Nediagnostikovaná kryptokoková meningoencefalitída s rozsiahlymi hypoxickoischemickými zmenami mozgu charakteru tretieho stupňa difúzneho axonálneho poškodenia

Souhrn

Popisujeme prípad 50-ročnej imunokompetentnej ženy, ktorá bola hospitalizovaná s poruchou vedomia. Stav progredoval do bezvedomia s kvadruparézou, pričom ani laboratórne vyšetrenia ani opakované vyšetrenia likvoru z lumbálnej punkcie nezistili pôvodcu klinického stavu. Pacientka zomrela po osemdňovej hospitalizácii. Mikroskopicky a kultivačne bol po pitve ako etiologický agens zistený Cryptococcus, ktorý počas života viedol k ťažkej kryptokokovej meningoencefalitíde, ktorá bola príčinou smrti. Histologicky boli v tkanive mozgu prítomné nakopenia kryptokokov, ktoré vo farbení hematoxylínom-eozínom verne napodobovali erytrocyty a rozsiahle krvácania. Multifokálna obliterácia cievneho riečiska mozgu kvasinkami bola sprevádzaná rozvojom hypoxicko-ischemických zmien imitujúcich úrazové difúzne axonálne poškodenie mozgu.

Klíčová slova:

kryptokoková meningoencefalitída – Cryptococcus – difúzne axonálne poškodenie – hypoxicko-ischemické poškodenie mozgu

Kryptokokóza je infekčné ochorenie s celosvetovým rozšírením a s širokým spektrom klinických symptómov spôsobených opuzdrenou kvasinkou rodu Cryptococcus (1). Vzhľadom k tomu, že ochorenie môže postihovať jeden orgán, ale može dôjsť aj k jeho diseminácii, sú klinické prejavy ochorenia nešpecifické a závislé od orgánového poškodenia. V kazuistike popisujeme kryptokokovú meningoencefalitídu s letálnym koncom, ktorej diagnostika napriek opakovanému odberu likvoru z lumbálnej punkcie bola negatívna. Masívne postihnutie mozgu prakticky bez leukocytárnej reakcie bolo sprevádzané hypoxicko-ischemickými zmenami charakteru difúzneho axonálneho poškodenia.

OPIS PRÍPADU

Jednalo sa o 50-ročnú ženu, ktorá bývala a pracovala v bližšie nešpecifikovanom poľnohospodárskom objekte. Do nemocnice bola privezená v neskorých večerných hodinách pre poruchu vedomia s ťažkou anémiou. Na druhý deň v skorých ranných hodinách po prijatí došlo k vzniku bezvedomia pričom pacientka musela byť zaintubovaná. Kultivačným vyšetrením steru hrdla bol zistený Proteus mirabilis a alfa-hemolytické streptokoky, kultivácia plesní a kvasiniek bola negatívna, v nose bol zistený Staphylococcus aureus, kultivácia plesní a kvasiniek bola negatívna. Kultivačné vyšetrenie likvoru vykonané na tretí a šiesty deň hospitalizácie bolo opakovane negatívne, serologicky bola zistená pozitivita na borélie. Opakovaným vyšetrením magnetickou rezonanciou na tretí a šiesty deň hospitalizácie boli v mozgu diagnostikované obojstranne zmeny charakteru hypoxického poškodenia. Toxikologické vyšetrenia na prítomnosť ťažkých kovov boli negatívne. Opakovane bola zistená nulová hodnota tyreostimulujúceho hormónu. Laboratórne neboli zistené také zmeny, ktoré by poukazovali na nejakú zjavnú poruchu imunity, pacientka bola imunokompetentná a zomrela na ôsmy deň hospitalizácie v pretrvávajúcej kóme s kvadrupostihnutím s ľavostrannou akcentáciou za klinických prejavov nešpecifikovanej panencefalitídy.

