Kapilárna zónová elektroforéza v spojení s UV detekciou pre simultánne stanovenie tramadolu a paracetamolu vo vzorkách farmaceutického a biologického charakteru

Souhrn

Prezentovaná práca sa zameriava na vývoj a validáciu analytickej metódy na báze kapilárnej zónovej elektroforézy v spojení s UV detekciou pre simultánne stanovenie tramadolu a paracetamolu vo farmaceutických a biologických vzorkách. Základný elektrolyt bol tvorený 50 mM uhličitanom amónnym, ktorý predstavuje pomerne atypický elektrolytový systém. Vyvinutá metóda disponuje vhodnými validačnými parametrami ako linearita (koeficient determinácie r2 ≥ 0,995), selektivita alebo medza dôkazu na úrovni 0,25 – 0,5 μg/ml. Metóda bola charakterizovaná adekvátnymi hodnotami presnosti a správnosti, ktoré boli v súlade s kritériami validačných smerníc, či už pre matrice farmaceutického alebo biologického charakteru. Detekcia bola uskutočnená pri vlnovej dĺžke 200 nm. Daná metóda bola úspešne použitá pre potreby stanovenia tramadolu a paracetamolu v rozličných liekových formách a v biologickej matrici moču. Dosiahnuté výsledky indikujú potenciál začlenenia metódy do procesov kontroly kvality liečiv a/alebo bioanalýzy.

Klíčová slova:

kontrola kvality – kapilárna zónová elektroforéza – UV detekcia – tramadol – paracetamol – bioanalýza

Úvod

Bolesť predstavuje subjektívny nepríjemný pocit v dôsledku skutočného alebo možného poškodenia tkaniva a patrí medzi najčastejší sprievodný jav širokého spektra akútnych či chronických ochorení¹⁾. Z tohto dôvodu je tlmenie bolesti jednou z hlavných terapeutických priorít súčasnosti. Rozoznávame tri základné typy bolesti, a to bolesť nociceptívnu (poškodenie najmä muskuloskeletálne), neuropatickú (poškodenie nervov) a psychickú²⁾. Hlavnými skupinami liečiv uplatňovanými v terapii bolesti sú analgetiká, nesteroidné antiflogistiká, opioidy a v špeciálnych prípadoch, najmä pri tlmení neuropatickej bolesti, sa môžu použiť aj tricyklické antidepresíva alebo antiepileptiká¹⁾.

Tramadol, chemicky trans-(±)-2-(dimetylaminometyl)-1-(metoxyfenyl)cyklohexanol, patrí do skupiny syntetických opioidných analgetík. Tieto zlúčeniny pôsobia na centrálny nervový systém a spôsobujú supresiu vnímania bolesti. Tramadol je indikovaný na liečbu akútnej a chronickej bolesti miernej až stredne silnej intenzity. Pôsobí dvoma hlavnými mechanizmami účinku, a to plnou neselektívnou agonizáciou opioidných μ, δ a κ receptorov (vykazuje však vyššiu afinitu k μ-opioidným receptorom) a inhibíciou spätného vychytávania noradrenalínu a sérotonínu³⁾.

Zo stereochemického hľadiska je tramadol chirálna molekula s dvoma chirálnymi centrami. Stereoizoméry sa mierne líšia aj mechanizmom pôsobenia, avšak prítomnosť oboch enantiomérov, čiže ich racemickej zmesi, je dôležitá pre zachovanie synergie terapeutického efektu. Aktívna zlúčenina tramadolu predstavuje zmes (+) (1R,2R)-tramadolu, ktorý prednostne inhibuje spätné vychytávanie sérotonínu a (–) (1S,2S)-tramadolu, ktorý aktivuje α-2 adrenergné receptory a tým znižuje spätné vychytávanie adrenalínu zo synaptickej štrbiny⁴⁾.

