Detekce Babesia spp. v klíšťatech, v krvi psů a jelenů v České republice

ÚVOD

Klíšťata jsou vektory řady patogenů a jejich monitorování je významné v rámci epidemiologického sledování. Ve střední Evropě představují největší zdravotní riziko klíšťata Ixodes ricinus, která vedle nejznámějších patogenů, virů klíšťové encefalitidy a bakterií borrelií, mohou přenášet i tzv. minoritní patogeny, jako Anaplasma phagocytophilum, Ricketssia spp. a Babesia spp. [1, 2]. Více než 100 druhů babesií infikuje řadu domácích a divokých zvířat jako skot, koně, ovce, psy, jeleny, srnce, malé savce aj., ale jen několik druhů infikuje člověka [3]. Jednotlivé druhy se liší ve své virulenci a mohou být příčinou onemocnění (babesióza) lidí a zvířat [4]. U psů je babesióza častá a potenciálně životu nebezpečná infekce [5]. U hovězího dobytka může způsobit fatální hemolytickou anémii stáda, zvláště při souběžné infekci jinými patogeny jako anaplasmou a mycoplasmou [6]. Od roku 1957 bylo v Evropě uveřejněno 56 autochtonních případů lidské babesiózy, které byly způsobeny třemi druhy babesií: Babesia divergens, Babesia venatorum, Babesia microti [7]. Většina pacientů byla asplenická, imunosupresivní nebo s jinými komorbitami. Přestože je hlavním přenašečem infekce klíště, byly zaznamenány i případy přenosu patogenu transfuzí kontaminované krve a krevních produktů [8]. V endemických oblastech USA (severovýchod a severní část Středozápadu) byl zjištěn i kongenitální přenos z matky na dítě [9].

MATERIÁL A METODY

Sběr klíšťat a odběr krve živočichů

V letech 2014 a 2015 bylo provedeno monitorování promořenosti klíšťat I. ricinus vybranými patogeny ve čtyřech pražských parcích (Klánovický les, Kunratický les, Satalická obora, Prokopské údolí). Byly zvoleny lokality, které slouží k relaxaci a výletům, kde tráví občané svůj volný čas. Sběr klíšťat byl proveden vlajkováním od března do června a v září (období sezonní aktivity klíšťat I. ricinus ve střední Evropě). Klíšťata byla individuálně rozdělena do zkumavek a uchována při -20 °C do začátku testování.

V roce 2015 byla odebrána krev 109 psů, kteří byli sledováni na Klinice chorob psů a koček, Veterinární univerzity Brno. Vzorky krve s EDTA byly po odběru zamraženy na -20 °C.

Ve spolupráci s Farmaceutickou fakultou Univerzity Karlovy Hradec Králové bylo během let 2014–2016 odebráno 50 vzorků krve jelenů volně žijících v Krkonošském národním parku a 80 vzorků krve jelenů chovaných na farmách a v oborách na různých místech Čech (Středočeský kraj, Královéhradecký kraj, Pardubický kraj, kraj Vysočina, Moravskoslezský kraj, Zlínský kraj). Odběry krve jelenů byly uskutečňovány při individuálních imobilizacích jelenů. Vzorky krve s EDTA byly uchovány při -20 °C.

Homogenizace klíšťat a DNA izolace ze vzorků klíšťat a krve

Každý vzorek klíštěte byl mechanicky rozrušen sterilním skalpelem nebo nůžkami v mikrozkumavce ve 180 µl pufru ATL. Na izolaci DNA ze vzorků byl použit kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Germany) a extrakce provedena dle návodu výrobce.

Detekce Babesia spp. metodou PCR

Reakce PCR byla prováděna podle protokolu Casati [10]. Pro amplifikaci 18S rRNA genu Babesia spp. byly použity primery BJ1 (5´-GTC TTG TAA TTG GAA TGA TGG-3´) a BN2 (5´-TAG TTT ATG GTT AGG ACT ACG-3´),

délka amplifikovaného úseku 411–452 pb. Celkový objem reakční směsi byl 25 µl, s 5 µl extrahované DNA jako templátu, 0,5 µM každého primeru, 0,625 jednotek Taq DNA polymeráze v Taq PCR Mixu (Qiagen, Germany). Reakce byla prováděna na přístroji DNA Engine Thermal Cycler (Bio Rad applied Biosystems, USA). Jednokroková PCR reakce sestávala z počáteční denaturace (3 min při 94 °C), 35 cyklů amplifikace (denaturace 1 min při 94 °C, annealing 1 min při 55 °C, elongace 2 min při 72 °C) a závěrečného kroku 5 min při 72 °C. Produkty byly po přidání barvy GelRed stain (Biotum Inc., USA) elektroforeticky separovány v 1,2% agarozovém gelu a vizualizovány použitím standardního UV transiluminátoru.