Pitva bola vykonaná 15 hodín po smrti, pričom neboli zistené žiadne vonkajšie ani vnútorné poranenia. Vzhľadom k tomu, že sa jednalo o prípad neidentifikovanej meningoencefalitídy bol po otvorení lebečnej klenby cez corpus callosum odobratý likvor za účelom mikrobiologického a genetického vyšetrenia v Národnom referenčom centre pre meningokoky. Biologický materiál bol odoslaný v chladenom stave pri teplote 4°C. Najdôležitejším makroskopickým nálezom zisteným počas pitvy boli zmeny na mozgu, ktorý bol výrazne edematózny s vytvorením cerebelomedulárneho kónusu. Na mäkkých plenách boli na spodnej ploche ľavého frontálneho laloka a obojstranne v oblasti temporálnych lalokov v blízkosti mozgového kmeňa prítomné celkom ojedinelé relatívne ostro od okolia ohraničené červeno sfarbené plôšky zasahujúce aj do samotnej kôry mozgu (obr. 1). Obnažením komorového systému boli v ependýme prevažne vpravo zistené mnohopočetné, miestami až splývavé bodkovité červené lézie charakteru čerstvých krvácaní (obr. 2), pričom identické zmeny boli prítomné aj na frontálnych rezoch vedených cez corpus callosum, bielu hmotu hemisfér a bazálne gangliá až po mesencephalon (obr. 3). V tkanive mozgu po fixácii vo formole boli prevažne v subependymálnej oblasti bazálnych ganglií zreteľné štruktúry homogénneho nodulárneho charakteru hnedej farby veľkosti <1 mm (obr. 4). Splývavé poškodenie v oblasti pravých bazálnych ganglií malo po fixácii výrazne špongiovitý porézny a drolivý charakter, s matnou svetlohnedou farbou. Most, predĺžená a krčná miecha boli makroskopicky bez zmien.

