Role mikroRNA u nádorů hlavy a krku se zaměřením na sinonazální karcinom

Souhrn

MikroRNA jsou malé (18–25 nt) nekódující molekuly RNA, které se účastní regulace genové exprese a mají vliv na tumorigenezi. V budoucnosti by mohly být využívány jako biomarkery a terapeutické cíle u nádorových onemocnění.

Nádory hlavy a krku jsou šestým nejčastějším maligním onemocněním na světě. Patří mezi ně i sinonazální karcinom, vzácné onemocnění objevující se v oblasti epitelu dýchacího traktu, které je z molekulárního hlediska velmi málo prostudované.

MikroRNA mající vliv na patogenezi nádorů hlavy a krku byly v rámci tohoto článku rozděleny do tří kategorií: mikroRNA související s invazivností a tvorbou metastáz, mikroRNA fungující jako onkogeny a mikroRNA asociované s HPV statutem a kouřením. Předpokládáme, že mikroRNA zařazené do těchto kategorií by mohly být součástí mechanismů regulace také u sinonazálního karcinomu.

Klíčová slova:
epigenetika, mikroRNA, nádor hlavy a krku, sinonazální karcinom

Úvod

Nádory hlavy a krku (HNC) jsou útvary vznikající v epitelové výstelce aerodigestivního traktu a zahrnují tumory rtů, ústní dutiny, nosní dutiny, vedlejších dutin nosních a slinných žláz hrtanu a hltanu. Karcinom dlaždicového epitelu hlavy a krku (HNSCC) je nejčastějším subtypem nádorů této oblasti. Tvoří více než 90 % celosvětového výskytu HNC (1).

Rizikovým faktorem výskytu těchto malignit, a to především nádorů oblasti dutiny ústní a orofaryngu, je konzumace alkoholu a tabákových výrobků. Přítomnost lidských papilomavirů (HPV) v organismu zvyšuje riziko výskytu především u orofaryngealního karcinomu. S tím souvisí fakt, že prevalence tohoto nádoru globálně roste a věková hranice vzniku tumoru klesá (2).

Rané fáze onemocnění jsou přednostně léčeny chirurgickým zákrokem nebo radioterapií, zatímco u tumorů v pokročilém stadiu je využívána kombinace chirurgického zákroku a postoperační radioterapie, eventuálně radikální chemoradioterapie s využitím cisplatiny (3). Celosvětově je každý rok nově diagnostikováno více než 550 tisíc případů HNC a přibližně 300 tisíc lidí na tyto nádory každoročně umírá. U mužů se tyto tumory vyskytují častěji než u žen, a to v poměrů 2:1 až 4:1 (4). Nejvyšší prevalence HNC je v rozvojových zemích především v jihovýchodní Asii, což je spojováno s oblíbeností konzumace betelových ořechů v tomto regionu (5). V roce 2012 bylo v České republice diagnostikováno 1554 případů nádorů hlavy a krku a 765 pacientů na toto onemocnění v roce 2012 zemřelo (6).

Karcinomy dutiny nosní a vedlejších nosních dutin (SNC) tvoří 3 % všech maligních onemocnění vyskytujících se v oblasti hlavy a krku (7). Sinonazální karcinom dlaždicového epitelu (spinocelulární karcinom, SSCC) je nejčastějším typem těchto nádorů, následovaný sinonazálním adenokarcinomem intestinálního typu (ITAC), k méně běžným subtypům patří nediferencovaný sinonazální karcinom (SNUC) a další. Incidence těchto nádorů je < 4,5 % na 1 milion, vyskytují se ve větší míře u mužů než u žen, což koresponduje s vyšším rizikem výskytu u některých profesí, a objevují se nejčastěji kolem 65. roku života. I při použití agresivní kombinované léčby je medián přežití u SNC méně než 18 měsíců a po dobu 5 let zůstává naživu pouze 20 % pacientů (2, 8). Mezi časté symptomy tohoto onemocnění patří změna ostrosti vidění, diplopie, lakrimace nebo proptóza. Dále se pak objevují nosní obstrukce, otok nosní sliznice, citlivost nosu, epistaxe, bolest hlavy nebo bolest v oblasti obličeje (9).