Pozitivní kontroly byly poskytnuty pracovníky Parazitologického ústavu Slovenské akademie věd.

Sekvenační analýza PCR produktů

PCR produkty (411–452 bp) byly přečištěny použitím kitu High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Diagnostics, US.). Vhodná koncentrace na sekvenaci 5–10 ng/100 pb (DNA koncentrace PCR produktů) byla zjištěna měřením na přístroji Nanodrop (1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific, USA). Sekvenace byla prováděna na sekvenačním analyzátoru 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) v sekvenační laboratoři Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy. K vyhledávání a porovnávání sekvencí v databázích byl použit FASTA format and BLAST program National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD, USA).

VÝSLEDKY

Výskyt Babesia spp. v klíšťatech z pražských parků, porovnání s ostatními patogeny

Největší pozitivita klíšťat na přítomnost babesií byla zjištěna v Klánovickém lese (3,3 %). Pozitivní klíšťata byla ve stadiu nymf, a vyskytoval se pouze druh B. venatorum. U jednoho klíštěte byla zjištěna koinfekce s borrelií (B. afzelii). V Kunratickém lese byla promořenost 2,1 %, 5 nymf, 2 samci, 1 samice. Na této lokalitě se vyskytovalo nejbohatší druhové zastoupení babesií (B. venatorum, B. capreoli, B. microti). U tří nymf a jednoho samce byla zjištěna koinfekce s borreliemi, dvakrát

B. microti – B. afzelii, dvakrát B. venatorum – B. garinii. Pestrá promořenost souvisí s hojným zastoupením rezervoárových živočichů od malých savců až po velké kopytníky. Vyskytuje se zde srnčí zvěř, mufloni, ptáci a v nivě potoka také hlodavci (hrabošík podzemní). V Prokopském údolí byla pozitivita 1,3 %, pozitivní byl 1 samec (B. capreoli). V Satalické oboře babesie v klíšťatech prokázány nebyly. Rozdíly v počtu infikovaných klíšťat na jednotlivých lokalitách jsou dány charakterem biotopu a přítomností rezervoárových živočichů. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

Výskyt babesií v klíšťatech byl porovnán s výskytem ostatních patogenů. Nejvíce zastoupeny byly Borrelia burgdorferi s. l. (30 %), výskyt ostatních patogenů byl podstatně menší a pohyboval se v jednotkách procent. Prevalence Anaplasma phagocytophilum 4,9 %, Babesia spp. 1,8 %, Rickettsia spp. 1,6 %. Vyskytovaly se i koinfekce, nejčastěji se jednalo o kombinace s borrelií způsobující lymeskou borreliózu. Borrelie s anaplasmou se vyskytovala u 1,5 % klíšťat, borrelie s rickettsií u 0,9 %, borrelie s babesií 0,7 % a anaplasma s rickettsií byla prokázána u 0,4 % klíšťat (nepublikované údaje).

Identita Babesia microti a Babesia venatorum

Z potenciálně patogenních druhů babesií pro člověka byly sekvenační analýzou PCR produktů zjištěny druhy B. venatorum a B. microti. Pořadí bazí amplifikovaných úseků 411–452 bp bylo porovnáno s úseky genů v izolátech pacientů s babesiózou a klíšťat (publikované údaje). Sekvence genů byly staženy z databáze genové banky a porovnána variabilita fragmentů 18S rRNA genu.

Babesia microti

Amplifikovaný fragment o velikosti 451 pb (Acc. No ON892061) z izolátu klíšťete z Kunratického lesa v lokalitě Glóbus ukázal 100% identitu s 18S rRNA genu prokázaným v izolátu krve pacientky s humánní babesiózou (Acc. No. EF 413181) a v izolátech z klíšťat v kantonu Curych (Acc. No. AY 648882, AY 648883) [11, 10].