Histologickým vyšetrením mozgu boli zistené zmeny charakteru čerstvých intraparenchymatóznych a perivaskulárnych krvácaní (obr. 5) sprevádzaných edematóznymi a hypoxickými zmenami. Celkovo bol mikroskopický obraz vo farbení hematoxylínom- eozínom (HE) pomerne nenápadný. Rozsah makroskopicky videných zmien pri porovnaní s mikroskopickým obrazom však vôbec nekorešpondoval „očakávanému“ rozsahu „krvácaní“. Kvôli tomu boli vykonané ďalšie špeciálne farbenia, z ktorých boli pozitívne farbenia podľa Grama (obr. 6) a Grocotta (obr. 7), so slabou pozitivitou pri farbení PAS a PAS s diastázou, ktoré boli najvýraznejšie v miestach makroskopických „krvácaní“. Farbením podľa Grama a Grocotta bola zistená prítomnosť guľatých a výrazne opuzdrených štruktúr charakteru kvasiniek veľkosti do 6-7 μm typu kryptokokov. Prítomnosť veľkého množstva kvasiniek vysvetlila rozdiel medzi makroskopickým a mikroskopickým HE obrazom, v ktorom nebolo prítomné „len očakávané“ difúzne krvácanie. Makroskopicky videné rozsiahle hnedé ložiská mikroskopicky zodpovedali nielen erytrocytom ale prevažne masívne nakopeným kryptokokom. Cievy pri 400x zväčšení obsahovali štruktúry konzistentné s „normálnymi“ erytrocytmi, avšak pri 1000x násobnom zväčšení s preostrovaním a použitím kondenzora bolo vo väčšine štruktúr „erytrocytov“ prítomné zjavné prejasnenie periférie (obr. 8). Kryptokoky boli nielen v extravaskulárnych priestoroch, ale multifokálne vypĺňali priesvity ciev a vytvárali až kryptokokové emboly (obr. 9, obr. 10). Nakoľko niektoré prevažne tangenciálne zachytené štruktúry pripomínali tak kapiláry ako aj hýfy vykonali sme aj farbenie pomocou laminínu a CD34. Týmito farbeniami boli v suspektných oblastiach zistené len steny kapilár. Vyjmúc vyššie uvedené zmeny boli v bazálnych gangliách ako aj v oblasti ponsu fokálne prítomné čerstvé hypoxické zmeny neurónov („red neurons“) a ložiskovo výrazné zhrubnutie a zvlnenie axónov, ktoré v transverzálnej rovine vytvárali miestami obraz hustého nakopenie sféroidov (obr. 11). Zmeny axónov zodpovedali difúznemu axonálnemu poškodeniu („diffuse axonal injury“ – DAI) a najmarkantnejšie boli viditeľné pri imunohistochemickom farbení v dôkaze neurofilament proteínu (NF) (obr. 12, obr. 13). V tkanive mozgu sme nezistili prítomnosť polymorfonukleárnych leukocytov, lymfocytov, penovitých makrofágov ani zjavné reaktívne zmeny v zmysle gliózy alebo gemistocytárnej premeny astrocytov. Z ostatných nálezov zistených pri pitve bolo diagnostikované ľahké skôrnatenie tepien, alveolárny edém pľúc bez zápalu a bez prítomnosti Grampozitívnych kvasiniek. V štítnej žľaze (18 g) bol prítomný papilárny mikrokarcinóm (5 x 7 mm) s inváziou do kapsuly. Vyšetrením likvoru a tkaniva mozgu odobratých pri pitve, realizovanom v Národnom referenčnom centre pre meningokoky 24 hodín po pitve, nebola pomocou RT-PCR metódy zistená v likvore prítomnosť Neisseria meningitidis. Fakultatívne ale rutinne vykonaným farbením centrifugovaného likvoru podľa Grama bola v nátere zistená záplava veľkého množstva veľkých, guľatých, miestami pretiahlych, ojedinele pučiacich, superopuzdrených kvasiniek charakteru kryptokokov, pričom polymorfonukleárne leukocyty neboli vôbec prítomné. Zatiaľ čo mikroskopický obraz likvoru bol takmer v celom rozsahu uniformý, v odtlačku z tkaniva zmrazeného mozgu boli na povrchu tkaniva dobre sa farbiace kvasinky, avšak v hĺbke tkaniva boli v dôsledku rozpadu jadier prítomné len nefarbiace sa puzdra kvasiniek. Na základe aeróbnej kultivácie na mykologických pôdach (Sabourod) a následnej mikroskopie bola na základe morfologických vlastností stanovená prítomnosť kryptokokov. Pokus o DNA analýzu na bližšiu špecifikáciu druhu pomocou PCR metódy vo formole fixovaných a parafíne zaliatych bločkoch mozgu bol na dvoch samostat- ných pracoviskách neúspešný. Bezprostrednou príčinou smrti pacientky bola kryptokoková meningoencefalitída s rozsiahlymi hypoxicko-ischemickými zmenami mozgu.

