Význam S100A4 proteinu v patogenezi revmatoidní artritidy

Souhrn

S100A4 patří do proteinové rodiny „S100“, která zahrnuje více než 25 nízkomolekulárních proteinů podílejících se na regulaci řady buněčných procesů. S100A4 se účastní regulace buněčné motility, proliferace, apoptózy, angiogeneze a remodelace extracelulární matrix. Funkce S100A4 je spojována s metastazováním a tento protein je navíc považován za významný prognostický marker některých nádorových onemocnění. Jeho přítomnost byla nově zjištěna také v proliferujících synoviálních fibroblastech u revmatoidní artritidy (RA). Zvýšená exprese S100A4 proteinu byla potvrzena také v synoviální tkáni pacientů s RA ve srovnání s kontrolní a artrotickou synoviální tkání. Protein byl v synoviální tkáni exprimován i v místech destrukce kloubní chrupavky. S100A4 je tvořen nejen synoviálními fibroblasty, ale i buňkami imunitního systému a endoteliálními buňkami cév. U RA byla zjištěna zvýšená koncentrace bioaktivního oligomeru S100A4 nejen lokálně v zánětlivé tkáni, ale také v plazmě a synoviální tekutině. U synoviálních fibroblastů byl podobně jako u tumorů pozorován vliv oligomeru S100A4 na produkci enzymů degradujících matrix – metaloproteináz a vliv na biologickou funkci tumor supresorového proteinu p53. Ze současných znalostí lze předpokládat, že zvýšené hladiny S100A4 mohou ovlivňovat agresivní chování fibroblastů a celkově tak mohou přispívat k patogenezi chronických autoimunitních zánětlivých onemocnění.

Klíčová slova:
revmatoidní artritida, S100A4, apoptóza, enzymy degradující matrix, synoviální fibroblasty

Úvod

S100 rodina je tvořena více než 25 nízkomolekulárními kyselými proteiny o molekulové hmotnosti 10–12 kDa. Poprvé byly identifikovány a popsány v hovězím mozku a na základě rozpustnosti ve 100% roztoku amonium sulfátu označeny jako S100 (1). Charakteristickým znakem S100 proteinů jsou dva strukturální motivy, tzv. EF- vazebné domény, které s různou afinitou váží kalcium (2). Vazba kalcia vede ke strukturálním změnám, díky nímž mohou S100 proteiny navázat cílovou molekulu (3). Vedle kalcia jsou to také ionty zinku a mědi, které svou vazbou ovlivňují strukturu a působení některých S100 proteinů (4).

S100 proteiny vykazují své biologické funkce jak v intracelulárním prostředí, tak extracelulárně. Zatímco uvnitř buněk jsou v převážné většině přítomny ve formě homodimerů a heterodimerů, v podmínkách extracelulárního prostředí se vyskytují jako oligomery nebo multimery. Popsány byly např. heterotetramery proteinů S100A8/S100A9 (5, 6), hexamery S100A12 proteinu (5, 7) nebo tetra- a multimery S100A4 proteinu (8). Většina S100 proteinů se vyskytuje intracelulárně a podílí se na regulaci řady buněčných procesů, mezi něž patří např. proliferace, apoptóza, buněčná motilita a remodelace extracelulární matrix (9). S100 proteiny uvolněné do extracelulárního prostředí se svým chováním podobají cytokinům. Některé z nich se účastní regulace buněčných dějů prostřednictvím receptoru RAGE (10, 11), avšak v současnosti se stávají předmětem výzkumu i další receptory, u kterých se předpokládá možná asociace s některými S100 proteiny (12).

