Ako zlepšiť predoperačnú diagnostiku pankreatobiliárnych nádorových lézií? Od imunohistochémie k “Next Generation Sequencing”

Malígne nádory pankreasu (najčastejší je pankreatický duktálny karcinóm PDCA) a karcinómy extrahepatálnych žlčových ciest patria medzi extrémne agresívne ochorenia. Podľa údajov českého národného onkologického registra dosahovala v období 2014-2018 hodnota 5-ročného prežívania pacientov so zhubnými nádormi pankreasu iba 11,1 % (v porovnaní s predošlým obdobím 2004-2008 ide o zlepšenie o necelých 6 %). U malignít žlčníka a extrahepatálnych žlčových ciest bolo za rovnaké obdobie 5-ročné preživanie iba 20,6 % (zlepšenie o necelé 4 %). Napriek tomu, že malígne nádory pankreasu boli v roku 2018 až siedmou najčastejšou malignitou, predstavovali tretiu najčastejšiu príčinu úmrtia na malígne ochorenie. Karcinómy extrahepatálnych žlčových ciest boli 18. najčastejšou malignitou a 13. najčastejšou príčinou úmrtia. Incidencia malígnych nádorov pankreasu v Českej republike dlhodobo stúpa a za posledných 40 rokov došlo približne k zdvojnásobeniu incidencie na súčasných 22 prípadov na 100 000 osôb (1). Incidencia malignít extrahepatálnych žlčovodov naopak dlhodobo veľmi mierne klesá. V európskom meradle je v incidencii nádorov pankreasu Česká republika na treťom mieste a v celosvetovom rebríčku na mieste štvrtom (za Maďarskom, Uruguayom a Slovenskom) (2).

Najefektívnejším spôsobom liečby týchto ochorení je včasná chirurgická resekcia. Bohužiaľ, viac ako polovica pacientov je diagnostikovaná až v pokročilých štádiách (štádiá III a IV) (1). Terapeutický plán u pacientov s predpokladaným karcinómom pankreasu alebo žlčových ciest sa opiera predovšetkým o radiologický nález a výsledok predoperačnej cytológie alebo biopsie. Cytologické alebo bioptické potvrdenie malignity nie je absolútne nevyhnutné u klinicky/radiologicky resekovateľného alebo hranične resekovateľného ochorenia; cieľom je potenciálne kuratívny zákrok aj za cenu relatívne vysokej operačnej a pooperačnej morbidity a mortality (3,4). Morfologická diagnóza je ale nevyhnutná v prípadoch hranične resekovateľného ochorenia alebo pokročilého ochorenia pred zahájením agresívnej neoadjuvantnej, alebo paliatívnej terapie. V prípade negatívneho cytologického/bioptického výsledku by mala byť biopsia minimálne jedenkrát zopakovaná (3). Rýchla a presná (cyto)patologická diagnóza preto zohráva nezastupiteľnú úlohu v manažmente týchto ochorení.

Techniky odberu, senzitivita, špecificita a diagnostická výťažnosť pankreatobiliárnej cytológie

Diagnostický materiál z lézií žlčových ciest je možné získať klieštikovou biopsiou, alebo kefkovou cytológiou pri ERCP (endoskopická retrográdna cholangiopankreatografia) alebo pri cholangioskopii (pozri aj Žiak et al. v ďalšom článku v tomto čísle), ako aj tenkoihlovou cytológiou/biopsiou pod endosonografickou kontrolou (EUS-FNA/FNAB); v prípade lézií pankreasu najčastejšie pomocou EUS-FNA/FNAB.

V mnohých štúdiách bolo dokázané, že EUS-FNA/FNAB má pre patologickú diagnostiku solídnych nádorov pankreasu (väčšina štúdií sa venuje PDCA) vysokú senzitivitu a špecificitu. V troch metaanalýzach bola „pooled“ senzitivita EUS-FNA pre solídne lézie pankreasu 85-88,6 % a „pooled“ špecificita dosahovala 95,8-99,3 %, aj keď senzitivita a špecificita v jednotlivých štúdiách značne kolísala (50-100 %, respektíve 71-100 %) (5-7).

EUS-FNA/FNAB diagnostiku môže významne vylepšiť prítomnosť cytopatológa pri odbere materiálu („Rapid On-site Evaluation“ ROSE) (6). Podľa niektorých autorov môže ROSE zvýšiť počet diagnostických odberov o ~ 10-15% a zároveň môže optimalizovať počet potrebných diagnostických vpichov a tým aj riziko komplikácií (8,9). Pre mnohé inštitúcie je však rutínna prítomnosť patológa pri odbere logisticky problematická a výsledky metaanalýz, ktoré hodnotili prínos ROSE v diagnostike solídnych lézií pankreasu nie sú až tak jednoznačné; ROSE preto môže mať praktický význam najmä vo fáze učenia sa a v centrách, kde je počet adekvátnych odberov nižší ako 90 % (10). Aby hodnotenie odobratého materiálu cytopatológom priamo na mieste prinieslo požadovaný efekt a neviedlo naopak k predčasnému ukončeniu diagnostickej procedúry pri nejasnom, alebo nesprávne vyhodnotenom náleze, je nevyhnutnou podmienkou erudícia prítomného (cyto)patológa a dokonalý prehľad v problematike pankreatobiliárnych lézií (11).

