Základné biologické úlohy galektínov v reparácii tkanív a raste nádorov

Souhrn

Galektíny patria medzi endogénne lektíny – bielkoviny špecificky rozpoznávajúce cukorné motívy. Galektíny hrajú významné úlohy v procesoch bunkovej proliferácie, diferenciácie, migrácie a tvorby medzibunkovej hmoty. Navyše sú schopné prenášať bunkové signály a podieľať sa na medzibunkových interakciách. Podobne bolo dokázané, že galektíny zohrávajú dôležitú úlohu pri tvorbe mikroprostredia nádoru a/alebo hojacej sa rany. Táto práca poskytuje prehľad experimentálnych a klinických štúdií zaoberajúcich sa biologickými úlohami galektínov v tkanivovej reparácii a jej paralele k raste nádoru.

Klíčová slova:
lektín – hojenie rán – proliferácia – diferenciácia – medzibunková hmota

Úvod

Z dôvodu stále stúpajúcich výskytov metabolických, kardiovaskulárnych a onkologických ochorení stúpa pravdepodobnosť výskytu zle sa hojacich rán. Už v roku 2003 sa len v Spojených štátoch amerických minulo vyše 9 miliárd dolárov na liečbu komplikácií spojených so zlým hojením (1). Medzi najvážnejšie komplikácie hojenia rán patrí stagnácia tvorby granulačného tkaniva, spomalená epitelizácia, dehiscencia a infekcia rany ako aj tvorba hypotrofických a keloidných jaziev. Za tieto problémy je často zodpovedná dysfunkcia kmeňových buniek a tkanivového mikroprostredia. Tieto biologické deje vedú k relatívne pomalému priebehu hojenia a k rozsiahlej tvorbe jaziev. Stimulácie hojenia rán je založená predovšetkým na protizápalovom efekte, zvýšení proliferácie buniek, stimulácii tvorby extracelulárnej matrice alebo na indukcii kontrakcie rany.

Na druhej strane hlavný dôvod limitovanej úspešnosti konzervatívnej liečby pokročilých nádorových ochorení je daný skutočnosťou, že klasická onkologická terapia je zameraná predovšetkým na elimináciu rýchlo sa deliacich buniek nádorového parenchýmu (2, 3). Touto cestou, ale nie sme schopní zásadným spôsobom narušiť fungovanie nádorovej kmeňovej bunky, ktorá je zodpovedná za tak dôležité komplikácie protinádorovej terapie, ako je minimálna reziduálna choroba a multi-lieková rezistencia (4). Istou možnosťou by bola terapeutická manipulácia nádorového mikroprostredia (predovšetkým strómy), na ktorom sú závislé kmeňové bunky. Kľúčovú úlohu pri vytváraní nádorovej strómy a granulačného tkaniva hrajú fibroblasty (5–8). Fibroblasty sú potentným zdrojom vybraných rastových faktorov (napr. IGF-2 (inzulínu podobný rastový faktor-2), BMP-4 (kostný morfogenetický proteín-4)), cytokínov (napr. IL-6 (interleukín-6)) a chemokínov (napr. CXCL-1, IL-8). Podobne nezameniteľný je ich význam pri produkcii štruktúrnych makromolekúl (kolagén, fibronektín, tenascín), ktoré tvoria extracelulárnu matricu. Pre kontrakciu rany je zásadná ich schopnosť diferenciácie na myofibroblasty, ktoré sú navyše schopné zásadným spôsobom ovplyvniť biologické vlastnosti nádorov (8). Okrem spomínaných regulačných molekúl existuje aj skupina glykoproteínov schopných zásadným spôsobom ovplyvniť biologické deje zapojené do hojenia rán a/alebo tvorby, rastu a metastázovania nádorov (tab. 1). Tieto molekuly sú endogénne lektíny s komplexným účinkom schopné špecificky rozpoznávať a viazať sacharidové štruktúry a prenášať rôzne signály (9). Nazývajú sa galektíny.