Modifikovaná exprese S100 proteinů byla dokumentována u mnoha onemocnění jako jsou neurodegenerativní a kardiovaskulární onemocnění, zánětlivá onemocnění, diabetes mellitus, alergie či tumory (9). Ze všech dosud známých S100 proteinů tvoří poměrně velkou skupinu proteiny, jejichž zvýšená exprese je spojována s řadou nádorových onemocnění (S100A1, S100A4, S100A6, S100A7 a S100B). Kromě této skupiny byla uvnitř S100 rodiny identifikována trojice proteinů charakteristická účastí při aktivaci zánětu a imunitního procesu (S100A8, S100A9 a S100A12). Obecně se předpokládá, že v průběhu nádorového bujení hraje podstatnou úlohu aktivace zánětlivých buněk a imunitního systému (13). Z prací zabývajících se výzkumem S100 proteinů lze usuzovat, že tyto proteiny by mohly tvořit určitý spojovací článek mezi chronickým zánětem a tumory. Důkazem je např. S100A4 protein, který byl donedávna spojován pouze s některými nádory (14–16). Nejnovější poznatky však prokázaly jeho zvýšenou expresi u revmatoidní artritidy a vztah k patogenezi této chronické autoimunitní choroby (8, 17, 18). Cílem této práce je shrnout a diskutovat současné poznatky o S100A4 proteinu ve vztahu k tumorům a zánětu.

Obecná charakteristika S100A4 proteinu

S100A4 (metastasin, pEL, p9Ka, FspI, CAPL, calvasculin) je termolabilní kyselý protein o molekulové hmotnosti 11-kD původně izolovaný u myší jako gen tvořený metastatickými buňkami adenokarcinomu mléčné žlázy (19). Přítomnost S100A4 byla potvrzena v zanedbatelném množství také ve zdravé tkáni, avšak jeho fyziologická funkce nebyla dosud plně objasněna (20, 21).

U myší je známo, že intracelulární S100A4 může být tvořen buňkami hladkých svalů, epiteliálními buňkami, endoteliálními buňkami krevních cév, hnědou tukovou tkání, buňkami jater, parietálními buňkami žaludku, neurony a některými imunitními buňkami ve slezině, brzlíku a kostní dřeni (21, 22). Bylo zjištěno, že S100A4 je tvořen makrofágy, dendritickými buňkami, žírnými buňkami (mastocyty), neutrofily, určitými typy T-lymfocytů, pericyty a také synoviálními fibroblasty ve stadiu chronického zánětu (8). Funkční protein může vytvářet homodimery (S100A4/S100A4), heterodimery (S100A4/S100A1) a nebo oligomery či multimery (24, 25). Regulace buněčných procesů se účastní prostřednictvím vazby na cílové molekuly jako jsou nesvalový myosin II (26) a liprin β1 (27), které hrají důležitou roli v buněčné adhezi a motilitě. Neméně významná je vazba S100A4 na tumor supresorový protein p53 a následná regulace programované buněčné smrti – apoptózy (20, 26, 28, 29). Dále byl prokázán vliv extracelulárního S100A4 na angiogenezi (32) a na produkci proteolytických enzymů, které se podílejí na remodelaci extracelulární matrix (18, 33). Extracelulární S100A4 může stimulovat růst neuritu primárních hipokampálních neuronů (30) a migraci astrocytických tumorových buněk (31). Byla pozorována také negativní regulace mineralizace extracelulární matrix (34).

Význam S100A4 ve vztahu k nádorovým onemocněním

Tvorba tumorů a šíření metastáz je rozsáhlý a komplexní proces, kterého se účastní množství regulačních molekul. Jednou z nich je S100A4 protein, jehož vztah k metastázám a tumorům byl podrobně studován jak u transgenních myší (16), tak u člověka (14, 15).

Intracelulární S100A4 se váže na cytoskeletální struktury a reguluje tak motilitu nádorových buněk. U metastatických buněk bylo zjištěno, že interakce S100A4 s těžkým řetězcem nesvalového myosinu vede ke změnám dynamiky myosinu (35, 36). Podobně, interakce mezi S100A4 a nesvalovým tropomyosinem má za následek rozklad aktinových filament (20).