DISKUSIA

Kryptokokózu prvýkrát popísal nemecký patológ Otto Busse v roku 1894 a 1895 u pacientky s chronickou periostitídou tíbie, pričom autor predpokladal, že ochorenie je vyvolané kvasinkou podobnou Saccharomyces, preto ju nazval Saccharomyces hominis. Identický klinický prípad publikoval aj chirurgický asistent a neskôr renomovaný dermatológ Abraham Buschke (2), takže ochorenie je v literatúre uvádzané aj ako Busseho-Buschkeho choroba (3). Mezi najdlhšie používané synonymum kryptokokózy patrí názov torulóza, nakoľko bol v roku 1902 Josephom Weisom etiologický agens pomenovaný ako Torula neoformans (2). Ochorenie sa často spomína aj ako Európska blastomykóza (3). V mozgu bol klinickopatologický obraz kryptokokózy popísaný v roku 1916 Stoddardom a Cutlerom (4), pričom v bývalej Československej republike bol prvýkrát publikovaný prípad v roku 1954 (5). Kryptokoky patria medzi bazídiové huby a pre človeka sú hlavnými patogénnymi predstaviteľmi dva druhy, Cryptococcus (C.) neoformans a C. gattii. Porovnávacou analýzou genómu týchto kryptokokov bolo zistené, že sú na 87% identické (6) a k ich genetickému oddeleniu došlo pred asi 80. miliónmi rokov (16-160 miliónov rokov) (7). Podľa taxonomickej klasifikácie rod kryptokokov obsahuje viac ako 100 druhov, pričom pre človeka sú nebezpečné dve rozdielne variety (druhy), C. neoformans var. neoformans a C. neoformans var. grubii, ktorý ďalej zahŕňa päť samostatných foriem (species) (8). Kryptokoky sú rozšírené po celej zemi, vyskytujú sa hlavne v pôde, v exkrementoch vtákov a na stromoch (9) a človek sa najčastejšie nakazí inhaláciou infekčného agensu (10). Sú významnými patogénmi cicavcov (11), a ako fakultatívny intracelulárny patogén sa dokážu rozmnožovať v makrofágoch (12,13) a amébach (13). Na základe rôzneho orgánového postihnutia a pôvodu bol v minulosti C. neoformans popísaný pod 33 rôznymi názvami a synonymami. Prvotne sa predpokladalo, že C. neoformans sa delí asexuálne a až v roku 1975 bolo zistené aj jeho sexuálne rozmnožovanie, pričom táto forma bola popísaná ako Filobasidiella neoformans (14). Vo všeobecnosti C. neoformans postihuje imunokompromitované osoby (15,16) a zriedkavo aj ľudí bez zjavnej imunodeficiencie (15), tak ako to bolo aj v nami popisovanom prípade. Postihnúť môže izolovane ktorýkoľvek orgán (napr. koža, oči, myokard, kosti, kĺby, prostata), ale najčastejšie je postihnutá centrálna nervová sústava. U pacientov s AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome) je C. neoformans najčastejším vyvolávateľom kvasinkových infekcií centrálnej nervovej sústavy (9,17) a po HIV-encefalopatii a progresívnej multifokálnej leukoencefalopatii je treťou najčastejšou neurologickou komplikáciou u týchto pacientov (18). C. gattii primárne postihuje imunokompetentných jedincov v endemických regiónoch (napr. Austrália, Vancouverský ostrov) (19-21). Medzi najvýznamnejšie virulenčné faktory C. neoformans patrí polysacharidová kapsula, ktorá svojim rastom môže mať niekoľkokrát väčší rozmer ako samotné telo kvasinky (22) a je unikátna pre kryptokoky. Predpokladá sa, že uvoľnený kapsulárny materiál je schopný potláčať imunitný systém organizmu (10). Ďalším výrazným faktorom virulencie pri infekciách cicavcov je schopnosť kvasinky rásť pri 37°C a syntéza melanínu, ktorá vyžaduje prítomnosť enzýmu lakázy. Lakáza katalyzuje polymerizáciu pigmentu za prítomnosti fenolických zložiek, ako je L-DOPA (23). Intracelulárne syntetizovaný melanín je prenesený do bunkovej steny (24), kde takto melanizované steny C. neoformans sú menej vnímavé k fungicídnym reakciám, fagocytóze, reaktívnemu kyslíku a dusíkatým látkam (23). To, že mozog obsahuje výdatné množstvo fenolických zložiek, vrátane napr. noradrenalínu, serotonínu a dopamínu vysvetľuje aj afinitu C. neoformans k centrálnemu nervovému systému (23,25). Doterajšie výsledky poukazujú na to, že C. gattii zväčša spôsobuje ťažké postihnutie pľúc a smrť bez diseminácie, zatiaľ čo C. neoformans ľahko diseminuje do mozgu a spôsobuje smrť v dôsledku meningoencefalitídy (15). V popisovanom prípade predpokladáme, že sa jednalo C. neoformans. V roku 2014 bolo odhadnuté, že za rok na celom svete zomrelo 181 100 ľudí v dôsledku kryptokokovej meningitídy, s najvyšším podielom v oblasti sub-Saharskej Afriky (75%), kde je najvyšší výskyt AIDS. V Európe je odhadovaná mortalita na kryptokokovú meningitídu u liečených pacientov približne 30% a u neliečených približne 45% (26). Kryptokoky môžu spôsobiť difúznu meningitídu spodiny mozgu (tzv. bazilárna meningitída) podobnú tuberkulóze, alebo vytvoriť mnohopočetné, cystám podobné abscesy v tkanive. Ak spôsobia vznik meningitídy zvyčajne je prítomné skalenie plien a mierne zhrubnutie bez prítomnosti hnisavého výpotku, čo ju odlišuje od typickej bakteriálnej meningitídy. Kryptokokové kvasinky sú mikroskopicky charakteristické širokou, hrubou kapsulou a varibilným sférickým tvarom (27). V HE farbení má mikroorganizmus oválne telo priemeru 4-7 μm, ktoré je obklopené kapsulou hrúbky 3-5 μm (28). Vo farbení HE majú kryptokoky a erytrocyty podobný rozmer a vzhľad a preto je ich vzájomné odlíšenie často veľmi obtiažne až nemožné. Erytrocyty a krvácanie preto patria do diferenciálnej diagnostiky kryptokokózy (5). Aj v našom prípade v HE farbení a zväčšení 400x nebola prítomnosť kryptokokov na prvý pohľad zjavná. Kryptokoky patria medzi dimorfické huby, to znamená, že môžu rásť aj ako kvasinky aj ako plesne (15,29). K deleniu môže dôjsť asexuálne pučaním, ako aj sexuálnym vývinom, počas ktorého podstupujú premenu s rastom hýf, vytváraním mycélia a tvorbou baziodiospór (30). Vzhľadom k tomu, že v danom prípade kapiláry mozgu do istej miery pripomínali prítomnosť neseptovaných hýf, vykonali sme imunohistochemické farbenie pomocou laminínu, ktorý sa v stenách húb nenachádza (31). Farbením proti laminínu, ako aj pomocou CD34 sa ofarbili všetky „suspektne podozrivé“ štrukúry (cievy), a takto sme vylúčili prítomnosť hýf, a tým aj možnosť ich možného sexuálneho vývinu. V klinickej praxi medzi najpriekaznejšie laboratórne vyšetrenia na dôkaz kryptokokózy patria (v zostupnom rade): kultivácia, detekcia kapsulárneho antigénu zo séra alebo likvoru a vyšetrenie pomocou PCR (32). Lumbálna punkcia vykonaná za účelom dôkazu prítomnosti kryptokokov v likvore môže byť negatívna (33), tak ako to bolo opakovane aj v tomto prípade. V mikrobiologickej diagnostike sa na odlíšenie C. neoformans a C. gattii používa kultivácia na CGB agare (kanavanínový glycínový bromotymolový agar), ktorým však spolupracujúce a oslovené mikrobiologické pracoviská nedisponujú. Vzhľadom k tomu, ako aj vzhľadom k neúspešným pokusom o PCR analýzu z parafínových bločkov bližšia špecifikácia kryptokokov nebola možná.