Tramadol vykazuje desaťnásobne nižší analgetický účinok oproti morfínu, ale má bezpečnejší terapeutický profil a nižšie riziko vzniku závažných nežiadúcich účinkov. Je indikovaný hlavne pri bolestiach svalov, kĺbov, pooperačných rán, chronickej bolesti chrbta, dentálnej alebo neuropatickej bolesti. Kontraindikáciou je vek pod 16 rokov, tehotenstvo, laktácia, alebo deficiencia enzýmu CYP2D6 – zodpovedného za metabolizáciu tramadolu. Abúzus tramadolu vedie k závažným prejavom, ako sú výrazné zníženie srdcovej frekvencie alebo tlmenie centra dýchania v predĺženej mieche. Pri dlhodobom užívaní, ktoré si často manažment terapie chronickej bolesti vyžaduje, sa môže objaviť fyzická závislosť, tolerancia či abstinenčný syndróm po vynechaní. V praxi sa často môžeme stretnúť s fixnou kombináciou tramadolu s ďalším analgetikom, a to paracetamolom. Výhody danej fixnej kombinácie pramenia zo synergie účinku týchto dvoch liečiv. Podanie dvoch analgeticky pôsobiacich liečiv s rozdielnym mechanizmom účinku vyvolá rýchlejší nástup účinku a jeho dlhšie trvanie⁵⁾.

Paracetamol (alebo acetaminofén), chemicky N-(4-hydroxyfenyl)acetamid, je jedným z najpoužívanejších voľnopredajných liečiv, určených na terapiu bolesti a pyrexie. Mechanizmus účinku nie je úplne objasnený ale predpokladá sa nekompetitívna reverzibilná inhibícia enzýmu cyklooxygenáza (COX) s vyššou selektivitou v mozgu, taktiež dochádza k znižovaniu tkanivových koncentrácií prostaglandínov a iných prozápalových mediátorov. Na rozdiel od nesteroidných antiflogistík (NSAID) sa ale nevyznačuje protizápalovým účinkom a nemá ani vplyv na zrážanlivosť krvi, lebo nepôsobí ako inhibítor syntézy tromboxánu. Výhodou však je, že vykazuje výrazne menšie riziko vzniku žalúdočného krvácania a vredov v porovnaní s NSAID^{1, 6)}. Jedným z metabolitov paracetamolu je N-arachidonylaminofenol (AM404), ktorý vykazuje analgetický účinok. Predpokladá sa viacero mechanizmov analgetického pôsobenia tohto metabolitu v organizme, ako napríklad blokáda neuronálneho vychytávania anandamidu či blokáda neuronálnych sodíkových kanálov^{1, 6)}.

Paracetamol je určený na terapiu miernej akútnej aj chronickej bolesti, v kombinácii s NSAID alebo opioidmi aj na liečbu stredne silnej bolesti. Štandardná jednorazová dávka u dospelých by mala byť od 500 mg do 1000 mg, pričom denná dávka by nemala prekročiť 3 – 4 g⁷⁾. Pri dlhodobom užívaní vysokých dávok hrozí zvýšené riziko kardiovaskulárnych, gastrointestinálnych a renálnych nežiadúcich účinkov či akútne zlyhanie pečene⁶⁾.

Metabolizmus paracetamolu je spriahnutý s enzýmom CYP2D6, pričom na základe rôznej expresie tohto enzýmu v organizme je možné jedincov rozdeliť na extenzívnych, ultrarýchlych a pomalých metabolizérov paracetamolu. Z toho vyplýva i variabilita tolerancie dávky alebo rôzna náchylnosť na prejavenie nežiadúcich účinkov⁶⁾. Paracetamol nie je odporúčaný osobám s akútnou alebo chronickou hepatopatiou, pri abúze alkoholu či malnutrícii⁸⁾.

Medzi najnebezpečnejšie nežiadúce účinky na úrovni gastrointestinálneho traktu (GIT) patrí jeho hepatotoxicita, ktorá je dôsledkom nadmerného hromadenia metabolitu N-acetyl-p-benzochinónimínu. Ten sa v prípade vyčerpania dostupného glutatiónu nevyhnutného k jeho inaktivácii viaže na mitochondriálne proteíny, kde dochádza k formovaniu cytotoxických aduktov, čo vedie k mitochondriálnej dysfunkcii a závažnej hepatocelulárnej nekróze. Ako primárne antidotum sa využíva N-acetylcysteín^{6, 9)}.