Podľa niektorých autorov väčší kaliber ihly použitej pri EUSFNA (22-gauge versus 25-gauge) nebol asociovaný s lepšou diagnostickou výťažnosťou procedúry a presnosť vyšetrenia výrazne nezlepšovalo ani použitie bioptických ihiel (FNAB) (10). Iní však dospeli k presne opačným záverom – FNAB mala výrazne vyššiu diagnostickú výťažnosť (12). Najmä použitie bioptických ihiel novej generácie (fork-tip, Franseen needle), má v porovnaní s FNA lepšiu diagnostickú výťažnosť aj pri nižšom počte pasáží, s porovnateľným výskytom komplikácií (13,14). Navyše, FNAB na rozdiel od čisto cytologického materiálu, umožňuje jednoduchšie použitie pomocných imunohistochemických vyšetrení, napr. v diferenciálnej diagnostike iných solídnych nádorov pankreasu (neuroendokrinný tumor/NET, solídno-papilárna neoplázia/SPN, acinárny karcinóm; viď nižšie) ako aj diagnostiku niektorých nenádorových lézií (napr. autoimunitnej pankreatitídy) a takto môže diagnostiku výrazne spresniť.

Samostatnú problematiku v diagnostike lézií pankreasu predstavujú cystické lézie. Najčastejšie ide o lézie súhrnne nazývané mucinózne neoplázie, ktoré majú malígny potenciál (main-duct intraductal papillary mucinous neoplasm/MD-IPMN, brach-duct IPMN/BD-IPMN a mucinous cytic neoplasm/MCN), non-mucinózne malígne nádorové lézie (NET, SPN, cysticky zmenený PDCA, veľmi vzácne cystický acinárny karcinóm), benígne nádory (serózny cystadenóm) a nenádorové cysty (zápalové cysty, pseudocysty, lymfoepitelové cysty, retenčné cysty). Incidencia náhodne zachytených cystických lézií pankreasu neustále stúpa a v niektorých štúdiách je popisovaný záchyt u pacientov, ktorí absolvujú zobrazovacie vyšetrenie brucha až v 49-71 %. Celkové riziko malignity cystických lézií pankreasu je však nízke a morbidita chirurgických výkonov na pankrease je neúmerne vysoká. Správna selekcia pacientov na sledovanie, alebo prípadnú chirurgickú intervenciu má preto mimoriadny význam.

Aj keď existuje hneď niekoľko klinických „guidelines“, optimálny manažment týchto lézií a prínos cytologickej diagnostiky sú stále predmetom diskusií (15). Zatiaľ čo niektoré „guidelines“ vo vybraných situáciách EUS-FNA doporučujú a výsledok cytologického vyšetrenia priamo využívajú pri rozhodovaní o ďalšom manažmente (16-18), iné sú v indikácii EUS-FNA liberálnejšie a doporučujú FNA iba v prípadoch keď je CT/MRI nález nejasný a odlíšenie mucinóznej od nemucinóznej cysty môže mať priamy dopad na ďalší manažment (19). Ďalšie guidelines EUS-FNA pri definitívnom rozhodovaní o malígnom potenciáli zachytenej mucinóznej lézie pre nízku senzitivitu vyšetrenia nedoporučujú (20). Pre všetky doporučenia je však spoločné, že cytologický nález s high-grade dyspláziou je absolútnou indikáciou pre chirurgickú intervenciu (15). Zaujímavosťou je, že iba„Fukukoa guidelines“ sa venujú histologickým podtypom IPMN a ich klinickému významu (gastrický, pankreatobiliárny, intestinálny a onkocytický; pozn.: podľa poslednej WHO klasifikácie je onkocytický typ IPMN klasifikovaný samostatne pod názvom intraductal oncocytic papillary neoplasm/IOPN) (18).

Hlavnou úlohou cytológie cystických lézií pankreasu je odlíšenie mucinóznych cýst od nemucinóznych lézií a identifikácia prípadnej high-grade dysplázie/malignity. Cytológia má pri identifikácii mucinóznej neoplázie vysokú špecificitu (83-100 %), problémom je ale pomerne nízka senzitivita (27-58,3 %) (21-26). Príčinou nízkej senzitivity môže byť nízka celularita vzorky, ako aj možná kontaminácia epitelom gastrointestinálneho traktu najmä v prípade low-grade lézií, ktoré nemajú výrazné cytologické atypie môže byť odlíšenie nádorovej mucinóznej lézie od kontaminácie mimoriadne obtiažne, až nemožné. Senzitivita cytológie pre diagnózu malígnej mucinóznej neoplázie (high-grade dysplázia, prípadne karcinóm) kolíše v jednotlivých publikáciách v širokom rozmedzí (22-72 %), špecificita je opäť vysoká (85-94,9 %) (22,24,26,27), aj keď porovnanie jednotlivých štúdií je pomerne ťažké, pretože objektívne cytologické kritériá pre diagnózu high-grade atypických buniek boli stanovené a štandardizované relatívne nedávno (28,29).

Preoperatívna cytologická diagnostika serózneho cystadenómu je ešte väčším orieškom ako mucinózne lézie, a to najmä pre zriedkavý cytologický záchyt diagnostických buniek, ktoré sa navyše môžu podobať na nenádorový epitel gastrointestinálneho traktu. Problematická môže byť taktiež častá prítomnosť kontaminujúceho epitelu s možnou diagnostickou zámenou za mucinóznu cystu, najmä v prípadoch oligocystického serózneho cystadenómu (30,31). Prítomnosť cytopatológa pri odbere materiálu z cystických lézií pankreasu diagnostickú výťažnosť nezlepšuje (32).

Senzitivitu pre identifikáciu nádorovej mucinóznej cystickej lézie výrazne zvyšuje kombinácia cytológie s analýzou hladiny karcinoembryonálneho antigénu (CEA) v obsahu cysty. Hladina CEA ≥ 192 ng/ml môže odlíšiť mucinóznu od nemucinóznej cysty so senzitivitou 52-78 % a špecificitou 63-91 % (17). Aj keď je CEA v aspirovanej tekutine (ideálne v spojení s cytologickým nálezom, vrátane identifikácie mucínu v špeciálnom farbení) dobrým spôsobom ako potvrdiť diagnózu mucinóznej lézie (22,23,25,26), hodnoty CEA neodlíšia benígne mucinózne cysty od malígnych (25). Zdá sa, že ešte lepším markerom mucinóznych cýst by mohlo byť stanovenie hladiny glukózy v obsahu cysty. Podľa troch metaanalýz mala hladina glukózy < 50mg/dL pooled senzitivitu 90,1-91 % a špecificitu 85-86 % pre diagnózu mucinóznej cysty (32-35).

