Exprese p53, Ki-67, bcl-2, c-erb-2, estrogenového, a progesteronového receptoru v endometriálním karcinomu

Souhrn

Cíl studie:
Zjistit pomocí imunohistochemického vyšetření expresi p53, bcl-2, c-erb-2, Ki-67, estrogenového a progesteronového receptoru u pacientek s karcinomem endometria.

Typ studie:
Experimentální studie.

Název a sídlo pracoviště:
Porodnicko-gynekologická klinika, Ústav lékařské genetiky, Ústav patologie, LF UP a FN Olomouc.

Metodika:
Studovali jsme 103 případy primárně neléčeného karcinomu endometria, u nichž jsme pomocí imunohistochemického vyšetření stanovovali přítomnost p53, bcl-2, c-erb-2, Ki-67, estrogenového a progesteronového receptoru. Stanovili jsme korelace mezi imunohistochemickým barvením zhodnoceným pomocí histoskóre, věkem, grade, hloubkou invaze, klinickým stadiem a metastatickým šířením.

Výsledky:
Průměrný věk byl 67 let (rozmezí 35-90). p53, bcl-2, c-erb-2, Ki-67, estrogenový a progesteronový receptor byly pozitivní u 49 (48 %), 81 (79 %). 18 (17 %), 99 (96 %), 73 (70 %) a 87 (84 %) pacientek. Nebyla nalezena jasná závislost mezi immunohistochemickými parametry a věkem pacientek. Zvýšená exprese p53 a Ki-67 korelovala se špatnou diferenciací, hlubokou invazí do myometria, pokročilým klinickým stadiem a metastatickým šířením. Imunohistochemické barvení pro bcl-2 korelovalo inverzně s FIGO stadiem, zatímco c-erb-2 bylo zvýšené exprimováno u nádorů s hlubokou myometrální invazí. Nádory s pozitivními estrogenovými a progesteronovými receptory vykazovaly další klinickopatologické parametry spojené s lepší prognózou.

Závěr:
Zvýšená exprese p53 a Ki-67 zřejmě indikuje malignější fenotyp, zatímco bcl-2 a c-erb-2 mohou mít do určité míry omezený význam pro identifikaci vysoce-rizikových nádorů.

Klíčová slova:
endometriální karcinom, imunohistochemie, prognostický faktor.

ÚVOD

Endometriální karcinom je nejčastějším gynekologickým zhoubným onemocněním v České republice a jeho incidence během posledních 30 let neustále roste [54] Průběh onemocnění závisí na věku při diagnóze, histologickém typu, stavu hormonálních receptorů, klinickém stadiu a dalších faktorech. Je zřejmé, že tyto údaje odrážejí složitou etiologii onemocnění, která zahrnuje jak endogenní, tak exogenní faktory [46]. I když je většina případů endometriálního karcinomu sporadickým onemocněním, některé vznikají na hereditárním podkladě (přibližně 10 %) [56]. Důležitou roli při vzniku tohoto onemocnění hrají faktory životního prostředí. Rostoucí frekvence výskytu onemocnění je často vysvětlována dietními a hormonálními vlivy a rovněž tak stárnutím ženské populace. Mezi rizikové faktory byly zařazeny nadváha, neoponovaná exogenní estrogenová terapie, diabetes mellitus a s ním spojené hormonální disbalance a syndrom polycystických ovarií [14, 39, 42, 46].

Primární léčbou je asi pro 90 % žen s endometriálním karcinomem chirurgie. Standardním výkonem, v případě proveditelnosti, je hysterektomie s oboustrannou adnexektomií [46, 52]. V mnoha studiích bylo prokázáno, že systematická pánevní lymfadenektomie zpřesňuje možnosti prognózování u pacientek [2, 32]. Na druhou stranu však bylo popsáno vyšší procento komplikací u pacientek po lymfadenektomii a její vliv na délku přežití zůstává nadále nejasný [2, 3, 53]. V řadě případů je i při lokalizovaném onemocnění průběh onemocnění velmi agresivní, a proto je docela široce používána pooperační pánevní radioterapie. Randomizované studie prokázaly lepší lokální kontrolu onemocnění po zevním ozáření, ale na druhou stranu tato léčba nepřinesla prodloužení délky přežití. Adjuvantní gestagenní léčba nepředstavovala v randomizovaných studiích žádný přínos pro pacientky [30]. Po kompletní léčbě endometriálního karcinomu je rutinně prováděna dispenzarizace, a to zejména v prvních 2-3 letech po chirurgické léčbě, kdy je diagnostikováno největší procento recidiv [36]. Někteří autoři zdůrazňují, že časná detekce recidiv zlepší šance na jejich léčbu [41]. Léčba recidiv endometriálního karcinomu je však do značné míry kontroverzní a její vliv na přežití pacientek nebyl prokázán  . Jako velmi neuspokojující se ukázala rovněž senzitivita vyšetření v rámci dispenzarizace [36].