Galektíny

Prvý galektín bol objavený v roku 1975 Vivianom Teichbergom z extraktov elektrického úhora ako hemaglutinín s nízkou molekulovou hmotnosťou (14–16 kDa) viažuci beta-galaktozidy (10). Tento proteín bol nazvaný elektrolektín – dnes nazývaný galektín-1 (nová systematická nomenklatúra označuje galektíny arabskými číslicami podľa poradia objavenia). Neskôr boli objavené podobné lektíny v ďalších tkanivách rôznych živočíšnych druhov vrátane človeka. Do dnešného dňa bolo identifikovaných 15 galektínov.

Galektíny majú veľa znakov cytoplazmatických proteínov, sú syntetizované cytozolickými ribozómami, nemajú disulfidické mostíky, žiadne sacharidové reťazce, žiadnu signálnu sekvenciu a vo väčšine prípadov je ich N-koniec acetylovaný (11). Ich morfologická lokalizácia nie je obmedzená len na cytoplazmu, ale nachádzajú sa v závislosti na type galektínu aj v jadre a medzibunkových priestoroch (9). Základom ich štruktúry je prítomnosť tzv. sacharid-rozpoznávajúcej domény CRD (carbohydrate recognition domain) tvorenej približne 130 aminokyselinami. V závislosti od ich štruktúry a počtu CRD sú galektíny rozdelené do troch skupín (obr. 1) (12): 1. prototypové galektíny, obsahujúce buď jednu CRD (monomér) alebo dve identické CRD (homodimér) (galektíny-1, -2, -5, -7, -10, -11, -13, -14 a -15); 2. chiméra typ galektín, ktorý má len jedného člena, galektín-3, ktorý je zložený z nelektínovej domény napojenej na CRD; a 3. tzv. tandemové galektíny, pozostávajúce z 2 CRD navzájom spojených krátkym polypeptidovým reťazcom (galektíny-4, -6, -8, -9, a -12).

Funkčné interakcie galektínov s glykokonjugátmi ovplyvňujú adhéziu buniek a bunkovú signalizáciu (13). Interakcie galektínov s intracelulárnymi ligandmi ovplyvňujú množstvo signálnych ciest (13). Vďaka týmto funkčným interakciám sú galektíny zapojené do mnohých biologických dejov zasahujúcich do funkcie buniek ako napríklad: rast, diferenciácia, proliferácia, migrácia (14), zostrih mRNA (15), adhézia (16), chemotaxia (17), a apoptóza (18). Majú dôležitú úlohu v patologických procesoch autoimunitných ochorení, alergických reakcií, zápalov (19), onkologických ochorení (20), aterosklerózy a taktiež mnohých diabetických komplikácií (21).

I. skupina galektínov

Galektín-1 je prítomný ako intracelulárne, tak aj extracelulárne (22) a zasahuje do mnohých fyziologických a patologických procesov. Ukázalo sa, že galektín-1 je vo zvýšenej miere prítomný v bunkách a medzibunkovej hmote strómy rôznych ľudských nádorov (obr. 2A) a v granulačnom tkanive hojacej sa rany (8, 23–26). Tento galektín rozpoznáva poly-N-acetyllaktosaminové epitopy nachádzajúce sa na množstve proteínov a niektorých lipidoch.
Galektín-1 je vo zvýšenej miere exprimovaný v zápalovej fáze hojenia rán (25, 26) a má protizápalový účinok, ktorý súvisí so supresiou prozápalových mediátorov IL-2, TNF-α (tumor nekrotizujúci faktor alfa), IFN-γ (interferón gama) (27), a indukciou protizápalových mediátorov IL-10, IL-5 a TGF-β (transformujúci rastový faktor-beta) (28). Preto sa viacero štúdií orientuje týmto smerom a snažia sa nájsť využitie galektínu-1 v liečbe chronických zápalových ochorení, ako je artritída (29), kolitída (30) a chronická pankreatitída (31).