Tramadol spolu s paracetamolom patria medzi frekventovane predpisované liečivá a s tým sa spája aj potreba vývoja efektívnych analytických metód pre ich kvalitatívne aj kvantitatívne hodnotenie v biologických matriciach, akými sú predovšetkým krv a moč. Takéto metódy sú schopné prispieť k zefektívneniu samotnej liečby v dôsledku možnosti monitorovania compliance pacienta (zvýšenie terapeutického účinku) a eliminácie/minimalizácie nežiadúcich účinkov. Odhliadnuc od hodnotenia liečiv v biologických matriciach je nevyhnutné disponovať vhodnými analytickými metódami aj v procese zabezpečovania ich kontroly kvality. Medzi štandardné a rutinne aplikované analytické prístupy pre potreby identifikácie a kvantifikácie daných liečiv vo vzorkách farmaceutického aj biologického charakteru patria chromatografické techniky (kvapalinová a plynová chromatografia) v spojení s rôznymi typmi detekcie^10–19). Je tomu tak z dôvodu ich kváziuniverzality, vysokej presnosti, správnosti, robustnosti, schopnosti analýzy širokého spektra zlúčenín a relatívnej jednoduchosti obsluhy²⁰⁾.

Avšak v súčasnosti sa začínajú čoraz častejšie v oblasti analýzy farmaceutických a klinických vzoriek presadzovať techniky kapilárnej elektroforézy (CE), ktoré v porovnaní so štandardnými chromatografickými prístupmi prinášajú značné výhody^{21, 22)}. Sú nimi napr. vysoká separačná účinnosť, relatívne krátky čas analýz, jednoduchosť prevedenia, spotreba minimálneho množstva vzorky a organických rozpúšťadiel a minimálna až absentujúca potreba rozsiahlej externej predúpravy vzorky^{22, 23)}.

Z hľadiska CE módov aplikovaných do prostredia analýzy tramadolu a/alebo paracetamolu vo vzorkách farmaceutického a/alebo biologického charakteru v doteraz publikovaných vedeckých prácach zaujíma dominantné postavenie kapilárna zónová elektroforéza (CZE). Tramadol bol vo vzorkách liekových foriem alebo modelových vodných vzorkách analyzovaný CZE v spojení s detekciou na báze DAD^{24, 25)}, laserom indukovanej fluorescencie (LIF)²⁶⁾, vodivostnej – C⁴D²⁷) alebo elektrochemiluminiscenčnej detekcie²⁸⁾. Jedna z prác naviac popisuje využitie CE realizovanej v nevodnom prostredí²⁵⁾. Zmienenými prístupmi bolo možné dosiahnuť hodnoty medze dôkazu (LOD) na úrovni 0,008 – 2,05 μg/ml.

Rovnako v prípade analýzy paracetamolu vo vzorkách farmaceutického charakteru bola preferovaným separačným módom CZE^29–36), použitá však bola i micelárna elektrokinetická chromatografia – MEKC³⁷⁾. CE v spojení s UV^29–32), DAD³³⁾, MS³⁴⁾, C4D^{27, 35)} alebo chemiluminiscenčnou³⁶⁾ detekciou poskytovala hodnoty LOD na úrovni 0,085 ng/ml až 5,0 μg/ml. Pri analýze paracetamolu vo farmaceutických vzorkách bola využitá aj metóda CZE s ampérometrickou detekciou v prevedení na mikročipe38). V prípade vzoriek farmaceutického charakteru je dôležité podotknúť, že žiadna z vyššie uvedených metód nevyžadovala extenzívnu predúpravu vzorky.

Z doteraz publikovaných štúdií zameraných na bioanalýzu tramadolu a paracetamolu vyplýva, že preferovanými matricami boli biologické vzorky moču^{8, 34, 36, 39–44)}, plazmy³⁸⁾ a krvného séra^{39, 45, 46)}. Testované však boli i vzorky slín4⁷⁾ alebo pečeňového a obličkového tkaniva⁴⁸⁾. Popísané boli CZE metódy s UV^{39–41, 45–49)}, MS^{8, 34, 39, 50)}, elektrochemiluminiscenčnou^{42, 43)} alebo chemiluminiscenčnou³⁶⁾ detekciou. Pre biologickú matricu moču sa hodnoty LOD pohybovali na úrovni 0,004 – 0,1 μg/ml pre tramadol a na úrovni 0,085 ng/ml až 5,2 μg/ml pre paracetamol. Hodnoty LOD pre tramadol a paracetamol v krvnej plazme a sére boli 0,1 μg/ml (tramadol) a 0,3 – 5,2 μg/ml (paracetamol). Drvivá väčšina vyvinutých metód vyžadovala pomerne rozsiahlejšiu a viackrokovú predúpravu vzorky, ktorá zahŕňala napr. extrakciu na tuhej fáze – SPE^{41, 44)}, mikrodialýzu⁴⁹⁾, elektromembránovú extrakciu – EME⁴⁰⁾, mikroextrakciu na kvapalnej fáze – LPME⁴⁴⁾, extrakciu podporenú mikrovlnným žiarením – MAE⁵⁰⁾, precipitáciu proteínov a následnú centrifugáciu^{38, 45, 47)}.