Pro zlepšení léčby a dispenzarizace pacientek s endometriálním karcinomem byla studována řada prognostických faktorů. Identifikace vysoce rizikových skupin by umožnila konzervativní léčbu u pacientek s dobrou prognózou a rezervovat účinnou a radikálnější léčbu pro nemocné s agresivnějšími typy nádorů. Mezi tradiční prognostické faktory patří věk, parita, stadium onemocnění, histologický typ, histologický grade, hloubka myometrální invaze, DNA ploidita, vaskulární invaze a postižení lymfatických uzlin Pro zlepšení léčby a dispenzarizace pacientek s endometriálním karcinomem byla studována řada prognostických faktorů [19, 26, 46]. Identifikace vysoce rizikových skupin by umožnila konzervativní léčbu u pacientek s dobrou prognózou a rezervovat účinnou a radikálnější léčbu pro nemocné s agresivnějšími typy nádorů. Mezi tradiční prognostické faktory patří věk, parita, stadium onemocnění, histologický typ, histologický grade, hloubka myometrální invaze, DNA ploidita, vaskulární invaze a postižení lymfatických uzlin [43]. V současné době je poměrně široce akceptovaný názor, že proces kancerogeneze je mnohostupňový děj. Řada studií prokázala, že zvýšená exprese onkogenů s jejich narušenými nebo konstitutivně aktivovanými signálními kaskádami je spojená s maligní transformací [17]. Stejně tak je pro endometriální karcinom charakteristická široká škála genetických alterací. Abnormální exprese p53 tumor supresorového genu je u endometriálního karcinomu spojována s agresivními histologickými typy, pokročilým stadiem onemocnění a kratší dobou přežití [13, 27]. V některých studiích však jeho prognostický dopad nebyl nezávislý na jiných faktorech [29, 33].

Amplifikace a zvýšená exprese onkogenu HER-2/neu (někdy označovaného jako c-erb-B2) se vyskytuje ve 20 až 40 % endometriálních karcinomů a je spojována s negativními prognostickými faktory, jako je pokročilý stupeň onemocnění a nižší stupeň histologické diferenciace [55]. Negativní prognostický dopad exprese HER-2/neu byl dokumentován v některých, ale ne ve všech studiích, a tak klinické využití změn exprese tohoto faktoru zůstává dosud nejasné [29, 40]. Ztráta exprese proto-onkogenu bcl-2 je u endometriálního karcinomu spojována s horší prognózou, větší hloubkou myometriální invaze, pokročilejším stupněm onemocnění a vyšší pravděpodobností lymfatických metastáz [47]. Zvýšená proliferační kapacita je jedním ze základních rysů nádorových buněk. Většina endometroidních karcinomů exprimuje nízký proliferační index Ki-67 a má příznivou prognózu, zatímco většina serózních a „clear cell“ karcinomů má vysoký proliferační index Ki-67 a špatnou prognózu [10]. Estrogenové (ER) a progesteronové (PR) receptory jsou přítomné jak v epiteliálních, tak ve stromálních buňkách endometria. Řada studií prokázala, že přítomnost a množství těchto steroidních receptorů koreluje se stadiem nádoru, gradingem a přežitím [16, 23, 31, 32]. Je pravděpodobné, že informace získané ze změn exprese nádorových imunohistochemických markerů mohou v budoucnu přispět ke snížení radikality chirurgické a radiační terapie. Cílem naší práce bylo imunohistochemické stanovení exprese molekulárně biologických markerů a jejich korelace s klinickopatologickými prognostickými faktory endometriálního karcinomu. 