Na druhej strane sa taktiež ukázalo, že galektín-1 v nízkych koncentráciách významne podporuje rast buniek (32). Galektín-1 zvyšuje adhéziu normálnych a rakovinových buniek k medzibunkovej hmote (ECM – extracellular matrix) (20). Galektín-1 môže interagovať s integrínovými receptormi a indukovať anoikis (programovaná bunková smrť indukovaná stratou kontaktu bunky k ECM) (33, 34). Na druhej strane ECM bohatá na galektín-1 vytvára vhodné mikroprostredie pre výskyt a prežívanie slabo diferencovaných keratinocytov (7). Zaujímavé bolo zistenie, že galektín-1 existuje aj v oxidovanej forme, ktorá stratila lektínovú aktivitu.Táto oxidovaná forma však urýchľuje regeneráciu axónov po poranení periférnych nervov (35).

Bolo dokázané, že tento endogénny lektín hrá dôležitú úlohu v nádorovej angiogenéze a taktiež v samotnom raste a metastázovaní nádorov (36, 37). Presná biologická funkcia galektínu-1 pri tvorbe nádorového mikroprostredia a hojenia rán ale zostává stále predmetom ďalšieho výskumu. Avšak už dnes sú známe viaceré samostatné mechanizmy, ktorými galektín-1 stimuluje angiogenézu. Jedným z nich je interakcia s neurolipínom-1 na povrchu endotelových buniek, ktorý sa správa ako ko-receptor pre receptor cievneho endotelového rastového faktora (VEGFR – vascular endothelial growth factor receptor). Neurolipín zvyšuje fosforyláciu VEGF receptora, čo následne aktivuje mitogénom-aktivovanú proteín kinázu (MAPK) (38). Ďalším z mechanizmov je stimulácia proliferácie, adhézie a migrácie endotelových buniek ako dôsledok aktivácie Ras-Raf-Erk signálnej dráhy (24). Ukázalo sa, že exogénna aplikácia galektínu-1 stimuluje proliferáciu a migráciu endotelových buniek ako aj tvorbu ciev v in vitro (38–40) a in vivo (24) podmienkach.

Zvýšená expresia galektínu-1 v nádorových endotelových bunkách bola pozorovaná vo zvieracích ako aj ľudských nádoroch (41). Ukázalo sa, že výskyt galektín-1 pozitívnych endotelových buniek je 7% v nenádorových kapilárach, kým vo vzorkách získaných z primárneho karcinómu prostaty bol nárast až na 64 % (42). Navyše vyradenie génu pre galektín-1 v nádorových bunkách viedlo k zníženiu rastu nádoru negatívnym ovplyvnením procesu angiogenézy (43).

Zlá prognóza spojená s upreguláciou galektínu-1 je spojená aj s únikom nádorových buniek imunitnému dozoru a apoptózou T-lymfocytov (44). Navyše zvýšená expresia galektínu-1 koreluje s výskytom myofibroblastov v karcinómoch hlavy a krku, čím je známkou malígnej progresie a predstavuje negatívnu prognózu pre pacienta (8). Podobne je exogénne pridaný galektín-1 schopný indukovať diferenciáciu fibroblastov na myofibroblasty nezávisle od TGF-β (7). Galektín-1 môže tak byť cieľom, ktorý by mohol spojovať protinádorovú terapiu a liečbu rán (45)   

Galektín-2 je dominantne exprimovaný v gastrointestinálnom trakte (46). Bolo dokazané, že signifikantne zlepšuje obnovenie črevného epitelu nezávisle od TGF-β, čo môže nájsť uplatnenie pri liečbe zápalových ochorení črevnej steny (IBD – inflammatory bowel disease) (47). V epidermis sú väzbové miesta pre galektin-2 prítomné v normálnom aj transformovanom epiteli (obr. 2B). U stresovaných buniek je galektín-2 lokalizovaný v PML (promyelocytický leukemický proteín) telieskach bunkových jadier (48) (obr. 2C).