Na rozdiel od iných indikácií (napr. gynekologická cytológia, močová cytológia, cytológia štítnej žľazy, alebo cytológia výpotkov) nie je prínos „liquid-based“ cytológie (LBC) v diagnostike lézií pankreasu zatiaľ úplne jasný; zdá sa však, že LBC môže byť plnohodnotnou a prínosnou diagnostickou modalitou (36).

Mitoro a spol. napr. zistili, že LBC má v diagnostike solídnych lézií pankreasu diagnostickú senzitivitu pre malignitu 93,9%, špecificitu 95,1% a diagnostickú presnosť 94,1% (37). Hashimoto a spol. porovnali klasické nátery a LBC u pacientov so solídnymi léziami pankreasu; LBC mala vyššiu senzitivitu aj celkovú diagnostickú presnosť (96,6 % vs 84 % a 96,8 % vs 87,3 %) (38). Podobne, v čínsko-americkej štúdii autori potvrdili vyššiu senzitivitu a diagnostickú presnosť LBC (senzitivita 71,4 % vs 55,1 % a špecificita 76,1 % vs 61,6 %) (39). Na druhú stranu, v niektorých štúdiách bola senzitivita klasických náterov signifikantne vyššia ako LBC (40-42). Metaanalýza porovnávajúca LBC a konvenčné nátery v EUS-FNA diagnostike solídnych lézií pankreasu ukázala, že diagnostická senzitivita je signifikantne vyššia pre LBC ako pre náterovú cytológiu (43). Kombinácia LBC a náterovej cytológie diagnosticky signifikantne prevyšuje samotnú LBC, alebo samotnú náterovú cytológiu (43,44).

LBC cytológiu je možné využiť aj na diagnostiku z aspirátu pankreatickej šťavy. V malej štúdii sériovo získaných aspirátov pankreatickej šťavy mala LBC senzitivitu pre malignitu (PDCA) 81,8 % a špecificitu 100 % (45). Miyamoto a spol. porovnali diagnostickú výťažnosť LBC a konvenčných náterov z pankreatickej šťavy u pacientov s IPMN. Celkovo malo vyšetrenie senzitivitu pre malígny IPMN 28 % a špecificitu 98 %, pričom senzitivita a špecificita konvenčných náterov bola 21 % a 96 % a LBC mala senzitivitu 40 % a špecificitu 100 %. Celková diagnostická presnosť LBC bola 76 % a presnosť náterovej cytológie iba 56 % (46).

Najnovšou endoskopickou technikou, ktorou je možné odobrať bioptické vzorky z cystických lézií pankreasu je použitie mikroklieští (Moray^® Micro Forceps; through the needle tissue biopsy TTNB) (47,48). V porovnaní s EUS-FNA má TTNB signifikantne vyššiu diagnostickú výťažnosť pre diagnózu mucinóznych cýst ako aj pre diagnózu presného typu cystickej lézie, s výrazne vyššou konkordanciou s definitívnou histológiou v resekáte (82,3 % versus 26,8 %). V metaanalýze bola senzitivita a špecificita TTNB pre diagnózu mucinóznej lézie 90,1 % a 94 % a diagnostická výťažnosť pre konkrétny histologický typ lézie bola až 72,5 % (49).

Diagnostika lézií extrahepatálnych žlčovodov

Cytologická/bioptická diagnostika lézií (najčastejšie stenóz) extrahepatálnych žlčových ciest je samostatnou kapitolou v pankreatobiliárnej predoperačnej diagnostike. Najčastejšie a najdlhšie používanou diagnostickou technikou je kefková (brush) cytológia, ktorá umožňuje rozsahom pomerne dobré vyšetrenie žlčových ciest a má relatívne nízky výskyt komplikácií. Hodnotenie „brush“ cytológií lézií žlčovodov však patrí k najnáročnejším cytologickým vyšetreniam vôbec. Dôvodom je, že sa často jedná o málo kvalitný, alebo cytologicky veľmi chudobný materiál (50), nezriedka sú zachytené reaktívne atypie asociované s ulceráciou alebo stentom a prítomnými zápalovými zmenami a problematická je aj pomerne vysoká frekvencia cytologicky blandných karcinómov v tejto oblasti (51,52). Výsledkom je, že cytologická diagnóza malignity má nízku senzitivitu (udávaná v širokom rozmedzí 5,9-79 %, najčastejšie ~ 30-40 %) a nízku negatívnu prediktívnu hodnotu (30-65 %), aj keď má veľmi vysokú špecificitu (~ 40-100 %, vo väčšine štúdií je udávaná vysoko nad 90 %) (50,53-59). Senzitivitu „brush“ cytológie môže ovplyvniť zvýšenie počtu pasáží odberovej kefky (aj keď neexistuje všeobecné doporučenie, vyšší počet pasáží diagnostiku zlepšuje) a typom použitej kefky (60).

Diagnostiku malígnych lézií žlčovodov môže signifikantne vylepšiť použitie transpapilárnej klieštikovej biopsie (senzitivita ~ 60-65 %) (61,62), alebo intraduktálnej klieštikovej biopsie počas cholangioskopie/ERCP („pooled“ senzitivita ERCP biopsie v metaanalýze bola 67 %) (63), ako aj použitie EUS-FNA (senzitivita 73-80 %, špecificita 97-100 %), pričom kombinácia ERCP samplingu s EUS-FNA dáva najlepšie výsledky (63-66). Podľa dvoch metaanalýz dosahovala kombinácia odberu tkaniva pri ERCP s EUS-FNA senzitivitu 83-86 % a špecificitu 98-100 % (65,67).

