complications Trial (Součást vědecké výzkumné báze Americké diabetologické společnosti)

DM Diabetes mellitus

EASD European Association for the Study of Diabetes (Evropská asociace pro studium diabetu)

EDTA Sůl kyseliny etyléndiaminotetraoctové

EHK Externí hodnocení kvality

ERM European Reference Material (Evropský certifikovaný referenční materiál)

FPG Fasting Plasma Glucose (plazmatická koncentrace glukózy v žilní krvi nalačno)

GDM Gestační diabetes mellitus

HbA_1c Glykovaný hemoglobin A_1c

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Vysokoúčinná kapalinová chromatografie)

HPLC/CE High Performance Liquid Chromatography / Capillary Electrophoresis (Vysokoúčinná kapalinová chromatografie v kombinaci s kapilární elektroforézou)

HPLC/MS High Performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry (Vysokoúčinná kapalinová chromatografie v kombinaci s hmotnostní spektrometrií)

ID/MS Isotopic dilution – Mass spektrometry (Hmotnostní spektrometrie s izotopovým zřeďováním)

IDF International Diabetes Federation (Mezinárodní diabetologická federace)

IFCC International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (Mezinárodní federace klinické chemie a laboratorní medicíny – vrcholný světový orgán laboratorní medicíny)

IFG Impaired Plasma Glucose (mírně zvýšená plazmatická koncentrace glukózy v žilní krvi nalačno, často též označovaná jako prediabetes)

IGT Impaired Glucose Tolerance (porušená glukózová tolerance)

IRMM Institute for Reference Materials and Measurements (Ústav pro referenční materiály a měření v Geelu)

ISPAD International Society for Pediatrics and Adolescent Diabetes (Mezinárodní společnost pro diabetes v pediatrii a u adolescentů)

K₂EDTA Draselná sůl kyseliny etyléndiaminotetraoctové

LC-MS/MS Liquid Chromatography / Tandem Mass Spectrometry (Kapalinová chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií)

MARD Mean absolute relative difference

NGSP National Glycohemoglobin Standardization Program (Národní program pro standardizaci glykovaného hemoglobinu HbA_1c v USA)

oGTT Glukózový toleranční test

PCR Protein - creatinine ratio (poměr bílkovina - kreatinin)

POCT Point of Care Testing (testování u lůžka nemocného či v přímém kontaktu s ním)

U_c Rozšířená kombinovaná nejistota výsledku měření

VKK Vnitřní kontrola kvality

Stanovení glukózy [14, 34]

Krev se odebírá po hladovění (lačnění) přes noc, minimálně však po 8 hodinách. Jakákoliv fyzická námaha musí být vyloučena, stejně jako kouření. Pacient má být při odběru v klidové poloze (vsedě).

Vzorek žilní krve se odebírá do odběrové nádobky s obsahem inhibitoru glykolýzy. Obvyklou kombinací pro zisk plazmy s dostatečnou stabilitou glukózy je směs fluoridu sodného a EDTA. K účinné inhibici glykolýzy je nutná koncentrace minimálně 2,5 mg fluoridu sodného na 1 ml krve. K bezpečné zábraně glykolýzy by měly být vzorky po odběru uloženy do nádoby s ledovou tříští. Praktičtější alternativou, zajišťující stabilitu vzorku krve po odběru dostatečným potlačením in vitro glykolýzy, je odběr do antiglykolytického činidla obsahujícího kromě fluoridu a EDTA i citrát sodný (k dosažení pH 5,7). Potřebné odběrové nádobky vyrábějí přední výrobci Terumo, Greiner, Sarstedt a další a jejich typy a dostupnost (květen 2015) je uvedena v tabulce.

Odběr krve

V případě, že není použito odběru do antiglykolytika, mělo by být provedeno oddělení plazmy od krevních elementů optimálně do 30 minut. Transport do laboratoře je pak okamžitý.