MATERIÁL A METODIKA

V období od ledna 2004 do června 2007 jsme studovali 103 případů primárně neléčeného karcinomu endometria. Biopsie endometria získané od pacientek se suspektním onemocněním byly standardně fixovány do 24 hodin ve formalínu a zataveny do parafinu a dále zpracovány pro účely histopatologického stanovení diagnózy. Při potvrzení nálezu endometriálního karcinomu byly z materiálu získané tkáňové řezy o síle 14 μm připraveny na sklíčkách povlečených Vectabondem (Vector). Pro detekci p53, bcl-2, HER-2/neu, Ki-67 (Dako, Glostrup, Dánsko), byla použita standardní nepřímá imunohistochemická technika používající biotinylované příslušné sekundární králičí nebo myší protilátky a následně streptavidinovou peroxidázu. Aktivita peroxidázy byla vizualizována diaminobenzidinem. V každé sadě vzorků byl zařazen preparát endometriální tkáně se známou imunoreaktivitou a stejně tak negativní kontrola, tzn. skla inkubovaná s tris pufrem místo příslušných protilátek. Intenzita barvení byla semikvantitativně hodnocena jako „0“ pro preparáty bez přítomného barvení, „1“ pro slabé barvení, „2“ pro středně silné barvení a „3“ pro silné barvení. Dále bylo kalkulováno „histoskóre“, tzn. (% buněk se stupněm barvení „1“x1) + (% buněk se stupněm barvení „2“x2) + (% buněk se stupněm barvení „3“x3). Současně byla vytvořena vnitřní kontrola pro intenzitu barvení „1“. Poté jsme stanovili korelace mezi imunohistochemickým barvením zhodnoceným pomocí histoskóre, věkem, grade, hloubkou invaze (M0 – bez invaze; M1 – invaze do poloviny myometria; M2 – invaze do více než poloviny myometria), a metastatickým šířením (N – metastatické šíření nepřítomno; M – metastázy přítomny). Na základě rizika recidivy byly nádory dále rozděleny do tří kategorií. Nízce rizikové nádory (low-risk: L) (stadium IA/B, grade 1/2) jsou omezeny na dělohu a invadují do méně než poloviny tloušťky myometria. Nádory středně rizikové (Intermediate-risk: I) (stadium I, G3; IC, II) jsou omezeny na dělohu a invadují do více než poloviny tloušťky myometria nebo do děložního hrdla. U vysoce rizikových nádorů (High-risk: H) (stadium III) jsou přítomny metastázy do ovarií, pochvy nebo lymfatických uzlin. Riziko recidivy je pro nízce rizikové nádory přibližně 5 %, pro středně rizikové nádory 10 % a pro vysoce rizikové nádory 14-42 % [32]. Klinickopatologické parametry byly hodnoceny na základě definitivního histopatologického vyšetření po chirurgické léčbě. 

VÝSLEDKY

Průměrný věk byl 67 let (rozmezí 35-90). U všech pacientek byla provedena abdominální hysterektomie s oboustrannou adnexektomií. Systematická pánevní lymfadenektomie byla provedena u 75 (72,5 %) rizikových pacientek.

p53, bcl-2, c-erb-2, Ki-67, estrogenový a progesteronový receptor byly pozitivní u 49 (48 %), 81 (79 %). 18 (17 %), 99 (96 %), 73 (70 %) a 87 (84 %) pacientek. Nebyla nalezena jasná závislost mezi immunohistochemickými parametry a věkem pacientek. Zvýšená exprese p53 a Ki-67 korelovala se špatnou diferenciací, hlubokou invazí do myometria, pokročilým klinickým stadiem a metastatickým šířením. Imunohistochemické barvení pro bcl-2 korelovalo inverzně s FIGO stadiem, zatímco c-erb-2 bylo zvýšeně exprimováno u nádorů s hlubokou myometriální invazí. Nádory s pozitivními estrogenovými a progesteronovými receptory vykazovaly další klinickopatologické parametry spojené s lepší prognózou (graf 1-4). Při statistickém zpracování dat byly pro zjištění vztahu mezi prognostickými faktory použity ÷² test a nepárový t-test. Hladina statistické významnosti byla stanovena pro p<0,05.  