Dalším předpokladem pro tvorbu metastáz je oddělení buněk z nádoru, vstup do krevního řečiště a adheze k okolním buňkám a matrix. To se děje za účasti adhezivních molekul jako jsou například laminin a E-cadherin. U myších i lidských tumorů byla prokázána inverzní korelace mezi expresí S100A4 a transmembránovým glykoproteinem E-cadherinem. Bylo zjištěno, že invazivní chování nádorových buněk exprimujících S100A4 by mohlo být navozeno utlumením exprese E-cadherinu (37, 38). In vivo pokusy odhalily specifickou vazbu S100A4 na transmembránový protein liprin β1, který je jedním z článků signální kaskády regulující buněčnou adhezi (27).

Podrobně studován byl také vztah mezi S100A4 a tumor supresorovým proteinem p53, jenž je považován za jeden z nejvýznamnějších faktorů regulujících buněčný cyklus. Narozdíl od normálního (wild) typu p53, jehož množství je v nemutovaných buňkách nízké, dochází v transformovaných a nádorových buňkách k jeho signifikantnímu nárůstu.V buňkách exprimujících S100A4 bylo zjištěno zvýšené množství proteinu p53 (39). Experimenty na buněčných liniích produkujících normální protein p53 ukázaly, že indukce S100A4 v těchto buněčných liniích má vliv na expresi genů regulovaných p53 proteinem, jako jsou například p21/WAF a bax (28). Zvýšení apoptózy vlivem vazby proteinu S100A4 na p53 může vést ke ztrátě funkce normálního typu p53, což se může projevit nadbytkem mutovaného p53 a vývojem agresivního buněčného fenotypu v počátcích nádorové progrese (28). U myší s inaktivovaným genem pro S100A4, které byly vystaveny gama záření, byla pozorována redukce apoptózy (40). Experimenty na myších tumorech prokázaly pozitivní vliv extracelulárního S100A4 na přežívání nádorových buněk způsobené snížením exprese bax. Nebyl potvrzen rozdílný efekt dimerů a oligomerů S100A4 na expresi bax a překvapivě nebyl pozorován žádný vliv S100A4 na expresi p21/waf (41).

Další podmínkou pro růst nádoru a metastazování je angiogeneze. Ta je ovlivňována S100A4 proteinem prostřednictvím regulace exprese trombospondinu 1 (42) a enzymů degradujících matrix – např. MMPs (28, 33, 41, 43). Experimenty založené na stimulaci endotelových buněk oligomerní formou S100A4 proteinu odhalily sníženou expresi genu pro trombospondin 1 (28, 41). Pokusy in vitro dále ukázaly, že S100A4 oligomer indukuje chemotaktickou motilitu endotelových buněk a tak může přispívat k angiogenezi. In vivo indukuje S100A4 neovaskularizaci rohovky (41). Vztah S100A4 k MMPs byl potvrzen u endoteliálních buněk, u nichž byla po stimulaci extracelulárním S100A4 detekována zvýšená exprese MMP-13. Naopak snížení hladiny mRNA MMP-2, MMP-14 a TIMP-1 následovalo po snížení exprese S100A4 u buněčné linie metastazujících buněk (44). Podobné výsledky byly dokumentovány i pro MMP-9 (45). Poznatky o roli S100A4 v progresi nádorových onemocnění nashromážděné za poslední desetiletí dokazují, že S100A4 má nezanedbatelný podíl na agresivním a invazivním chování nádorových buněk a tvorbě metastáz (46).

Význam S100A4 v patogenezi revmatoidní artritidy

Revmatoidní artritida (RA) je chronické zánětlivé onemocnění, charakterizované infiltrací kloubní tkáně zánětlivými buňkami, hypertrofií synoviální membrány a progresivními erozemi kostí a chrupavky. Přehledné práce z poslední doby shrnují význam synoviálních fibroblastů v patogenezi RA (47, 48).