Podobne ako u lézií pankreasu, aj v diagnostike nádorov žlčovodov sa postupne udomácnila technika LBC (51,63,68,69). V porovnaní s klasickými nátermi je pre LBC udávaná vyššia senzitivita (53,1-78,2 %) pri zachovanej vysokej špecificite (99,4100 %) (42,69,70).

Diagnostickú presnosť biliárnej cytológie môže zvýšiť používanie nových endoskopických inštrumentov (napr. „scrape“ biopsia, nové bioptické biliárne kanyly a pod.) (71-73).

V neposlednom rade, kľúčovú zložkou diagnostiky lézií biliárneho traktu predstavuje kompetentný (cyto)patológ, pretože interpretačná zložka môže byť výraznou príčinou falošnej negativity vyšetrenia. Dobrou správou je, že aj patológovia bez formálnej špecializácie v cytopatológii (bežná najmä v USA), môžu byť natrénovaní tak, aby správne rozoznali kľúčové cytologické charakteristiky a správne diagnostikovali malígne prípady s podobnou senzitivitou a špecificitou ako cytopatologickí špecialisti (51).

Diferenciácia nádoru hrá kľúčovú úlohu v cytologickej identifikácii malignity. Nízko diferencované nádory nepredstavujú zásadný diagnostický problém, ale dobre diferencované, cytologicky blandné nádory, sú diagnostickou výzvou. Tieto prípady, ako aj mnohé ďalšie, ktoré sú z rôznych dôvodov zaradené do kategórie „atypické bunky“, predstavujú nezanedbateľný počet prípadov; u lézií pankreasu to je 0-16 %, priemerne 6 %; u lézií žlčovodov predstavujú ~ 10-14 % (52,56,70,73). Manažment týchto prípadov by mal pozostávať z komplexu opatrení, ktoré môžu zahŕňať ROSE (najmä v prípade vysokého počtu nediagnostických odberov, viď vyššie), koreláciu s klinickým, radiologickým, eventuálne biochemickým nálezom (najmä u cystických lézií pankreasu – viď vyššie), konsenzuálne klinicko-patologické review prípadu, alebo konzultáciu so špecializovaným pankreatobiliárnym (cyto)patológom. Nezanedbateľnú úlohu pri vyriešení cytologicky nejednoznačných prípadov a v diferenciálnej diagnostike konkrétnych nádorových lézií majú doplňujúce vyšetrenia (74).

Imunohistochémia

Na imunohistochemické vyšetrenie je možné použiť materiál získaný klieštikovou biopsiou alebo pri EUS-FNA/FNAB (ak sa jedná o dostatočne veľké kúsky tkaniva), ako aj cytologický materiál spracovaný do cytobloku. Cytobloky majú v diagnostike pankreatobiliárnych lézií v porovnaní so samotnou cytológiou signifikantne vyššiu senzitivitu pre malignitu ako aj celkovú diagnostickú presnosť (75-77) a to najmä pre možnosť využitia IHC vyšetrenia, prípadne genetického vyšetrenia (78). Dôležité je ale pamätať na skutočnosť, že sa jedná o materiál spracovaný mierne odlišným spôsobom ako bežná biopsia a vykonať formálnu validáciu jednotlivých IHC vyšetrení pre použitie na cytoblokoch a to najmä v prípadoch, ak je na fixáciu materiálu využité iné fixatívum ako formol (najčastejšie je to alkohol) (78).

Imunohistochemické (IHC) vyšetrenie môže byť užitočné v dvoch hlavných diagnostických situáciách: (i) v diferenciálnej diagnostike nádorových (a niektorých nenádorových) lézií pankreasu a (ii) pri potvrdení diagnózy malignity najčastejšie pri odlíšení veľmi dobre diferencovaného duktálneho karcinómu od reaktívnych atypií.

Tabuľka č. 1. Vybrané IHC markery v diferenciálnej diagnostike epitelových nádorov pankreasu.

PDAC – duktálny karcinóm pankreasu, ACC –karcinóm z acinárnych buniek, SPN – solídno pseudopapilárna neoplázia, NET – neuroendokrinný tumor, PB – pankreatoblastóm, SCA – serózny cystadenóm, M – membránová pozitivita, J – jadrová pozitivita, N/A – informácia nedostupná, *expresia v jadrách, #„dot-like“ cytoplazmatická expresia

Prehľad protilátok užitočných v diferenciálnej diagnostike vybraných epitelových nádorov pankreasu je uvedený v tabuľke č. 1 (upravené a doplnené podľa Lin et al. (79)). Pri interpretá-ii výsledku IHC vyšetrenia je nutné poznať limity konkrétneho vyšetrenia, pretože takmer žiadna protilátka nie je 100% senzitívna ani špecifická. V skupine solídnych nádorov pankreasu je dôležité najmä správne odlíšenie nádorov s podobnou cytomorfológiou, predovšetkým pankreatického neuroendokrinného tumoru, solídno pseudopapilárnej neoplázie, karcinómu z acinárnych buniek a pankreatoblastómu.

Karcinóm z acinárnych buniek (ACC)

Typický profil ACC pozostáva z negatívnej, alebo iba fokálnej expresie CK7 (na rozdiel od difúznej pozitivity v duktálnom adenokarcinóme), expresie trypsínu (často s vysokým pozadím, ktoré komplikuje hodnotenie) a expresie BCL10 (BCL10 je exprimovaný aj v časti adenoskvamóznych karcinómov). Ďalším veľmi senzitívnym markerom ACC je karboxy ester lipáza, zatiaľ čo dôkaz pankreatickej lipázy a amylázy je málo citlivý a v malých biopsiách skôr nepoužiteľný. V časti prípadov býva prítomná aberantná cytoplazmatická a jadrová expresia β-cateninu, čo môže spôsobiť problémy pri odlišovaní od pankreatoblastómu. Expresia neuroendokrinných markerov je v ACC negatívna (okrem ojedinelých buniek exprimujúcich chromogranín), signifikantná expresia (> 30 % buniek) je však prítomná v zmiešaných nádoroch (79-81). Najnovšie popísanými a veľmi sľubnými markermi pre nádory s acinárnou diferenciáciou (s prednežne udávanou 100% senzitivitou a špecificitou) sú karboxypeptitáza A2 a karboxypeptitáza A1 (82).