Galektín-7 sa exprimuje vo viacvrstvových epiteloch: epidermis, cornea, ústna dutina, esofagus, anorektálny epitel (49). Je asociovaný s migráciou epitelových buniek, čím zohráva dôležitú úlohu v procese reepitelizácie kože (9) a rohovky (50, 51). Ukázalo sa, že tento lektín je exprimovaný aj v trachei a hrá úlohu pri dozrievaní folikulov v ováriu (52). Galektín-7 takisto pôsobí ako pro-apoptotický faktor prostredníctvom p53 (53). U nádorov vychádzajúcich z dlaždicových epitelov je expresia galektínu-7 významne znížená (54).  

Galektíny-5, -10, -11, -13, -14 a -15. Ďalšie galektíny nehrajú podľa doposiaľ známych literárnych dát až tak významné úlohy v tkanivovej reparácii. Ukázalo sa, že galektín-5 je lokalizovaný v cytosóle a na povrchu retikulocytov a erytrocytov a podieľa sa na diferenciácii erytroblastov na zrelé erytrocyty (55). Galektín-10 sa exprimuje v eozinofilných granulocytoch, kde vytvára kryštalické formy známe ako Charcot-Leydenove kryštály. Na rozdiel od ostatných galektínov vykazuje omnoho vyššiu afinitu pre manózu ako pre β-galaktozidy (13). Galektín-11 sa exprimuje v gastrointestinálnom trakte (56). Z onkologického pohľadu je zaujímavý galektín-13, ktorý sa exprimuje v makrofágoch, NK- bunkách a v mnohých typoch nádorov (napr. karcinóm prsníka, adenokarcinóm prostaty, malígny melanóm atď.). Zvýšená expresia galektínu-13 vedie k indukcii apoptózy buniek prostredníctvom JNK/SAPK (C-junN-terminálna kináza/stresom aktivovaná proteínkináza) aktivácie (57). Na druhej strane k uvoľneniu galektínu-14 dochádza pri alergických zápaloch respiračného traktu a parazitárnych infekciách gastrointestinálneho traktu. Počas týchto zápalov ovplyvňuje adhéziu buniek a mení vlastnosti epitelu (58). Galektín-15 bol lokalizovaný v epitelových bunkách endometria a v zárodočných bunkách trofoektodermy. Extracelulárne reguluje migráciu buniek trofoblastu a ich adhéziu k epitelu endometria. Intracelulárne ovplyvňuje prežitie, rast a diferenciáciu buniek trofoblastu. Zároveň môže slúžiť ako marker funkcie endometria a plodnosti (59).

II. skupina galektínov 

Galektín-3 je exprimovaný v aktivovaných makrofágoch, eozinofiloch, mastocytoch, fibroblastoch, epitelových bunkách gastrointestinálneho a respiračného traktu, obličkách a senzorických neurónoch. Ukázalo sa, že expresia galektínu-3 v ranách je v skorých štádiách nízka no v maturačnej fáze hojenia (tvorba jazvy) stúpa (26, 60). Aj napriek tomu je tento lektín schopný zrýchliť epitelizáciu rán (61). Podobne sa ukázalo, že galektín-3 stimuluje proliferáciu fibroblastov (62) a taktiež je modulátorom interakcií bunka-medzibunková hmota (63). Z tohto pohľadu bolo logické zistenie, že galektín-3 je významným induktorom tkanivovej fibrózy v rôznych tkanivách (30, 64–66). Výrazný vzostup koncentrácie galektínu-3 exprimovaného na povrchu, ale aj v cytoplazme alveolárneho epitelu bol pozorovaný pri rozvoji pľúcnej fibrózy (67). Navyše sa ukázalo, že galektín-3 aktivuje tvorbu myofibroblastov a fibrózu pečene a obličiek (64, 65).