Z doteraz publikovaných prác vyplýva, že na separáciu tramadolu a paracetamolu v CZE móde sú zvyčajne používané konvenčné základné elektrolyty (BGE) reprezentované prevažne fosfátovými^{28, 30–33, 37, 40, 42, 43}) alebo borátovými^{24, 26, 29, 36, 39, 46, 48)} tlmivými roztokmi. Výber BGE je však vo veľkej miere determinovaný použitou detekčnou technikou. Elektrolytové systémy vhodné pre CZE-UV sú častokrát nevhodné pre CZE-MS. Cieľom predkladanej práce bol preto vývoj relatívne rýchlej a jednoduchej CZE-UV metódy pre potreby simultánneho hodnotenia tramadolu a paracetamolu vo vzorkách farmaceutického a biologického charakteru, ktorá by súčasne poskytovala z hľadiska zloženia BGE vysokú mieru kompatibility s MS detekciou. Takéto prístupy k analýze liečiv v rozličných typoch matríc sú zaujímavé z hľadiska kontroly kvality liečiv a liekov, a súčasne i z hľadiska bioanalytických aplikácií.

Pokusná časť

Inštrumentácia

Elektroforetické experimenty boli prevedené s použitím systému Agilent 7100 CE vybaveného UV detektorom (Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA). Separácia bola realizovaná v kremennej kapiláre s vnútorným priemerom 50 μm, vonkajším priemerom 300 μm, celkovou dĺžkou 70 cm a efektívnou dĺžkou kapiláry 62,5 cm. Pred prvým použitím bola kapilára premytá roztokom 1 M NaOH po dobu 30 minút, demineralizovanou vodou (10 minút) a nosným elektrolytom – BGE (10 minút). Každý deň pred začiatkom meraní bola kapilára preplachovaná 0,1 M NaOH 10 minút, demineralizovanou vodou 10 minút a BGE 10 minút. Na konci každého dňa sa kapilára prepláchla demineralizovanou vodou po dobu 10 minút. Vzorky boli injektované do kapiláry hydrodynamicky tlakom 50 mbar počas 10 sekúnd. Separácia bola prevedená v móde pozitívnej polarity aplikáciou napätia o hodnote +20 kV, ktoré sa zvyšovalo na začiatku separácie z 0 kV na +20 kV po dobu 20 sekúnd. Pred každým injektovaním vzorky bola kapilára prekondiciovaná aplikáciou negatívneho napätia –25 kV počas 15 sekúnd s následným premytím nosným elektrolytom 1 minútu, aby sa predišlo „carry-over“ efektu. Merania boli realizované pri teplote 20 °C a detekcia bola uskutočnená pri vlnovej dĺžke 200 nm.

Chemikálie a vzorky

Štandardy analytickej čistoty – hydrochlorid tramadolu a paracetamol – boli získané od spoločnosti Zentiva (Praha, Česká republika). Chemikálie použité na prípravu elektrolytových systémov uhličitan amónny ((NH₄)₂CO₃) a hydrogenuhličitan amónny (NH₄HCO₃) disponovali LC-MS čistotou a boli zakúpené od spoločností Merck (Darmstadt, Nemecko) a Sigma Aldrich (Steinheim, Nemecko). Všetky roztoky štandardov liečiv aj roztoky elektrolytov boli pripravované s použitím demineralizovanej vody, ktorá bola získaná purifikačným systémom Millipore Simplicity 185 (UV) (Millipore, Molsheim, Francúzsko). Všetky zásobné roztoky štandardov a elektrolytov boli skladované pri teplote 2–8 °C.

Vzorky liekových foriem Doreta (tbl), Zaldiar (tbl) a Tramabene (gtt) boli získané z miestnej lekárne. Príslušné lieky boli po dobe expirácie a boli k dispozícii v našom laboratóriu.

Príprava roztokov štandardov

Zásobné roztoky štandardov dvojice liečiv tramadolu a pracetamolu boli pripravené rozpustením 10 mg štandardu tramadolu v 10 ml demineralizovanej vody a rozpustením 10 mg štandardu paracetamolu v zmesi 5 ml metanolu s 5 ml demineralizovanej vody. Kalibračné roztoky štandardov boli pripravené zriedením zásobných roztokov štandardov na požadované koncentračné úrovne 5, 10, 20, 50 a 100 μg/ml tramadolu a paracetamolu pridaním demineralizovanej vody. Vzorky boli premeriavané 3-krát.