Solídno pseudopapilárna neoplázia (SPN)

SPN je veľmi vzácny nádor neistej histogenézy, ktorý sa vyskytuje prevažne u adolescentných dievčat a mladých žien. Najlepšími IHC markermi SPN sú β-catenin (jadrová a cytoplazmatická expresia), e-cadherin (strata expresie), CD10 a CD99 s unikátnou „dot-like“ cytoplazmatickou pozitivitou; charakteristická je aj expresia progesteronových receptorov, vimentinu, cyclinu D1, androgénových receptorov, LEF1, TFE3, alebo SOX11. Expresia chromogranínu je konzistentne negatívna, signifikantná časť SPN však exprimuje synaptofyzín čo pri neopatrnej interpretácii môže viesť k zámene s neuroendokrinným tumorom (80-87). Variabilná expresia celého spektra ďalších markerov je v malých biopsiách prakticky nepoužiteľná.

Neuroendokrinné tumory

Diagnóza pankreatického neuroendokrinného tumoru (NET) môže byť potvrdená pozitívnou expresiou INSM1, synaptofyzínu a chromogranínu (91-93). INSM1 má v pankreatických NET-och špecificitu porovnateľnú s chromogranínom a vyššiu ako synaptofyzín, a senzitivizu porovnateľnú so synaptofyzínom a vyššiu ako chromogranín (94). Neoddeliteľnou zložkou diagnózy NET-ov je posúdenie proliferačnej aktivity pomocou vyšetrenia expresie Ki67. V prípade NET-ov grade 3 je doporučované vyšetrenie expresie p53 a Rb1 (prípadne aj SSTR2 – somatostatinových receptorov typu 2, ATRX a DAXX) na odlíšenie od neuroendokrinného karcinómu (NEC): high grade NET (grade 3) má typicky normálnu expresiu p53/Rb1, často pozitívnu expresiu SSTR2 a často stratu expresie ATRX/DAXX; IHC profil NEC je presne opačný (95,96). Ak aj po týchto vyšetrenia pretrvávajú diagnostické rozpaky, je vhodné doplniť vyšetrenie expresie hormónov – väčšina NET-ov produkuje hormóny, zatiaľ čo NEC sú väčšinou nádory bez dokázateľnej expresie hormónov (95).

Pankreatický NET môže pomerne verne v malej biopsii napodobovať agregát Langerhansovych ostrovčekov v teréne chronickej pankreatitídy. Kombinovaný dôkaz buniek produkujúcich inzulínu a buniek produkujúcich glukagón potvrdí, že sa jedná o normálne histologické štruktúry (väčšina NET-ov je monohormonálna) (95).

Dôkaz expresie cytokeratínov a GATA3 môže byť dôležitý pri odlišovaní vzácneho pankreatického paragangliómu (GATA3+/ CK-) a NET-u s paraganglioma-like spôsobom rastu (GATA3-/ CK+) (97).

Pankreatoblastóm (PB)

PB je u dospelých pacientov veľmi vzácny, u detí sa však jedná o najčastejšiu malignitu pankreasu. Cytologická diagnóza PB je mimoriadne obtiažna, nádor napodobuje NET, SPN alebo ACC; definujúcimi cytologickými znakmi sú „blast-like“ malé okrúhle bunky a skvamoidné moruly (98). Imunohistochemický profil tumoru je závislý od histologického zloženia tumoru základom je acinárna diferenciácia (IHC profil viď vyššie) a pre diagnózu esenciálne skvamoidné hniezda/telieska, s variabilnou neuroendokrinnou (synaptofyzín/chromogranín +), duktálnou (CK7/CK19+), primitívnou malobunkovou a mezenchymálnou zložkou (s možnou heterológnou diferenciáciou). Skvamoidné hniezda nemajú kompletnú skvamóznu diferenciáciu, sú CK8, CK18 a CK19pozitívne, s expresiou CK5/6 iba v ojedinelých bunkách a sú pozitívne v dôkaze EMA a β-cateninu (v jadrách a cytoplazme), menej často pozitívne v dôkaze AFP (99-102).

Serózny cystadenóm (SCA)

SCA je ďalší veľmi vzácny tumor pankreasu, ide však (po mucinóznych léziách) o druhú najčastejšiu cystickú léziu pankreasu. Cytologicky je materiál zo SCA často málo diagnostický (hemoragický a s nízkou celularitou). Svetlé nádorové bunky sú PAS-pozitívne, s negatívnou expresiou neuroendokrinných markerov, a pozitívnou expresiou inhibínu-α a GLUT1, expresia inhibínu je však niekedy pomerne slabá (79,103). SCA je konzistetne PAX8-negatívny (cut-off 5 % buniek), čo môže pomôcť pri odlíšení metastatického svetlobunkového karcinómu obličky (104).