Z pohľadu hojenia a tvorby nádorov je zaujímavý aj vplyv galektínov na zápal. Vo všeobecnosti pôsobí galektín-3 ako pro-zápalový faktor (13). Inhibuje uvoľňovanie protizápalového IL-5 najmä v eozinofiloch, no na druhej strane môže aktivovať mastocyty, neutrofily, monocyty a bazofily (68). U galektín-3 deficientných myší sa prejavili znížené funkcie mastocytov a redukcia akumulácie s astmou asociovaných leukocytov pri zápale dýchacích ciest (13). Navyše mali galektín-3 deficientné makrofágy omnoho nižšiu schopnosť chemotaxie a fagocytózy (17, 69). Galektín-3 zohráva kľúčovú úlohu v skorej fáze zápalu, prostredníctvom jeho väzby na integrínové receptory a patrí k dôležitým modulátorom funkcií neutrofilov. Interaguje s povrchovým receptorom neutrofilov CD66b, ktorý je zodpovedný za aktiváciu NADPH (nikotín amid adenín dinukleotid fosfát) oxidázy (70), čím indukuje respiračné vzplanutie neutrofilov (13). Zlepšuje adhéziu neutrofilov k laminínu (71), podporuje ich extrevazáciu do zápalového ložiska (72). Ukázalo sa, že tieto regulácie prebiehajú cez alternatívnu MAPK cestu (73).

Galektín-3 výrazne ovplyvňuje proces apoptózy buniek. Intracelulárne pôsobí ako antiapoptický faktor T-lymfocytov a nádorových buniek (74), avšak nízke dávky exogénne pridaného galektínu-3 indukujú proapoptický signál (75). Zvýšená expresia galektínu-3 bola pozorovaná pri mnohých typoch karcinómov. Galektín-3 zvyšuje invazivitu nádoru a podporuje tvorbu metastáz (63). Podobne ako galektín-1 aj galektín-3 je zapojený do procesu nádorovej angiogenézy. Je schopný stimulovať angiogenézu ovplyvnením funkcie VEGF a bazálneho fibroblastového rastového faktora (bFGF). K tomuto účinku dochádza po naviazaní sa galektínu-3 na αvβ3 integrín na povrchu endotelových buniek. Táto interakcia aktivuje FAK (fokálne adhézna kináza), čo následne vedie k VEGF- a bFGF-sprostredkovanej tvorbe ciev (76). Exogénne pridaný galektín-3 zvyšuje angiogénnu odpoveď in vitro a stimuluje vaskularizáciu in vivo (77).

Okrem zapojenia sa galektínu-3 do hojenia rán a nádorového rastu zohráva tento lektín úlohu aj v patogenéze srdcového zlyhania, kde je považovaný za nový potenciálny prognostický faktor. Vo viacerých klinických štúdiách bolo totiž preukázané, že pacienti so zvýšenou hladinou cirkulujúceho galektínu-3 majú horšiu prognózu (zvýšené riziko mortality) a riziko hospitalizácie v porovnaní s pacientmi s nízkymi alebo normálnymi hladinami (78, 79). Chimerický galektín spúšťa proliferáciu fibroblastov v myokarde pri srdcovom zlyhaní (80, 81).

III. tretia skupina galektínov

Galektín-4. Z tejto skupiny galektínov má z pohľadu hojenia rán pravdepodobne najväčší význam galektín-4, ktorý je podobne ako galektín-2 dominantne exprimovaný v gastrointestinálnom trakte (82). Ukázalo sa, že aj tento lektín dokáže signifikantne urýchliť črevnú reepitelizáciu nezávisle od TGF-β (47).