Biologická vzorka moču, ktorá bola získaná od dvoch zdravých dobrovoľníkov, nebola nijakým spôsobom predupravovaná, iba zriedená 5-krát pridaním demineralizovanej vody. Do zriedeného moču sa pridali alikvótne množstvá štandardov tramadolu a paracetamolu tak, aby boli dosiahnuté požadované kalibračné koncentrácie na úrovni 5, 10, 20, 50 a 100 μg/ml. Vzorky boli premeriavané 3-krát.

Príprava farmaceutických vzoriek liekových foriem

Vzorky tabliet liekov Doreta a Zaldiar boli upravené nasledovným postupom pre oba lieky. Päť tabliet sa odvážilo, následne rozdrvilo v mažiari a navážila sa priemerná hodnota hmotnosti jednej tablety, ktorá sa rozpustila v 100 ml demineralizovanej vody. Takto pripravený roztok sa dal na 45 minút do ultrazvukového kúpeľa a následne bol prefiltrovaný použitím filtračného papiera Whatman s veľkosťou pórov 11 μm (Sigma Aldrich). Zásobné roztoky liekových foriem boli pred injektovaním do CE-UV zriedené na požadovanú koncentráciu použitím demineralizovanej vody.

Pri príprave vzoriek lieku Tramabene (gtt) bol 1 ml kvapiek doplnený na objem 10 ml použitím demineralizovanej vody. Takto pripravený roztok sa následne zriedil demineralizovanou vodou na požadovanú koncentráciu a bol injektovaný do CE-UV analyzátora. Vzorky všetkých liekových foriem boli premeriavané 3-krát.

Príprava vzoriek liekových foriem na hodnotenie výťažnosti

Pri hodnotení výťažnosti liekových foriem sa využila metóda štandardného prídavku. Do pripravených roztokov reálnych matríc liekových foriem sa pridali štandardy tramadolu a paracetamolu na troch koncentračných úrovniach, a to 5, 10 a 20 μg/ml. Pripravili sa aj individuálne vzorky liekových foriem bez prídavku, ktoré slúžili ako porovnávací štandard. Všetky vzorky sa premerali 3-krát.

Príprava QC vzoriek

QC vzorky boli pripravené na troch koncentračných úrovniach, a to 5 μg/ml (nízka), 15 μg/ml (stredná) a 70 μg/ml (vysoká) pridaním štandardov tramadolu a paracetamolu do moču 5-krát zriedeného demineralizovanou vodou. Vzorky boli zhomogenizované a injektované do CE analyzátora. Každá koncentračná úroveň bola premeraná 3-krát.

Výsledky a diskusia

Optimalizácia CZE-UV metódy

Medzi najdôležitejšie optimalizačné aspekty pri vývoji CE metód patrí výber vhodného zloženia BGE, voľba separačného napätia a vlnovej dĺžky, pri ktorej je analýza realizovaná. Nosný elektrolyt je esenciálne zvoliť tak, aby bola zabezpečená adekvátna separačná účinnosť a minimalizácia negatívnych disperzných javov. Testované boli dva typy elektrolytových systémov, a to (NH₄)₂CO₃ a NH₄HCO₃, na troch koncentračných úrovniach (10, 20 a 50 mM). Dané testované systémy pritom predstavujú bežne odporúčané separačné prostredie kompatibilné s MS detekciou51), čo vytvára dobrý predpoklad pre budúce spojenie navrhovanej metódy s takýmto pokročilým typom detekcie. Jednotlivé výsledky z optimalizačného procesu výberu BGE názorne približuje obrázok 1.

Z dvojice testovaných elektrolytov sa z hľadiska migračných časov, rozlíšenia, tvaru a intenzity píkov ako vhodnejší ukázal byť elektrolyt zložený z (NH₄)₂CO₃. Optimalizačný proces preukázal, že zvyšovanie koncentrácie BGE viedlo k predlžovaniu migračných časov jednotlivých analytov. Na druhej strane sa však zvyšovalo rozlíšenie medzi jednotlivými analytmi, symetria píkov a separačná účinnosť. Vyššie koncentrácie BGE zároveň minimalizovali mieru chvostovania píkov analytov. Ako je možné vidieť na obrázku 1, paracetamol pri nižších koncentráciách BGE migroval veľmi blízko elektroosmotického toku, čo by v konečnom dôsledku spôsobovalo výrazné skreslenie a zvýšenú variabilitu výsledkov. V zmysle daných skutočností sa ako optimálny ukázal byť elektrolytový systém tvorený 50 mM (NH₄)₂CO₃ (pH 9,23).