U proliferujících synoviálních fibroblastů od pacientů s RA byla prokázána zvýšená exprese některých genů, mimo jiné i S100A4 (49). Narozdíl od zdravé kontrolní tkáně byla S100A4 mRNA zjištěna v RA synoviální tkáni. S100A4 mRNA byla exprimována v intersticiu i povrchové synoviální intimně. Nám se podařilo prokázat zvýšené množství S100A4 proteinu v synoviální tkáni, ale také v synoviální tekutině i plazmě pacientů s RA oproti jedincům s osteoartrózou (8, 18) (obr. 1). Odlišnosti byly zjištěny také ve formě S100A4 vyskytujícího se v plazmě a synoviální tekutině. Zatímco u pacientů s RA byl S100A4 přítomen ve formě bioaktivních oligomerů, u pacientů s OA se většina S100A4 vyskytovala ve formě dimerů. Narozdíl od některých dalších S100 proteinů aktivně se účastnících zánětlivých procesů (S100A7, S100A8, S100A9 a S100A12) je S100A4 exprimován většinou buněk synoviální tkáně – synoviálními fibroblasty, imunitními buňkami i buňkami cévního endotelu.

U synoviálních fibroblastů, podobně jako u buněk nádorového typu, stimuluje extracelulární S100A4 tvorbu některých MMPs. Zvýšená exprese byla potvrzena pro MMP-1, MMP-3, MMP-9 a MMP-13 (18). V místech RA synoviální tkáně byla pozorována zvýšená exprese proteinu p53 oproti OA synoviální tkáni (8). Extracelulární S100A4 oligomer navodil stabilizaci tumor supresorového proteinu p53, jeho fosforylaci v místě aminokyseliny Ser37 a tím transkripci cílových genů proteinu p53 (bcl-2, p21/WAF a HDM2), které se podílejí na regulaci buněčné proliferace a apoptózy (8). Přesná úloha proteinu S100A4 a jeho bližší vliv na apoptózu či proliferaci buněk synoviální tkáně musí být ještě blíže prozkoumán.

Na základě současných znalostí o S100A4 a jeho vztahu k RA lze konstatovat, že se S100A4 vyskytuje ve zvýšeném množství nejen lokálně v místě zánětu, ale také systémově v krevním oběhu. S100A4 je exprimován synoviálními fibroblasty a zánětlivými buňkami v místech destrukce kloubní chrupavky, kde může fungovat jako důležitý prvek regulující buněčnou apoptózu, proliferaci a produkci MMPs (obr. 2). Jedna z nejnovějších prací zaměřených na S100A4 prokázala pomocí imunohistochemických barvení a imunoblottingu přítomnost S100A4 v artrotické chrupavce a lidských chondrocytech, zatímco u normální tkáně a buněk nebyl S100A4 přítomen. U chondrocytů bylo navíc potvrzeno, že extracelulární S100A4 stimuluje produkci MMP-13 a na přenosu signálu se účastnil receptor pro pokročilé glykační produkty (RAGE). S100A4 indukovaná aktivace RAGE měla za následek aktivaci NF-κB a produkci reaktivních kyslíkových radikálů (50).

Závěr

Za poslední desetiletí byl zaznamenán velký pokrok ve studiu biologického významu S100A4 proteinu ve vztahu k progresi nádorových onemocnění. Nejedna práce byla věnována interakcím S100A4 s jeho cílovými molekulami a následné aktivaci buněčných signálních drah ovlivňujících remodelaci extracelulární matrix, adhezivní chování a motilitu buněk, angiogenezi, buněčnou proliferaci a apoptózu.

Důležitým poznatkem bylo nalezení spojitosti mezi metastatickou aktivitou nádorových buněk a invazivním chováním synoviálních fibroblastů u RA. Podobně jako v případě nádorů byla objevena zvýšená hladina S100A4 v synoviální tkáni a tělních tekutinách u pacientů s RA. In vitro studie navíc prokázaly vliv S100A4 na zvýšenou produkci matrix degradujících enzymů a dokumentovaly ovlivnění tumor supresorového proteinu p53, což může mít významné postavení při aktivaci chronického zánětu. Pro přesné pochopení role S100A4 v zánětlivých procesech vedoucích k synoviální hyperplazii a zánětu je třeba dalších studií.

Poděkování

Tato práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR – NR/9082-4.

Mgr. Lucie Ošlejšková

Revmatologický ústav

Na Slupi 4

128 50 Praha 2

e-mail: seno@revma.cz