Nádory sinonazální oblasti se ve vyšší míře objevují u kuřáků cigaret, největší vliv má tabákový kouř na vznik karcinomu dlaždicového epitelu (10). Dlouhodobě se také zkoumá role HPV při kancerogenezi SNC. Přibližně 20−27 % pacientů s SNC je HPV-pozitivních. Důležitým faktorem se ukázal být high risk HPV (HPV-HR) typu 16, jenž byl nalezen přibližně u 90 % HPV-pozitivních SSCC. U těchto tkání byla rovněž nalezena vysoká exprese p16^INK4a. Ukázalo se, že exprese p16 je spolehlivým markerem pro HPV status u SSCC, nikoliv však u ostatních subtypů nádorů této oblasti. Pacienti s HPV-pozitivním nálezem mají výrazně lepší prognózu než u HPV-negativního SNC (11−13).

Dalším rizikovým faktorem vzniku nádorů v sinonazální oblasti je profesní vystavení specifickým karcinogenním látkám. Mezi rizikové substance patří dřevěný a kožený prach, formaldehyd a další (14). Kvůli vdechování dřevěného prachu zejména z tvrdého dřeva patří mezi ohrožené profese pracovníci se dřevem (výrobci nábytku, modelů ze dřeva a tesaři). U ITAC byl objasněn jeden z mechanismů vzniku malignit tak, že vdechování dřevěného prachu z tvrdého dřeva vede k výskytu chronického zánětu, který způsobuje mutageneziTP53a kancerogenezi (15). Mezi další ohrožené profese patří pracující s kůží (výrobci bot a zaměstnanci koželužen), u nichž je rizikovým faktorem vdechování koženého prachu, dále pak osoby přítomné při elektrolytické rafinaci niklu (10).

Epigenetické modifikace DNA

Epigenetické změny jsou definovány jako dědičné změny v genové expresi, které nejsou doprovázeny změnami v sekvenci DNA. Zahrnují methylaci DNA, acetylaci histonů a posttranskripční modifikace pomocí mikroRNA (miRNA). Při methylaci DNA dochází k navázání methylové skupiny na cytosin v pozici C5 nacházející se v dinukleotidu cytosin-guanin (CpG). Methylace je uskutečňována pomocí enzymu DNA methyltransferázy, která přenáší methylovou skupinu z S-adenosyl-methioninu. Výsledkem procesu je vznik 5' methylcytosinu. Dinukleotidy CpG nejsou v genomu rozmístěny rovnoměrně, ale jsou soustředěny do oblastí se zvýšeným výskytem CpG, které jsou nazývány CpG ostrůvky. Tyto oblasti se často vyskytují v promotorových oblastech genů (16, 17).

DNA methylace je důležitá pro správný vývoj jedince, a to zejména při inaktivaci chromosomu X, imprintingu a ochraně proti transpozonům (18). Poruchy methylace jsou spojovány se vznikem různých onemocnění, zejména maligních nádorů. Při globální hypomethylaci u nádorových buněk dochází ke ztrátě methylace v repetitivních DNA sekvencích vedoucí k nestabilitě chromosomů, reaktivaci transpozonů a ztrátě imprintingu (17). Další důležitou epigenetickou modifikací při vzniku tumorů je hypermethylace CpG ostrůvků v promotorové oblasti tumorsupresorových genů, která často vede k zabránění transkripce (16). Informace o DNA methylaci, expresi genů a typech nádorů jsou sdruženy v databázi MethyCancer (19).

Změny ve struktuře chromatinu probíhají pomocí posttranslačních modifikací histonových proteinů, jako je acetylace, methylace a fosforylace. Acetylace lysinových zbytků v molekule histonů probíhá za katalýzy histon-acetyltransferáz. Tento proces vede ke změnám ve struktuře nukleosomového vlákna, což umožňuje transkripčním faktorům přístup k promotorům genových lokusů a zahájení transkripce. Acetylace je reverzibilní proces a její neutralizace probíhá pomocí enzymů histon-deacetyláz. Správná funkce posttranslačních modifikací histonových proteinů je důležitá pro vývojové procesy organismu. Deregulace acetylace je spojována s nádorovým bujením a vznikem dalších poruch (20).

Tento přehledový článek je zaměřen na jednu z nejčastěji sledovaných epigenetických alterací, a to na posttranskripční regulaci pomocí miRNA.  