Detekcia pomocou UV bola optimalizovaná porovnaním analytických signálov tramadolu a paracetamolu pri vlnových dĺžkach 200, 210, 220, 254 a 272 nm. Ako vhodný kompromis pre simultánnu detekciu tramadolu a paracetamolu bola nakoniec zvolená vlnová dĺžka 200 nm.

Validácia

Vyvinutá CZE-UV metóda bola validovaná na základe odporúčaní dvojice smerníc – ICH Q2(R1)⁵²⁾ a US FDA⁵³⁾, a to v závislosti od typu analyzovaných vzoriek. Smernica ICH Q2(R1) bola využitá pri validácii metódy pre analýzu liekových foriem a FDA smernica bola využitá pri validácii metódy pre analýzu biologickej matrice moču. Medzi základné hodnotené parametre v procese validácie patrí linearita, medza dôkazu (LOD – limit of detection), dolná medza stanovenia (LLOQ – lower limit of quantification), presnosť, správnosť, selektivita alebo robustnosť metódy. Prehľad základných validačných a operačných parametrov CZE-UV metódy je prehľadne zosumarizovaný v tabuľke 1.

Selektivita sa radí medzi dôležité validačné parametre a predstavuje schopnosť jednoznačne určiť sledovaný analyt aj v prítomnosti iných možných zložiek, ktoré sú súčasťou matrice. Ako dokumentuje obrázok 2, tak v priebehu analýz nedochádzalo k žiadnym interferenciám medzi migračnými časmi sledovaných analytov a ostatných zložiek matrice.

Linearita bola hodnotená na základe meraní zmesi štandardov tramadolu a paracetamolu na koncentračných hladinách 5, 10, 20, 50 a 100 μg/ml. Vyhotovením kalibračných kriviek, ktoré predstavujú závislosť plochy píku od koncentrácie štandardu, sme získali údaje o kalibračných rovniciach a hodnote koeficientu stanovenia (r2), ktorá bola vyššia než 0,995 pre oba analyty, čo potvrdilo akceptovateľnú mieru linearity danej metódy v testovanom rozsahu koncentrácií.

Hodnoty LOD a LLOQ boli predikované na úrovni 0,5 μg/ml a 5 μg/ml pre tramadol vo vodnej i biologickej matrici (5-krát zriedený moč), na úrovni 0,5 μg/ml a 5 μg/ml pre paracetamol vo vodnej matrici a na úrovni 0,25 μg/ml a 1 μg/ml pre paracetamol v matrici 5-krát zriedeného moču. Tieto hodnoty boli získané experimentálne premeriavaním štandardov analytov so znižujúcou sa koncentráciou v príslušných matriciach. Súčasne musela platiť podmienka ohľadne pomeru signálu a šumu (S/N), keď hodnota LOD zodpovedá 3xS/N a hodnota LLOQ zodpovedá 5xS/N. Získané hodnoty LOD a LLOQ boli naviac postačujúce pre potreby aplikácie vyvinutej metódy na analýzu farmaceutických vzoriek aj biologických vzoriek moču. Vyvinutá metóda navyše disponovala mimoriadne vysokou separačnou účinnosťou, keď počet teoretických priehradiek presahoval hodnotu 550 000.

Hodnotenie presnosti a správnosti metódy v prípade vzoriek farmaceutického charakteru bolo realizované na základe odporúčaní smernice ICH Q2(R1)⁵²⁾ analýzou piatich koncentračných hladín od 5 do 100 μg/ml pre tramadol aj paracetamol. Vnútrodňová presnosť bola vyhodnotená trojnásobným premeraním vzoriek v rámci jedného dňa a medzidňová presnosť bola vyhodnotená trojnásobným premeriavaním vzoriek po dobu 3 dní. Výsledky sú zosumarizované v tabuľke 2 a na základe získaných údajov môžeme povedať, že metóda je dostatočne presná, lebo hodnoty RSD (relatívnej štandardnej odchýlky) a RE (relatívnej chyby) neprekročili odchýlky ±15%, ktoré predpisuje i smernica FDA⁵³⁾.