DISKUSE

Z výsledků naší práce vyplývá korelace molekulárně biologických markerů s klinickopatologickými prognostickými faktory u  primárního karcinomu endometria. Zvýšená exprese p53 korelovala se špatnou diferenciací, hlubokou invazí do myometria, pokročilým klinickým stadiem a metastatickým šířením. Řada prací dokládá souvislost mezi zvýšenou expresí p53 a nepříznivými prognostickými faktory u žen s primárním endometriálním karcinomem [8, 10, 22, 49, 50]. Geisler et al. navíc prokázali, že p53 imunoreaktivita může predikovat rekurenci u pacientek s endometriálním karcinomem [12]. Naproti tomu Gossett et al. neprokázali v multivariabilní analýze u žádného z regulátorů buněčného cyklu (včetně p53) schopnost nezávisle předpovídat recidivu nebo smrt u pacientek s endometriálním karcinomem [15]. Nedávno Pijnenborg et al. prokázali zvýšenou expresi proteinu p53 v recidivujících nádorech, a podpořili tak hypotézu, že p53 se podílí na nádorové progresi a procesu metastazování u endometriálního karcinomu [38]. Podobný závěr předpokládají i výsledky naší práce. Bcl-2 zlepšuje přežívání buněk tím, že inhibuje programovanou buněčnou apoptózu. Předpokládá se, že zvýšená exprese bcl-2 může být časným dějem v rámci kancerogeneze některých typů nádorů [20, 51]. Dosud nebylo jednoznačně prokázáno, zda bcl-2 přispívá k maligní progresi endometriálního karcinomu. V naší práci jsme nenalezli souvislost bcl-2 exprese se stupněm diferenciace nádorů, hloubkou myometrální invaze a postižením lymfatických uzlin. V souladu s prací Ohkouchiho et al. jsme naopak prokázali postupně se snižující expresi bcl-2 s rostoucím stadiem onemocnění [35]. Mechanismus snížené exprese bcl-2 u pokročilých endometriálních karcinomů není známý. Exprese bcl-2 je alespoň částečně regulována estrogenem a p53 v několika experimentálních systémech [21, 28]. Pokročilé endometriální karcinomy jsou často spojeny se ztrátou estrogenových receptorů a mutací p53 a tyto molekulární změny mohou do určité míry vysvětlovat ztrátu exprese bcl-2 u těchto nádorů. U řady nádorů a zvláště u karcinomu prsu je zvýšená exprese onkogenu c-erb-2 spojována s horší prognózou [18, 24]. U karcinomu endometria tak jasná asociace mezi expresí c-erb-2, klinickopatologickými prognostickými faktory a prognózou dosud nalezena nebyla [1, 4, 7, 40]. V naší práci jsme prokázali zvýšenou expresi c-erb-2 u nádorů s hlubší myometriální invazí, zatímco Reinartz et al. udávají korelaci c-erb-2 exprese s histopatologickým typem nádoru, stejně jako Rolitsky et al., kteří popisují současně pozitivní korelaci exprese c-erb-2 s nádorovou diferenciací [44, 45]. Na rozdílných výsledcích u jednotlivých studií se v případě c-erb-2 exprese mohou do značné míry podílet dosud nejednotné diagnostické postupy, používající buď metodiky imunohistochemické, nebo metodiky FISH případně CISH.

Ki-67 exprese korelovala v naší práci se špatnou diferenciací, hlubokou invazí, pokročilým stadiem a metastatickým šířením. Geisler et al. prokázali pomocí multivariabilní analýzy u 147 pacientek s endometriálním karcinomem, že Ki-67 je nezávislým prognostickým indikátorem přežití [11]. Pansare et al. naproti tomu neprokázali žádnou korelaci mezi Ki-67, histologickým typem, grade nebo klinickým stadiem onemocnění [37]. Ve své prospektivní studii zahrnující 115 pacientek dokládají Salvesen et al., částečně i v souladu s našimi údaji, úzký vztah mezi expresí Ki-67, stadiem dle FIGO, histologickým typem, grade a pravděpodobností přežití [48].

Exprese ER a PR v naší práci korelovala inverzně se stupněm diferenciace nádoru a klinickým stadiem onemocnění, což je v souladu s výsledky řady publikovaných prací a doporučením ke standardnímu vyhodnocování těchto receptorů u pacientek s endometriálním karcinomem ve stadiu I a II [5, 23, 34]. Některé práce uvádějí, že PR je silnějším prognostickým faktorem než ER [9, 25]. To je v souladu s námi zjištěnou korelací mezi expresí PR a metastatickým šířením onemocnění do lymfatických uzlin.

ZÁVĚR

Z výsledků naší práce vyplývá, že kromě klinickopatologických faktorů mohou molekulárně biologické prognostické markery přispět k lepší charakteristice nádorů a přispět tak k přesnějšímu stanovení jejich klinického chování. Pro jejich případné praktické diagnosticko- terapeutické využití bude zapotřebí dalších zpřesňujících studií. 

Tato studie byla podpořena grantem IGA MZ ČR NR 9098-4/2006.

1.  Doc.MUDr.Radovan Pilka, PhD

Porodnicko gynekologická klinika

FN a LF UP

I.P. Pavlova 6

775 20 Olomouc