MikroRNA

MiRNA jsou krátké (přibližně 22 nukleotidů) nekódující molekuly RNA, které se účastní regulace genové exprese a byly poprvé objeveny při experimentech s háďátkem Caenorhabditis elegansv roce 1993 (21). Poznatky o miRNA jsou sdružovány v on-line databázi miRBase, která zahrnuje miRNA nomenklaturu, sekvence, anotace funkce a předpovědi možných cílů. V současné době je v databázi přítomno 28 645 miRNA záznamů (vydání 21), z čehož 1881 sekvencí je lidského původu (22, 23). Primární funkce miRNA je negativní regulace translace proteinů pomocí komplexu RISC tím, že se vážou ke komplementárním sekvencím na 3' UTR (nepřekládané oblasti).

Při biogenezi miRNA (viz obr. 1) vzniká nejprve primární transkript miRNA (pri-miRNA). Ten je v jádře zastřihnut pomocí komplexu ribonukleáza III enzymu Drosha a proteinu Pasha vázajícího dsRNA za vzniku prekurzorové vlásenky miRNA (pre-miRNA) o velikosti 70 nt (24). Ta je pomocí exportního faktoru Exportin-5 (Exp5) přenesena do cytoplazmy, kde dochází k sestřihu pomocí dalšího ribonukleáza III enzymu Dicer, čímž vznikne duplex miRNA o velikost 22 nt (25). Jedno z vláken duplexu se připojí ke komplexu RISC (RNA-induced silencing complex) obsahujícímu proteiny Argonaute2 (Ago2), Dicer a TRBP (transactivating response RNA-binding protein). V tomto komplexu slouží miRNA k rozpoznávání a připojení cílové mRNA při procesu RNA interference.

Calin et al. (26) poprvé popsali vliv miRNA na vznik rakoviny, konkrétně miR-15 a miR-16. Geny kódující tyto dvě miRNA byli lokalizovány na chromosomu 13q14. Tato oblast je deletovaná u více než 65 % pacientů s chronickou lymfocytární leukémií (CLL). Lu et al. (27) zjistili, že profil exprese miRNA se liší u různých typů nádorových onemocnění. Navíc prokázali, že profily miRNA jsou různé i mezi pacienty se stejným typem nádoru, tudíž se z nich dá odvodit původ nádoru a jeho vývoj. Zároveň pozorovali downregulaci nebo upregulaci některých miRNA v porovnání se zdravou tkání. Tato zjištění ukazují, že miRNA profilování může napomoci k přesnější diagnóze a prognóze onemocnění a lze je použít i pro diagnostiku histologicky špatně identifikovatelných nádorů.

Studiem mikroRNA u sinonazálního karcinomu se dosud zabývali pouze Ogawa et al. (28), kteří zkoumali souvislost downregulace miR-34a s rezistencí k cis-diaminodichlorplatině (CDDP). Studie ukázala, že miR-34a je důležitým markerem prognózy pro léčbu SSCC pomocí CDDP. Autoři zároveň poukazují na možnost, že na regulaci chemosenzitivity nádoru na CDDP by se mohly podílet i další miRNA.

Studium miRNA u nádorů hlavy a krku se zaměřuje především na karcinom dlaždicového epitelu hlavy a krku, která je nejčastějším subtypem HNC. Mnoho vědeckých týmů se zabývá profilováním miRNA s odlišnou expresí miRNA oproti zdravé tkáni (viz tab. 1).

MikroRNA související s invazivností a tvorbou metastáz

U některých miRNA byla objevena souvislost s rychlostí růstu a rozšiřování nádorových onemocnění, a mohly by tak sloužit jako markery nádorů hlavy a krku. Patří mezi ně miRNA rodiny miR-200 (miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-141 a miR-429), které hrají důležitou roli při potlačování tumoru. Děje se tak pomocí regulace exprese transkripčních faktorů s motivem zinkového prstu ZEB1 a ZEB2, které jsou hlavními regulátory epitelově-mezenchymového transferu (EMT) pomocí přímého potlačení E-kadherinů. EMT je proces, při němž jsou epitelové buňky přeměněny na buňky mezenchymové, které mají schopnost migrace a invaze, což vede k procesu tvorby metastáz a zrychlenému postupu nádoru (29). Exprese některých miRNA může být ovlivněna přítomností molekuly hepatocytového růstového faktoru (HGF), což je pleiotropní molekula, která funguje jako mitogen, motogen nebo morfogen u mnoha buněk a podílí se na EMT. Susuki et al. (30) pozorovali u tkáně HNSCC downregulaci miR-200c a miR-27b po stimulaci HGF. HGF. Exprese ZEB1 byla upregulována 3 a 6 hodin po stimulaci HGF s E-kadherin (cílová molekula ZEB1) byla downregulována 8 hodin po stimulaci.