Výťažnosť metódy sa hodnotila metódou štandardných prídavkov štandardov tramadolu a paracetamolu k reálnym matriciam farmaceutických vzoriek. Prídavky boli na troch koncentračných úrovniach, a to 5, 10 a 20 μg/ml. Vzorky sa premerali trikrát a súčasne sa premerala aj vzorka bez prídavku, ktorá slúžila ako porovnávací štandard. Výťažnosť sa následne vypočítala vzťahom: výťažnosť(%) = 100 × [c(matrica+prídavok) – c(matrica)]/c(prídavok). Jednotlivé hodnoty výťažností pre tramadol a paracetamol sú uvedené v tabuľke 3.

Podobná validačná schéma sa aplikovala aj na vzorky biologickej matrice 5-krát zriedeného moču, kde sa postupovalo na základe odporúčaní smernice FDA pre vývoj bioanalytických metód53). Bioanalytické metódy sa zvyčajne validujú použitím špecifických vzoriek kontroly kvality (QC – quality control) na troch koncentračných úrovniach – nízkej, strednej a vysokej. Príslušné koncentrácie QC vzoriek boli zvolené na základe odporúčaní smernice FDA, ktorá preferuje ich výber tak, aby spadali do definovaného rozsahu kalibračnej krivky. Príprava takýchto vzoriek, ktoré boli použité pre potreby validácie vyvinutej CZE-UV metódy, je detailne popísaná v časti Príprava QC vzoriek.

Presnosť a správnosť CZE-UV metódy (tab. 4) bola hodnotená na základe vnútrodňovej a medzidňovej presnosti s použitím QC vzoriek 5-krát zriedeného moču s prídavkom štandardov tramadolu a paracetamolu na troch koncentračných hladinách, a to 5 μg/ml (nízka QC), 15 μg/ml (stredná QC) a 70 μg/ml (vysoká QC). Vnútrodňová presnosť bola na úrovni 0,7 – 5,0 % pre tramadol a na úrovni 3,6 – 12,1 % pre paracetamol. Medzidňová presnosť sa pohybovala na úrovni 3,4 – 13,8 % pre tramadol a 4,0 – 13,9 % pre paracetamol. V oboch prípadoch dosiahnuté hodnoty nepresahovali smernicou stanovenú hodnotu ±15 %, resp. ±20 % v prípade QC vzoriek zodpovedajúcich koncentračnej úrovni LLOQ.

Výsledky zosumarizované v tabuľke 5 taktiež hovoria o akceptovateľnej miere správnosti vyvinutej metódy, keďže výťažnosť sa pohybovala na úrovni 99,4 – 101,5 % pre tramadol a 103,7 – 105,7 % pre paracetamol.

Stabilita analytov bola testovaná na ich QC vzorkách krátkodobými stabilitnými štúdiami založenými na ponechaní vzoriek po dobu 24 h v autosampleri (stabilita v autosampleri) a opakovanom zmrazení a rozmrazení (tri cykly) testovaných vzoriek („freeze-to-thaw“ stabilita). Na základe dosiahnutých výsledkov, ktoré sú prehľadne zosumarizované v tabuľke 5, možno potvrdiť akceptovateľnú mieru stability v oboch prípadoch testovacích podmienok, keďže hodnoty RE (%) nepresiahli smernicou požadovaných ±15 %.

V poslednej fáze validačných štúdií sme sa zamerali na testovanie robustnosti vyvinutej CZE-UV metódy, ktoré zahŕňalo sledovanie vplyvu malých zmien separačných podmienok na analytický signál tramadolu a paracetamolu. Testovaným vplyvom bola zmena koncentrácie BGE o ±1 mM. Dosiahnuté výsledky potvrdili adekvátnu robustnosť, keďže odchýlky plôch sledovaných analytov v porovnaní s originálnymi podmienkami neprekročili hodnoty 1,9 % (paracetamol), resp. 3,8 % (tramadol).