Mucinózne cystické lézie

Úloha pomocných histochemických a IHC vyšetrení v predoperačnej/cytologickej diagnostike mucinóznych neoplázií je limitovaná. Farbenie PAS (s diastázou), mucikarmínom alebo alciánovou modrou sú užitočné pri identifikácii mucínu (v bunkách i extracelulárne). IHC môže pomôcť pri typizácii neoplastického mucinózneho epitelu a (pri znalosti cesty odberu) v niektorých prípadoch môže odlíšiť neoplastický epitel od kontaminácie epitelom žalúdka alebo duodéna (105). MUC5AC je exprimovaný vo všetkých typoch IPMN, na rozdiel od ITPN (intraductal tubulopapillary neoplasm), ktorý je MUC5AC-negatívny a MUC1 a MUC6-pozitívny (106). Intestinálny typ IPMN je zvyčaje pozitívny v dôkaze MUC2, CDX2 a CK20, gastrický typ IPMN exprimuje MUC5AC a je negatívny s MUC1 a MUC2 a pankreatobiliárny typ IPMN je pozitívny v dôkaze MUC1 a negatívny s MUC2 a CDX2 (79,107). Expresia MUC1 a strata expresie DPC4/ SMAD4 s aberantnou expresiou p53 v IPMN je často asociovaná s invazívnym karcinómom (79). IOPN je pozitívny v dôkaze MUC1, MUC5AC, MUC6 a HepPar1(79,107,108). „Ovarian-type”

stromálne bunky, diagnostické pre MCN, sú zvyčajne pozitívne v dôkaze estrogénových a progesteronových receptorov, CD10, hladkosvalového aktínu a inhibinu-α (79). V čisto cytologických materiáloch je ovariálna stróma MCN zachytená iba zriedkavo, pri použití novších bioptických techník (TTNB) však vo vzorkách môže byť prítomná a umožňuje presnú diagnózu (49,109).

Metastázy

Podrobná diskusia o IHC v cytologickej diagnostike metastáz v oblasti pankreatobiliárneho traktu je mimo zámer tohto článku. Žlčové cesty a najmä pankreas však vzácne môžu byť cieľom metastáz (alebo priamej propagácie) iných malignít a na túto možnosť je nutné pamätať. Dobrým vodítkom k správnej diagnóze je klinická anamnéza, ale v niektorých prípadoch môže metastáza predstavovať prvý prejav ochorenia (105). Najčastejšou metastatickou malignitou je renálny karcinóm (PAX8+), následovaný karcinómom pľúc (TTF1+, napsin A+), melanómom (SOX10+) a kolorektálnym adenokarcinómom (CDX2+, SATB2+) a celým spektrom ďalších epitelových malignít a vzácne aj sarkómov (najčastejší je leiomyosarkóm) (111-113). IHC vyšetrenie zohráva v správnej diagnostike metastatického ochorenia kľúčovú úlohu.

Duktálny adenokarcinóm (PDCA) pankreasu a karcinóm žlčových ciest

Odlíšenie zmien low-grade nádorových od nenádorových/reaktívnych (chronická pankreatitída, autoimunitná pankreatitída, nenádorové stenózy žlčových ciest) môže byť v malých biopsiách a v cytológii veľmi náročné, niekedy až nemožné. V literatúre sa popisuje množstvo IHC markerov, ktoré by mohli byť užitočné pri riešení tejto diferenciálnej diagnózy (tabuľka 2) (79,114,115). Za najužitočnejšie a dobre vyskúšané markery sú aktuálne považované maspin, IMP3 a S100P, ktoré sú pozitívne vo viac ako 90% PDCA a pVHL, ktorý vykazuje stratu expresie v takmer všetkých PDCA a zachovanú expresiu v nenádorových duktoch (114). Približne 50-60 % PDCA je negatívnych v dôkaze DPC4/SMAD4 a asi 50-60 % má aberantnú expresiu proteínu p53 (114,116118). Vyšetrenie a hodnotenie expresie SMAD4 však môže byť problematické a hodnotenie intenzity expresie (znížená intenzita versus úplné chýbanie expresie) môže zvýšiť senzitivitu vyšetrenia (119). Normálne pankreatické dukty sú zvyčajne CK17, MUC5AC a mCEA negatívne (alebo iba slabo mCEA-pozitívne), na rozdiel od PDCA, ktorý býva CK17, MUC5AC a mCEA-pozitívny (79,114,120). Tak ako v iných podobných situáciách, kombinácia viacerých markerov má lepšiu senzitivitu a špecificitu, pretože jednotlivé markery (prípadne aj kombinácia viacerých markerov) môžu napr. v teréne autoimunitnej pankreatitídy vykazovať aberantnú expresiu aj v nenádorových extralobulárnych duktoch a intralobulárnych reaktívnych duktoch (v acinoduktálnej metaplázii) (121). V jednej štúdii mala kombinácia maspinu, CK17 a Ki67 (cut-off 5 %) senzitivitu 98,8 % a špecificitu 100 % pre PDCA (122). Kombinácia pVHL, IMP3 a S1004A mala senzitivitu 100 % a špecificitu 96 % (123). Pozitivita najmenej dvoch z troch markerov (S100P, IMP3, SMAD4) vykazovala v ďalšej štúdii senzitivitu pre PDCA 91,89 % a špecificitu 100 % (124). Podľa viacerých štúdií je proliferačný antigén Ki67 taktiež užitočný v odlišovani nádorových duktov od nenádorových, problémom však je, že neexistuje všeobecne uznávaný/doporučovaný cutoff pre hodnotenie expresie (v rôznych publikáciách je udávaný cut-off pre PDCA 5-50 %) (121,122,125).

Panel zložený z pVHL, IMP3, S100P alebo rovnaký panel s pridaním maspinu môže byť užitočný aj pri odlišovaní nádorových a reaktívnych lézií žlčových ciest a žlčníka (79,126). Podľa inej práce mal panel IMP3/ EZH2 /p53 senzitivitu 80,8 % a špecificitu 100 % pre detekciu extrahepatálneho cholangiokarcinómu

(127). Imunohistochémia môže byť v niektorých prípadoch nápomocná aj pri odlišovaní primárneho intrahepatálneho cholagiokarcinómu od metastázy PDCA; imunofenotyp S100P-/ pVHL+/MUC5AC-/CK17je typický pre intrahepatálny cholagiokarcinóm, zatiaľ čo fenotyp S100P+/pVHL-/MUC5AC+/-/ CK17+ je typický pre metastatický PDCA (128).