Popisovaný prípad je zaujímavý aj nálezom difúznych ložiskovo výrazne zhrubnutých a prerušených axónov, popisovaných ako DAI. Makroskopickým markerom DAI je prítomnosť mnohopočetných bodkovitých krvácaní v bielej hmote mozgu a mozgového kmeňa, pričom k vzniku DAI môže dôjsť pri poraneniach s prítomnosťou alebo bez prítomnosti zlomenín lebky (34). DAI patrí medzi primárne poranenia mozgu, ktoré sa vyskytujú tak u dospelých ako aj u detí (35). Takýto obraz je prítomný v približne 40-50 % kraniocerebrálnych poranení, pričom za mechanizmus vzniku sa považuje akcelerácia alebo decelerácia hlavy (36), sprevádzaná strižnými a rotačnými silami na vlákna bielej hmoty pri nárazoch o veľkej sile (37). Pri vzniku DAI u detí pri tzv. „shaken baby syndrome“ nie je nutný náraz hlavy o predmet (35). Na podklade kumulácie a následnej imunohistochemickej detekcie špecifických látok v poškodených axónoch je možné stanoviť minimálny čas od úrazového deja. Dôkaz NSE (neurón špecifická enoláza) vykazuje pozitivitu už 30 minút po úraze, β-APP (beta amyloidový prekurzorový proteín) po 3 hodinách a NF po 6 hodinách (38,39). Zjavné zmeny detekovateľné v HE farbení sú až po 12 hodinách. V minulosti sa DAI považovalo za korelát mechanického úrazového poškodenia mozgu, avšak v súčasnosti už predstavuje nešpecifický nález (40), nakoľko bol popísaný pri mnohých iných neúrazových procesoch ako napr. akútna intoxikácia, hypoxia/ischemia, hypoglykémia, otrava oxidom uhoľnatým (41). Obraz DAI je napr. častý v tesnej blízkosti okolo infarktov a chorobných krvácaní, avšak s takýmto rozsiahlym výskytom DAI v oblasti ponsu sme sa na našom pracovisku pri neúrazovom poškodení doposiaľ nestretli. V prezentovanom prípade bol ich najväčší výskyt v ponse s rozvinutými hypoxicko- ischemickými zmenami. Poškodenie axónov poukazovalo na aktívne prebiehajúci zápalový proces sprevádzaný hypoxickými a ischemickými pochodmi v oblasti mozgového kmeňa. Pri neznalosti anamnestických údajov a priebehu chorobného stavu by mohol byť takýto mikroskopický obraz DAI nesprávne interpretovaný ako tretí stupeň úrazového DAI (42).