Druh B. microti vyskytující se v Americe je více virulentní než druh B. microti vyskytující se v Evropě a je příčinou importovaných nákaz z USA do Evropy. Porovnáním s úseky genu B. microti izolovaném z klíštěte na severovýchodě USA byla identita 99,6 %, odchylka se vyskytovala v 1 páru bazí a v 1 inserci/absenci baze (Acc. No. AY144694).

Babesia venatorum

Tato babesie se vyskytovala v klíšťatech nejhojněji, v Klánovickém lese byla dominantní. Onemocnění způsobené tímto druhem se v klinických projevech velmi podobá příznakům vyvolaným B. divergens, ale není tak infekční, průběh onemocnění má mírnější průběh, úmrtí zaznamenáno nebylo. Vykazuje jen 98,2% homologii s B. divergens nalezenou u nemocných s babesiózou.

Porovnání úseků genů 414–418 bp z izolátů klíšťat Klánovického lesa vykazovalo 100% identitu s 18S rRNA genu, prokázaným v izolátu krve pacientky s humánní babesiózou (Acc. No. AY046575) [12]. Jednalo se o první případ humánní babesiózy v Německu v roce 2005. 100% identita byla také nalezena v izolátech z klíšťat z kantonů Ticino a Neuchatel ve Švýcarsku (Acc. No. AY648877, AY648878, AY648881) [10].

Tabulka 1. Pozitivita klíšťat Babesia spp. ve vybraných pražských parcích a jejich druhové zastoupení (2014–2015)
Table 1. Positivity of ticks by Babesia spp. in selected Prague parks and detection of genus (2014–2015)

Tabulka 2. Pozitivita krve psů Babesia spp. a jejich druhové zastoupení (2015)
Table 2. Positivity of Babesia spp. in dogs blood samples and detection of genus (2015)

Tabulka 3. Pozitivita krve jelenů Babesia spp. a jejich druhové zastoupení (2014–2016)
Table 3. Positivity of Babesia spp. in red deer blood samples and detection of genus (2014–2016)

Výskyt Babesia spp. v krvi psů

Z celkového počtu 109 vzorků krve psů bylo 3,7 % pozitivních na Babesia spp. Ve třech případech byla prokázána Babesia gibsoni a v jednom případě Babesia vulpes (pes pocházející ze Srbska). Hodnota pozitivity a druhové zastoupení jsou uvedeny v tabulce 2.

Oba dva druhy babesií (Babesia gibsoni, Babesia vulpes) zjištěné v krvi psů jsou patogenní pro psy, u člověka zaznamenány nebyly. Údaje prevalence (3,7 %) a druhová zastoupení jsou obdobná údajům v jiných zemích. Na Slovensku byla zjištěna promořenost 3,6 %, převážně zastoupena druhem Babesia canis canis [13], ve Velké Británii 2,4 % s druhovým zastoupením Babesia gibsoni [14]. B. gibsoni nebyla v Evropě dlouho známa, převážně se vyskytuje v oblastech Asie, Severní Ameriky, Austrálie, avšak několik případů infekce způsobené tímto druhem se potvrdilo v Evropě včetně České republiky [5, 15, 16, 17]. Výskyt B. gibsoni mimo endemické oblasti je přisuzován globálnímu oteplování a následnou změnou v rozšíření jednotlivých druhů klíšťat [18]. Vliv má i narůstající migrace psů (cestování, soutěže). Určení správného druhu babesie při onemocnění babesiózou má zásadní význam pro léčbu, neboť dosud používaná tradiční anti-babesiální terapie proti B. canis je neefektivní při onemocnění způsobené B. gibsoni [19].

Výskyt Babesia spp. v krvi jelenů

Z celkového počtu 130 vzorků bylo 50 vzorků krve jelenů žijících ve volné přírodě Krkonošského národního parku a 80 vzorků krve jelenů chovaných na farmách nebo v oborách (Středočeský kraj, Královéhradecký kraj, Pardubický kraj, kraj Vysočina, Moravskoslezský kraj, Zlínský kraj).

U jelenů z přírodního ekosystému dosahovala promořenost babesiemi 4,0 % a ze zjištěných druhů byla zjištěna B. divergens, u jelenů chovaných v oboře či na farmě byla pozitivita 5,0 % s druhovým zastoupením B. odocoilei. Hodnoty pozitivity krve jelenů a druhová zastoupení babesií uvádí tabulka 3.