Ve tkáni nádorů dochází také k deregulaci některých mikroRNA, a to konkrétně upregulaci miR-21, miR-200c a miR-34a a naopak downregulaci miR-375. Exprese let-7a, mir-200c a miR-34a je výrazně vyšší u orofaryngeálního karcinomu než u laryngealního karcinomu. Upregulace miR-34 je spojována p16 pozitivním orofaryngeálním karcinomem (31). Jensen et al. (32) našli downregulaci miRNA rodiny miR-200 i u shluků nádorových buněk při procesu nazývaném tumor budding u karcinomu dlaždicového epitelu dutiny ústní (OSCC).

U sarkomatoidního karcinomu hlavy a krku (SpCC) dochází k výrazné downregulaci miRNA rodiny miR-200 a miR-205 v porovnání s tkání HNSCC. SpCC je smíšený nádor skládající se z SSCC a maligních vřetenovitých buněk. Tato zjištění dokazují předpokládanou roli EMT při vzniku SpCC vedoucí ke ztrátě E-kadherinů a desmosomálních kadherinů (33).

Bufalino et al. (34) detekovali u tkáně OSCC downregulaci miR-143 a miR-145 vedoucí ke zvýšené expresi aktivinu A. Přítomnost aktivinu A je u OSCC asociována s výskytem metastáz na lymfatických uzlinách, nádorovou diferenciací a kratší dobou přežití a navíc reguluje apoptózu, proliferaci a invazivnost buněk.

MikroRNA jako onkogen

MiR-21 je jedním z nejvíce prostudovaných miRNA onkogenů, jehož zvýšená exprese byla detekována nejen u HNSCC, ale i v dalších solidních nádorových tkáních (nádory plic, prsu, pankreatu, mozku, prostaty, žaludku, jater tlustého střeva a lymfomy). Yan et al. (35) ve svém výzkumu naznačují, že miR-21 se spolu s miR-34ac, p53 a NF-κB koordinovaně podílí na regulaci skupiny genů přispívajících k metastatickému procesu u HNSCC. Tyto miRNA se pomocí specifických transkripčních faktorů účastní regulace tumor supresorových genů (TP63), genů ovlivňujících progresi nádorů (ITGA5, CDKN1A) a genů ovlivňujících metastatické procesy (IL8, ICAM1). Sun et al. (36) publikovali výsledky, které potvrzují nejen vyšší expresi miR-21 u HNSCC než u zdravých epiteliálních buněk, ale také roli miR-21 při regulaci proliferace buněk u HNSCC. Děje se tak pomocí negativní regulace tumor supresorového genu PDCD4 na posttranskripční úrovni, kdy se miR-21 váže na netranslatovanou oblast na 3' konci PDCD4 mRNA. PDCD4 se na molekulární úrovni váže na eukaryotický iniciační faktor 4a (eIF4A), inhibuje ho a tím ovlivňuje translaci proteinů. Navíc PDCD4 inhibuje transaktivaci a inhibitor cyklindependentní kinázy p21.

Piao et al. (37) úspěšně demonstrovali potenciální využití kationtových nanočástic zapouzdřených s anti-miR-21 jako nového terapeutika pro léčbu HNSCC. Výsledkem léčby s anti-miR-21 byla inhibice proliferace buněk, zkrácení doby klonogenního přežití, inhbice invaze a migrace buněk a zvýšení apoptózy u HNSCC tkáně.

MikroRNA asociované s HPV statutem a kouřením

Infekce HPV je v oblasti problematiky nádorů hlavy a krku spojována především s orofaryngeálním SCC (OPSCC). HPV-pozitivních je asi 70 % OPSCC a 20–25 % všech HNSCC. Identifikace miRNA spojených s HPV-pozitivitou by mohla v budoucnu pomoci s objevením terapeutických cílů u HPV-indukovaných nádorů. Lajer et al. (38) ve své studii sledovali změny v expresi miRNA mezi HPV-pozitivní a HPV-negativní HNSCC tkání. MiRNA profil u HPV pozitivní tkáně se výrazně lišil od negativní tkáně. Identifikovali několik miRNA, které se účastní HPV patogeneze, a to miR-15a/miR-16/, miR-143/miR-145 a miR-106-363 klastr. Gao et al. (39) identifikovali 5 miRNA, které korelovaly s transkripční aktivitou HPV: miR-9, mi-31, miR-223, miR-155 a miR-18a. K dalším poznatkům dospěli Wald et al. (40), kteří hledali expresní miRNA profil u HPV16-pozitivních HNSCC buněčných linií. Identifikovali 3 miRNA, jež byly upregulované v HPV-pozitivní tkáni: miR-363, miR-497, miR-33, a 8 miRNA, které byly ve stejné tkáni downregulované: miR-155, miR-181a, miR-181b, miR-29a, miR-218, miR-22, miR-221 a miR-142-5p. Hui et al. (41) naopak asociovali s HPV/p16 statusem upregulované miRNA: miR-20b a miR-9.