Glukózový toleranční test (oGTT)

V plazmě kapilární krve je za běžných okolností stejná koncentrace glukózy jako v plazmě žilní krve. Po zátěži glukózou činí rozdíl mezi koncentrací glukózy v kapilární a žilní krví 25 % i více. Pro hodnocení oGTT není možné použít hodnot naměřených v plné žilní nebo kapilární krvi. Reprodukovatelnost klasifikace diabetu mellitu pomocí jednoho provedení oGTT se pohybuje v rozmezí pouze 50 až 70 %. Malabsorpce, nauzea a kouření ovlivňují výsledek oGTT.

Stanovení glukózy metodami POCT

Vyžaduje se důkladná instrukce a zácvik zdravotnického personálu na klinických odděleních a pacientů před zahájením sledování. Nedílnou součástí instrukcí jsou postupy kontroly kvality.

Významné potenciální zdroje preanalytických chyb jsou:

• změny hodnot hematokritu,
• změny teploty a vlhkosti vnějšího prostředí,
• vysoké koncentrace triacylglycerolů v krevním séru,
• hypoxie a hypotenze pacienta,
• použití vzorku krve s obsahem glykolytického inhibitoru,
• rozdíly ve vlastnostech šarží reagenčních čipů (slidů, proužků, cartridge aj.),
• mikrobiologická kontaminace reagenčních čipů (slidů, proužků, cartridge aj.). 

Glykovaný hemoglobin HbA_1c

K měření se používá vzorek nesrážlivé krve, obvykle odebraný do EDTA. Vlivy věku, pohlaví, etnicity, ročního období nejsou považovány za významné. Hemoglobinopatie ovlivňují výsledky měření, ale nesystematicky a v závislosti na metodě měření a přístroji. V případě neočekávaného výsledku je však třeba pomyslet i na ně. Záznamy chromatogramů (HPLC, LC) dávají dobrou možnost zpětné kontroly jejich výskytu.

Anémie a snížená koncentrace hemoglobinu mohou způsobovat snížené výsledky měření. Snížená hodnota doby života erytrocytů je příčinou falešně snížených hodnot HbA_1c v krvi. Faktory, negativně ovlivňující výsledky měření HbA_1c, jsou uvedeny a aktualizovány na webu NGSP [35].

Uremických pacientů dochází ke karbamylaci, která působí silné interference při měření HbA_1c v závislosti na použité metodě a přístroji.

Albumin

Dle mezinárodních doporučení [33] je jednoznačně preferováno použít náhodný, nejlépe první ranní vzorek moče, protože v něm poměr albumin/kreatinin koreluje nejlépe s 24 hodinovým vylučováním albuminu. Vyšetření v moči sbírané 24 hodin se nedoporučuje (problematika kvality sběru, fragmentace albuminu, atd.). Při vyšetřování ve vzorku nesbírané moče se doporučuje stanovit poměr albumin/kreatinin (ACR). Pokud se používá sběr za kratší časový úsek, jde o sběr za čtyři hodiny. U diabetiků nevykazuje albumin v moči diurnální variabilitu.

Ketolátky

Falešně pozitivní výsledky při stanovení v moči mohou být způsobeny:

• silným zbarvením vzorků,
• některými léky (například ACE-I),
• poškozením proužků nevhodným zacházením (expozice vzduchem, teplota apod.),
• lačněním nebo sníženým kalorickým příjmem (redukční diety),
• těhotenstvím (u asi 30 % případů).

Falešně negativní výsledky mohou být způsobeny:

• velmi nízkým pH moči,
• vysokým příjmem kyseliny askorbové,
• mikrobiálním rozkladem a následným únikem těkavého acetonu.

C-peptid

Koncentraci C-peptidu ovlivňuje fyzická zátěž, kouření a užívání biotinu.

Inzulin

Koncentraci inzulinu ovlivňuje fyzická zátěž, užívání biotinu a hemolýza vzorku. U pacientů léčených inzulinem může docházet při stanovení k nespecifické reakci.