V krvi jelenů volně žijících v Krkonošském národním parku dosahovala promořenost 4 % a byla zjištěna přítomnost Babesia divergens. Obdobné hodnoty prevalence a druhové zastoupení bylo zjištěno i v jiných evropských zemích [1, 20]. Studie provedená v západní části Rakouska prokázala ve 196 vzorcích krve jelenů pozitivitu 5,1 % na B. divergens [1]. Z oblasti severní a východní části Tyrolska bylo více než 2,1 % lidí, kteří darovali krev, séropozitivních (IgG) na B. divergens [21].

Patogenita druhu B. odocoilei zjištěná v krvi jelenů chovaných na farmách nebyla prokázána.

Identita B. divergens

B. divergens je nejběžnější a nejvíce patogenní druh pro člověka. Amplifikovaný fragment o velikosti 413 bp z izolátu krve jelena ukázal 100% identitu s18S rRNA referenčního genu (Acc. No. U16370).

100% identita byla zjištěna u dvou vzorků pacientů s humánní babesiózou ve Španělsku. První byl izolován z krve starší pacientky s intaktní slezinou, která onemocnění podlehla, ve druhém případě se jednalo o případ závažného průběhu onemocnění u imunokompromitovaného muže (Acc. No. MG944238, KF533077) [22, 23].

Shodnost byla také zjištěna v izolátu krve 74leté pacientky s intaktní slezinou v severozápadní části Ruska. Po závažném průběhu s multisystémovým selháním pacientka onemocnění podlehla (Acc. No. MK510929) [24].

100% shoda byla také nalezena v izolátech z klíšťat sajících na skotu v kantonu Ticino ve Švýcarsku (Acc. No. AY 648876, AY 648875) [10].

DISKUSE

Hodnoty prevalence a výskyt jednotlivých druhů babesií byly obdobné jako výsledky jiných prací z České republiky (ČR) a ostatních evropských zemích. První testování klíšťat na přítomnost babesií v ČR provedli pracovníci Ústavu biologie obratlovců Akademie věd ČR na jižní Moravě. Rudolf et al. publikoval v roce 2005 článek o výskytu B. microti s prevalencí 1,5 % a v roce 2015 Venclíková et al. uveřejnila článek o přítomnosti B. venatorum a B. capreoli. V klíšťatech městských parků byl index pozitivity 0,4 % a v přírodním lesním ekosystému 1,5 % [25, 26]. V Polsku promořenost klíšťat dosahovala 1,6 % (B. venatorum, B. canis canis), ve Švýcarsku 0,7–1,7 % (B. venatorum, B. microti, B. divergens) [10, 27]. V Německu proběhla studie testování klíšťat v rekreačních oblastech s hodnotami promořenosti 4,1–6,1 % (B. venatorum, B. capreoli, B. microti, B. divergens) [2].

Za účelem vyhodnocení rizika nemocí přenášených klíšťaty byly v řadě zemí provedeny studie promořenosti klíšťat více patogeny včetně minoritních. Prevalence převážně duálně infikovaných klíšťat je největší v endemických oblastech severní části USA a Evropy, kde se většina koinfekcí vyskytuje u pacientů s diagnostikovanou lymeskou borreliózou [28].

V letech 2007–2008 proběhla v Nizozemí studie detekce patogenů (metodami PCR) v klíšťatech sajících na lidech a v krvi dobrovolníků po přisátí klíštěte a s erythema migrans. V klíšťatech byla zjištěna prevalence borreliemi ze skupiny Borrelia burgdorferi s. l. (způsobující lymeskou borreliózu) 29,0 %, Neoehrlichia mikurensis 5,4 %, Anaplasma/Ehrlichia spp. 2,5 %, Babesia spp. 3,5 % a Borrelia miyamotoi (způsobující návratnou horečku) 2,3 %. V případě koinfekcí se ve většině případů jednalo o kombinaci borrelií s jiným patogenem – borrelie s anaplasmou/ehrlichií 3,2 %, borrelie s babesií 1,0 %, borrelie ze skupiny sensu lato s B. miyamotoi zůsobující návratnou horečku 0,3 %. Přítomnost patogenů v krvi byla zjištěna u 2,4 % dobrovolníků z celkového počtu 626 vzorků [29].

Studie patogenů v klíšťatech sajících na lidech provedená v Belgii v roce 2017 ukázala na podobné hodnoty infekčnosti klíšťat sledovanými patogeny. Koinfekce byla nalezena u 3,9 % zkoumaných klíšťat, nejběžněji se vyskytující kombinace B. burgdorferi s. l. a Neoehrlichia mikurensis [30].