Autori tohoto prehľadového článku otvorene priznávajú, že s použitím vyššie spomínaných protilátok majú minimálne skúsenosti (snáď okrem použitia markerov p53 a Ki67), a pri odlišovaní zmien reaktívnych od low-grade neoplastických sa viac spoliehajú na výsledky genetických vyšetrení, predovšetkým na techniku „next generation sequencing“ (viď nižšie).

Tabuľka č. 2. Vybrané IHC markery pre odlíšenie pankreatického duktálneho adenokarcinómu (PDCA) a pankreatitídy.

Genetické vyšetrenia

FISH (fluorescenčná in situ hybridizácia)

Mnoho prác potvrdilo, že vyšetrenie FISH signifikantne zvyšuje senzitivitu a diagnostickú presnosť pre karcinóm pankreasu a žlčových ciest v porovnaní so samotnou cytológiou. Senzitivita FISH v kombinácii s cytológiou (prípadne biopsiou) dosahovala 50,7-89 %, špecificita bola 74,1-100 % (129-135). Vo väčšine prác bol použitý kit UroVysion ktorý je primárne určený na detekciu uroteliálneho karcinómu v cytológii; kit detekuje centroméry chromozómov 3, 7, a 17 a obsahuje lokus-špecifickú sondu zameranú na oblasť 9p21. Iná kombinovaná sonda, detekujúca lókusy 1q21, 7p12, 8q24 a 9p21, mala v porovnaní s kitom UroVysion signifikantne vyššiu senzitivitu (64,7 % vs 45,9 %) pri porovnateľnej špecificite (92,9 % a 90,8 %) (136). Veľkou výhodnou FISH vyšetrenia je dobrá dostupnosť vyšetrenia a rýchlosť, nevýhodou je pomerne veľká pracnosť metodiky a časovo náročné hodnotenie. Dôležitá je dôkladná validácia metodiky v laboratóriu a stanovenie optimálnych cut-off hodnôt pre pozitívny výsledok (polyzómie, zisky a straty konkrétnych lokusov). Pri hodnotení delécií je nevyhnutné pamätať na možnosť falošne pozitívneho výsledku pri horšej hybridizácii sondy (137). Ďalším zdrojom falošnej pozitivity môžu byť napr. vzorky od pacientov s autoimunitnou pankreatitídou, chronickou pankreatitídou, alebo premalígne lézie, ktoré ešte nemajú cytologicky rozpoznateľné zmeny (136,138,139).

PCR testovanie jednotlivých génov

Ďalšou alternatívou ako spresniť diagnostiku je zapojenie metód PCR (polymerázová reťazová reakcia). Môže sa jednať o vyšetrovanie alterácií jednotlivých génov, alebo menšieho počtu viacerých génov, prípadne v kombinácii s vyšetrením inými technikami, napr. FISH. PCR (najmä vyšetrenie mutácií KRAS) a FISH sú vzájomne komplementárne a v kombinácii s cytológiou (oproti samotnej cytológii) signifikantne zvyšujú senzitivitu pre malignitu na 66-73 % pri špecificite 96-100 % (140-142). Podľa ďalšej zaujímavej práce, sekvenčné vyšetrenie cytológie, s postupným pridávaním analýzy KRAS, LOH 9p (lokus CDKN2A) a LOH18q (lokus SMAD4) malo senzitivitu 92 % a špecificitu 43 %; ak bol tento algoritmus aplikovaný iba na cytologicky nejednoznačné prípady, tak bola senzitivita až 100 % (143).

Najčastejšie mutovaným génom v PDCA je KRAS (70-95 %). Podľa jednej z mnohých prác malo samotné vyšetrenie mutácií KRAS v materiáloch z FNA solídnych lézií pankreasu senzitivitu pre malignitu 79,3 % a špecificitu 100 % a v prípade aplikácie genetiky iba na nejednoznačné a negatívne cytológie (ako testu druhej línie po cytologickom vyšetrení) sa senzitivita zvýšila na 90 % pri zachovanej 100 % špecificite. Senzitivita kombinovaného testu (cytológia + test mutácie KRAS) sa v literatúre pohybuje medzi 62-97 %, špecificita je 47-100 % (väčšina prác udáva špecificitu ~100 %); celková diagnostická presnosť je 85-98 % (144). Na PCR analýzu je možné využiť napr. aj reziduálnu LBC tekutinu alebo tekutinu získanú preplachom EUS-FNA ihly (146,147). Pri hodnotení výsledkov genetických vyšetrení je nutné pamätať na skutočnosť, že nález jednotlivých alterácií nemusí byť 100% špecifický pre malignitu (napr. alterácie KRAS sa pravidelne vyskytujú aj v low-grade pankreatickej intraepiteliálnej neoplázii/PanIN, zatiaľ čo až menej často detekované alterácie TP53, SMAD4, CDKN2A sú známkami pokročilej lézie – high-grade PanIN alebo PDCA) (148). Nevyhnutná je preto dôkladná klinicko-radiologicko-patologická korelácia.

PCR má využitie aj v diagnostike cystických lézií pankreasu, najmä pri odlišovaní mucinóznych lézií od nemucinóznych. Dôkaz mutácie KRAS má špecificitu pre mucinóznu léziu 95-98 %, senzitivita je však iba 39-47 %. V kombinácii s ostatnými diagnostickými modalitami (vyšetrenie CEA, cytológia) však vyšetrenie dosahuje senzitivitu až 71 % (149). Súčasný dôkaz mutácií KRAS a GNAS v cystickej lézii pankreasu je diagnostický pre IPMN, dôkaz mutácie CTNNB1 je diagnostický pre SPN, alterácie VHL sú typické pre SCA a fúzie ATP1B1::PRKACB, DNAJB1::PRKACA, alebo ATP1B1-PRKACA sú charakteristické pre IOPN (150,151). Alterácie CDKN2A, TP53, SMAD4, TERT a ďalších génov predstavujú v mucinóznych léziách neskoré genetické udalosti a signalizujú prítomnosť high-grade dysplázie, alebo invazívneho karcinómu. Tieto zmeny môžu pomôcť identifikovať cystické lézie vyžadujúce chirurgickú intervenciu (149,150).