ZÁVER

V prezentovanej kazuistike sme popísali prípad klinicky nediagnostikovanej kryptokokovej meningoencefalitídy u 50-ročnej imunokompetentnej ženy, ktorá sa prejavila poruchou vedomia s následnou kvadruparézou s ľavostrannou akcentáciou. Ani opakovaným odberom likvoru na kultiváciu počas života nebol zistený etiologický agens ochorenia. Mikroskopickým, mikrobiologickým a kultivačným vyšetrením bol post mortem ako pôvodca zápalového ochorenia mozgu určený Cryptococcus, ktorý najviac postihoval oblasť pravých bazálnych ganglií. Kryptokokové postihnutie mozgu bolo sprevádzané rozsiahlymi hypoxicko-ischemickými zmenami charakteristickými pre tretí stupeň úrazového difúzneho axonálneho poškodenia. S takýmto masívnym obrazom difúzneho axonálneho poškodenia v oblasti ponsu sme sa doposiaľ pri neúrazovej etiológii na našom pracovisku nestretli.

PREHLÁSENIE

Autor práce prehlasuje, že v súvislosti s témou, vznikom a publikáciou tohto článku nie je v konflikte záujmov a vznik publikácie a článku neboli podporené žiadnou farmaceutickou firmou. Toto prehlásenie sa týka aj všetkých spoluautorov.

Adresa pre korešpondenciu:

MUDr. Daniel Farkaš, PhD.

Úrad pre dohľad nad zdravotnou starostlivosťou SLaPA pracovisko Košice

Ipeľská 1, 043 73 Košice

tel.: +421552852665

e-mail: farkas.dany@gmail.com