Prevalencí patogenů v klíšťatech se zabývá řadu let Národní referenční laboratoř pro lymeskou borreliózu SZÚ v Praze. Studie z roku 2007, která zjišťovala infekčnost klíšťat na různých místech ČR uvádí promořenost borreliemi ze skupiny Borrelia burgdorferi s. l. 17,3 % a Anaplasma phagocytophilum 4,4 %. Nejvyšší výskyt anaplasmové infekce v klíšťatech byl v městských parcích v jarních měsících (9,6 %), v podzimních (2,2 %) [31]. Monitorování lokalit v pražských parcích prováděné v posledních letech odhalilo promořenost klíšťat Borrelia burgdorferi s. l. 28,0 %, Anaplasma phagocytophilum 4,3 %. Nejvyšší hodnota infekčnosti klíšťat borreliemi byla zjištěna v roce 2015, kdy v Prokopském údolí bylo infikováno 60,5 % klíšťat [32].

Koinfikující patogeny mohou změnit účinnost přenosu, způsobit kooperativní nebo kompetitivní interakce patogenů a změnit závažnost onemocnění mezi hostiteli. Modelové pokusy na myších ukazují, že vysoká parazitemie B. microti způsobuje nízkou hladinu hemoglobinu u infikovaných myší, která je rovněž pozorována u pacientů s babesiózou. Podobně jako u lidí zvyšuje koinfekce B. microti u myší závažnost symptomů podobných lymeské borrelióze. Koinfikované myši

B. burgdorferi s. l. vykazují nižší parazitemii B. microti ve srovnání s myšmi infikovanými samotnou B. microti. To může odrážet zmírnění symptomů babesiózy u některých lidských koinfekcí. Tato zjištění naznačují, že koinfekce Borrelia burgdorferi s B. microti zmírňuje růst parazitů babesie, zatímco její přítomnost zhoršuje u myší symptomy podobné lymeské borrelióze [33, 34].

Boyer et al. z Institutu bakteriologie Federace translační medicíny Univerzity ve Štrasburku shrnul ve svém článku dosavadní znalosti o koinfekcích mezi B. burgdorferi s. l. a jinými patogeny přenášených klíšťaty. Z dosud publikovaných údajů vyplývá, že u většiny koinfikovaných pacientů proběhlo onemocnění s klinickými příznaky způsobené jedním patogenem (vlastní jednomu patogenu), proti druhému patogenu byla prokázána séropozitivita. Současný průběh infekcí (klinický průběh dvou aktivních nemocí) způsobený dvěma patogeny byl vzácný. K nejběžněji hlášeným případům koinfekcí patří klíšťová encefalitida a neuroborrelióza. Rovněž výskyt vysoké horečky u pacientů s erythema migrans může naznačovat souběžnou infekci dalším patogenem přeneseným klíštětem, nejčastěji Anaplasma phagocytophilum. Z dosud známých údajů vyplývá, že koinfekce se nejčastěji projevuje ve dvou případech: – pacienti s klinickými příznaky lymeské borreliózy a s erythema migrans doprovázené vysokou horečkou byli koinfikováni A. phagocytophilum, virem klíšťové encefalitidy, Babesia spp., Rickettsia spp., B. miyamotoi a – pacienti s neurologickými symptomy virem klíšťové encefalitidy nebo Powassan virem [35].

ZÁVĚR

Molekulárními metodami byly na území ČR v klíšťatech a krvi vybraných živočichů detekovány tři patogenní druhy babesií pro člověka. V klíšťatech pražských parků byly zjištěny druhy B. microti a B. venatorum, v krvi jelenů žijících ve volné přírodě Krkonošského národního parku B. divergens. V krvi jelenů chovaných na farmách nebo oborách a v krvi psů patogenní druhy pro člověka zjištěny nebyly. Sekvenace PCR amplifikovaných úseků 411–452 bp ukázala 100% podobnost s 18S rRNA geny babesií, které byly zjištěny v izolátech pacientů s babesiózou a v izolátech klíšťat z evropského regionu (publikované údaje). Ačkoli se humánní babesióza vyskytuje v Evropě sporadicky, riziková je pro asplenické a imunokompromitované pacienty. V ČR byl dosud zaznamenán případ importované nákazy z USA [36] a přenos nákazy krevní transfuzí připomínající Reiterův syndrom [37].