Aplikácia

Po procese validácie bola CZE-UV metóda aplikovaná na stanovenie obsahu liečiv tramadol a paracetamol v liekoch Doreta, Zaldiar a Tramabene. Všetky analyzované lieky boli po exspirácii, čiže očakávaný obsah liečiv by mal byť nižší, než je deklarovaný obsah, keďže liečivá podliehajú časom prirodzenému rozkladu. Výsledky analýz (tab. 6) potvrdili správnosť nášho predpokladu, keďže v tabletových liekových formách bol obsah tramadolu nižší o 8,8 % (Doreta), resp. 9,9 % (Zaldiar) a paracetamolu nižší o 0,1 % (Zaldiar), resp. 5,9 % (Doreta) v porovnaní s deklarovaným obsahom. Najvýraznejší pokles v obsahu tramadolu bol identifikovaný v lieku Tramabene, a to až o 26,5 % v porovnaní s výrobcom deklarovaným obsahom. Z daných výsledkov možno usudzovať, že jednotlivé liečivá vykazujú vyššiu mieru stability v tuhých liekových formách (lieky Doreta, Zaldiar) v porovnaní s liekovými formami kvapalnými (liek Tramabene). Zároveň tramadol vykazoval nižšiu dlhodobú stabilitu než paracetamol. Bolo preukázané, že čas je výrazným faktorom ovplyvňujúcim stabilitu liečiv (čas, ktorý prešiel od dátumu exspirácie, bol najdlhší v prípade lieku Tramabene – 9 rokov). Ilustratívny záznam z analýzy tramadolu a paracetamolu v lieku Doreta je znázornený na obrázku 2a.

Bioanalytický aplikačný potenciál vyvinutej CZEUV metódy pre potreby stanovenia tramadolu a paracetamolu v biologickej matrici moču bol overený zaslepenou štúdiou. Pracovníci laboratória pripravili tri zaslepené vzorky pridaním štandardov tramadolu a paracetamolu do 5-krát zriedenej biologickej matrice moču na rôznych koncentračných úrovniach v rámci kalibračného rozsahu, pričom pracovníci realizujúci meranie nevedeli, aké koncentrácie daných liečiv boli pridané do matrice moču. Výsledky z daných experimentov sú predmetom tabuľky 6 a ilustratívny záznam získaný z merania takejto zaslepenej vzorky je znázornený na obrázku 2b. Dosiahnuté výsledky po porovnaní s odslepenými koncentračnými hladinami pridanými do biologickej matrice moču preukázali aplikovateľnosť vyvinutej CZE-UV metódy v oblasti bioanalýzy.

Záver

Hlavným zámerom práce bol vývoj a validácia metódy CZE v spojení s UV detekciou pre potreby simultánneho stanovenia tramadolu a paracetamolu vo vzorkách farmaceutického (liekové formy) a biologického (moč) charakteru. Takáto metóda bola charakterizovaná výraznými výhodami, ako je napr. vysoká miera selektivity, relatívne krátky čas analýzy (celkový čas analýzy bol 15 minút), nízka spotreba vzoriek, rozpúšťadiel a chemikálií, z čoho pramení aj nízke ekonomické zaťaženie analýz. Signifikantným benefitom je aj absencia potreby extenzívnej predúpravy vzoriek (predovšetkým biologických). Pridanou hodnotou práce je i to, že separačným prostredím bol elektrolytový systém odporúčaný predovšetkým pre prevedenie CE analýz s MS detekciou. Tento fakt umocňuje potenciál budúceho prenesenia metódy do prostredia CE-MS bez akýchkoľvek ťažkostí. Dosiahnuté validačné parametre a následné aplikačné príklady preukázali, že nami vyvinutá metóda disponuje možnosťou byť implementovaná do prostredia kontroly kvality liečiv a liekov, resp. klinických aplikácií.

Etická komisia

Štúdia realizovaná na biologických vzorkách bola schválená Etickou komisiou Farmaceutickej fakulty Univerzity Komenského (stanovisko 05/2021 vydané dňa 15. 12. 2021).

Poďakovanie

Práca vznikla s podporou grantov APVV-15-0585, VEGA 1/0463/18 a KEGA 027UK-4/2020.

Stret záujmov: žiadny.

Došlo 9. januára 2022 / Prijato 24. februára 2022

A. Horniaková • O. Štefánik • I. Čižmárová • M. Matušková

Katedra farmaceutickej analýzy a nukleárnej farmácie FaF UK

Bratislava, SR 

P. Mikuš^1,2, PharmDr. Juraj Piešťanský, PhD.^1,2 

¹Katedra farmaceutickej analýzy a nukleárnej farmácie

Farmaceutická fakulta Univerzity Komenského

Odbojárov 10, 832 32 Bratislava, SR

e-mail: piestansky@fpharm.uniba.sk

²Toxikologické a antidopingové centrum FaF UK, Bratislava, SR