NGS (next generation sequencing, masívne paralelné sekvenovanie)

Nevýhodou klasickej PCR je, že vyšetruje zmeny v konkrétne vybranom géne, alebo v menšom počte génov, ale spektrum potenciálne relevantných genetických zmien v nádorových léziách pankreatobiliárneho traktu je široké; niektoré alterácie sú navyše pomerne špecifické pre jednotlivé anatomické lokalizácie (tabuľka 3) a mnohé predstavujú potenciálny terapeutický cieľ (152-154). Z tohto pohľadu je testovanie jednotlivých biomarkerov v súčasnosti nedostačujúce. V jednej z prvých štúdií, v ktorej použili celoexómové sekvenovanie karcinómov žlčových ciest bol možný cieľ identifikovaný až v takmer 40 % prípadov (153). Potenciálne targetovateľné genetické alterácie sú (v porovnaní s nádormi žlčovodov) v nádoroch pankreasu podstatne vzácnejšie (~ 20 %), ale pri onkologickom manažmente môžu mať nezanedbateľný dopad (155, viac v článku Němeček et al. v tomto čísle). Do popredia sa preto postupne dostáva diagnostika pomocou techniky NGS (najmä „targeted“ NGS, t.j. vyšetrenie väčšieho panelu vybraných génov), ktorá okrem spresnenia (cyto)patologickej diagnostiky môže pomôcť pri výbere ideálnej (neo)adjuvantnej terapie a to nielen v PDCA, alebo adenokarcinómoch žlčových ciest; napríklad až ~ 20 % acinárnych karcinómov pankreasu má potenciálne cieliteľné rearanže BRAF, alebo RET (156).

NGS na cytologických materiáloch je konzistentná a reprodukovateľná technika, navyše senzitivita NGS je výrazne vyššia ako senzitivita klasického Sangerovského sekvenovania s použitím komerčných kitov schválených FDA (157,158). Úspech vyšetrenia je okrem iných faktorov závislý na kvalite a kvantite získanej nádorovej DNA/RNA; kombinované využitie viacerých typov materiálov (napr. cytoblok + nátery) môže signifikantne zvýšiť počet úspešných NGS vyšetrení (159,160). Úlohou patológa je vybrať na vyšetrenie najlepší dostupný materiál, s dostatočným počtom a optimálnym percentuálnym zastúpením nádorových buniek (s ohľadom na citlivosť konkrétne použitej NGS techniky); v prípade suboptimálneho materiálu je vhodné vyšetrenie zastaviť, aby sme sa vyhli falošne negatívnemu výsledku. Väčšina NGS platform vyžaduje minimálne 10-20% zastúpenie nádorových buniek (161).

Tabuľka č. 3 Hlavné genetické alterácie pankreatobiliárnych adenokarcinómov a alterácie špecifické pre jednotlivé anatomické lokalizácie (152,153).

Obr. 1. „Brush“ cytológia stenózy choledochu u 81-ročnej ženy (farbenie PAP). V náteroch boli prítomné kohezívne klastre epitélií s diskrétnymi cytoarchitektonickými atypiami (A,B). Samotný cytologický nález bol hodnotený ako „atypické bunky“ (PAP3). NGS vyšetrenie z materiálu získaného zoškrabaním zo skla potvrdilo prítomnosť mutácie CDKN2A. Definitívna cytologická diagnóza bola „suspektné z malignity“ (PAP5). Radiologicky bol neskôr potvrdený inoperabilný tumor hlavy pankreasu s infiltráciou duodéna a metastázami v lymfatických uzlinách. V korelácii s radiologickým nálezom by bolo možné cytologický nález klasifikovať aj ako „malígny“.

Obr. 2. FNAB tumoru hlavy pankreasu u 47-ročného muža, pacient má metastázy v lymfatických uzlinách a v pečeni. V náteroch boli okrem benígneho intestinálneho epitelu zachytené trojrozmerné zhluky mierne až stredne atypických buniek, so stratou kohezivity, pozadie je„špinavé“ nekrotické. Cytologický nález bol suspektný z malignity (PDCA), ale suspektných buniek bolo relatívne málo. NGS vyšetrenie vykonané z oddelene zaslaného materiálu v „RNA later“ roztoku dokázalo prítomnosť mutácie BRCA1. Definitívna cytologická diagnóza bola „malígne“ (PAP6). Vysoká alelická frekvencia zistenej mutácie upozornila na možnosť zárodočnej mutácie a familiárnu formu ochorenia. Alterácia BRCA1 navyše predstavuje potenciálny terapeutický cieľ.

Obr. 3. FNAB cystickej lézie pankreasu u 75-ročnej ženy (farbenie PAP). V náterovej cytológii bolo prítomné mucinózne pozadie s neutrofilmi a detritom (A) a iba ojedinelými zhlukmi cytologicky blandných mucinóznych epitélií (B). Nález bol sugestívny pre diagnózu mucinóznej neoplázie. NGS vyšetrenie vykonané z materiálu zoškrabaného z dvoch skiel potvrdilo prítomnosť mutácií KRAS a GNAS. Definitívna cytologická diagnóza bola IPMN bez high grade dysplastických zmien. Pacientka je sledovaná, resekcia lézie pre celkový výkonnostný stav nie je možná.