Expozice látkám uvolňovaných při žvýkání nebo kouření tabáku patří k rizikovým faktorům vzniku nádorů hlavy a krku především v oblasti dutiny ústní a okolí. Ukázalo se, že tabákové výrobky mohou ovlivňovat profil exprese miRNA. Jednou z miRNA, u které dochází k downregulaci v důsledku vystavení tabáku u OSCC, je miR-145. Tato miRNA je umlčována hypermethylací a regulována proteinem p53 v důsledku expozice cigaretovému kouři (42). Nikotin naproti tomu v tkáních zvyšuje expresi miR-9, což je represor E-kadherinu, který účastní se kontroly migrace a proliferace buněk (43).

Závěr

Posttranskripční modifikace pomocí miRNA hrají důležitou roli v patogenezi různých nádorových onemocnění, a to i tumorů hlavy a krku. V různých studiích byly prokázány rozdíly v úrovni exprese jednotlivých miRNA mezi zdravou a nádorovou tkání. Nádory hlavy a krku jsou díky anatomicky komplexní stavbě oblasti a složitým vzorcům postupu nádoru obtížně léčitelné, proto je důležité hledat alternativní terapie.

MiRNA se snadno izolují z krve, ze séra nebo tkání po biopsii a nepodléhají přílišné degradaci, proto jsou vhodnými kandidáty pro využití jakožto biomarkery nejen pro nádorová, ale i pro další onemocnění. Navíc by mohly být vyvinuty specifické terapie, jejichž cílem by bylo inhibovat nebo napodobovat specifické miRNA a regulovat tak vývoj choroby.

Přestože se mnoho vědeckých týmů věnuje sledování změn v expresi miRNA u nádorů hlavy a krku, u tkání sinonazálního karcinomu byla doposud identifikována pouze jedna miRNA (mi-34a), která by mohla sloužit jako prognostický marker tohoto onemocnění. U nádorů v sinonazální oblasti by mohl být cílem výzkumu profil exprese mikroRNA souvisejících s invazivností a tvorbou metastáz, fungujících jako onkogeny a asociovaných s HPV statutem a kouřením u nádorů hlavy a krku.

Seznam zkratek

Ago2 protein Argonaute2

CDDP cis-diaminodichlorplatina

CLL chronická lymfocytová leukemie

CpG dinukleotid cytosin‑guanin

eIF4A eukaryotický iniciační faktor 4a

EMT epitelově-mezenchymový transfer

Exp5 exportin-5

HGF hepatocytový růstový faktor

HNC nádory hlavy a krku

HNSCC karcinom dlaždicového epitelu hlavy a krku

HPV lidský papilomavirus

HPV‑HR high risk lidský papilomavirus

ITAC sinonazální adenokarcinom intestinálního typu

MANEC smíšený adenoneuroendokrinní karcinom

miRNA mikroRNA

MS-MLPA methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification

OPSCC orofaryngeální karcinom dlaždicového epitelu

OSCC karcinom dlaždicového epitelu dutiny ústní

pre‑miRNA prekurzorová mikroRNA

pri‑miRNA primární transkript mikroRNA

RISC RNA-induced silencing complex

SNC karcinom dutiny nosní a vedlejších dutin nosních

SNUC nediferencovaný sinonazální karcinom

SpCC sarkomatoidní karcinom hlavy a krku

SSCC sinonazální karcinom dlaždicového epitelu

TRBP transactivating response RNA-binding protein

UTR nepřekládaná oblast mRNA

Korespondenční adresa

Ing. Helena Kovaříková

Ústav klinické biochemie a diagnostiky Lékařské fakulty UK a FN Hradec Králové

Sokolská 581

500 05  Hradec Králové

Tel.: 495 833 864

e-mail: kovarikovahe@lfhk.cuni.cz