Galektín-6, -8, -9 a -12. Skupina týchto galektínov nemá významný dopad na biologické procesy zapojené do tkanivovej reparácie. Galektín-6 sa exprimuje v epitelových bunkách gastrointestinálneho traktu (GIT) (83). Galektín-8 je exprimovaný v pľúcach, pečeni, srdci, mozgu a obličkách. Špecificky interaguje s α3β1 a α6β1 integrínmi na bunkových povrchoch čím inhibuje adhéziu buniek v procesoch, ktoré vyžadujú interakciu proteín-sacharid. Navyše sa ukázalo, že galektín-8 indukuje proces apoptózy nezávisle od p53 (84) a podieľa sa na regulácii funkcie neutrofilov pri fagocytóze (85). Na druhej strane galektín-9 pôsobí ako chemotaktický faktor eozinofilov (86), čo naznačuje jeho potenciálnu úlohu v modulácii alergických a parazitárnych ochorení (87). Je exprimovaný v týmuse, pečeni, GIT, pľúcach a indukuje apoptózu aktivovaných T-lymfocytov a rakovinových buniek (88). Galektíny -8 a -9 sú okrem toho exprimované aj endotelovými bunkami. V porovnaní s galektínmi -1 a -3, ktoré sú intenzívne študované v súvislosti s nádorovou angiogenézou a ich zapojením do progresie rastu nádoru, je o galektínoch -8 a -9 dostupné len obmedzené množstvo informácií. Štúdie však naznačujú proangiogénny charakter predovšetkým galektínu-8 (89). Galektín-9 je v normálnych dlaždicových epiteloch exprimovaný v bazálnej vrstve, ktorá má proliferačnú aktivitu. Počas aktivácie epitelových buniek alebo v nádoroch sa tento galektín z epitelových buniek stráca (90). Toto pozorovanie naznačuje, možnú funkciu galektínu-9 v procese hojenia a kancerogenézy. Expresia galektínu-12 bola lokalizovaná v jadre a mitochondriách adipocytov, pričom indukuje ich apoptózu (91).

Záver

V tejto prehľadnej práci sme systematicky zosumarizovali regulačné úlohy galektínov na procesy zapojené do regenerácie a reparácie tkanív a poukázali sme na určitú podobu k tvorbe nádoru. Ukázalo sa, že expresia jednotlivých galektínov je často odlišná. Aj keď majú galektíny zjavnú sekvenčnú homológiu, každý proteín nasleduje svoj charakteristický vzor expresie a biologickej úlohy v priebehu hojenia. Zdá sa, že existuje určitá paralela medzi hojením rán a rastom nádorov (92, 93). Terapeutické riešenie oboch patologických stavov vyvoláva potrebu komplexného prístupu, z ktorého nie je možné vyňať väzivovú zložku vytvárajúcu vhodné mikroprostredie.

Zdá sa, že na modulácii mikroprostredia sa výraznou mierou podieľa galektín-1, ktorý je upregulovaný v skorej fáze reparácie, kde zásadným spôsobom ovplyvňuje zápal a diferenciáciu buniek. Podobne tomu je aj v niektorých typoch nádorov. Na druhej strane galektín-3 je upregulovaný v maturačnej fáze hojenia a pravdepodobne zohráva významnú úlohu v procese vyzrievania granulačného tkaniva a následnej tvorby jazvy. Tento lektín je v dnešnej dobe považovaný za marker fibrózy a srdcového zlyhania. Z publikovaných prác vyplýva, že v hojení rán môže mať určitý modulačný efekt ešte galektín 2, 4 a 7. Zásadná úloha ostatných galektínov v samotnom hojení tkanív ostáva zatiaľ otázna.

Je potrebné však povedať, že väčšina prác bola realizovaná na hlodavcoch. Korelácia animálnych štúdií k človeku by bola možná keby neexistovala žiadna medzidruhová variabilita. Keď boli porovnávané dáta zo štúdií na hlodavcoch k prasacej koži, zistilo sa, že sa môžu určité kvantitatívne aspekty predsa len líšiť (25, 26). Z toho vyplýva, že výsledky prezentované v animálnych štúdiách nemôžu byť priamo aplikovateľné aj pre ľudský organizmus. Vďaka dostupnosti tkanivových lektínov pre in vitro a in vivo experimenty môže byť ich úloha v procese hojenia rán aj naďalej skúmaná v ďalších klinických štúdiách.

ADRESA PRO KORESPONDENCI:

RNDr. Peter Gál, PhD.

Východoslovenský ústav srdcových a cievnych chorôb, a.s.

Úsek pre biomedicínsky výskum

Ondavská 8, 040 11 Košice, SR

e-mail:pgal@vusch.sk