Prenatálny záchyt variant so zmenou v počte kópií u plodov so zachytenými vrodenými vývojovými poruchami, v období 2015–2020 metódou Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification a mikročipovou analýzou

Souhrn

Ciele: Analýza prenatálnych vzoriek za obdobie 2015–2020. Porovnanie miery detekcie klinicky relevantných variant cytogenetickou analýzou karyotypu a cytogenomickými metódami MLPA (Multiplex Ligation-Depent Probe Amplification) a mikročipmi (CMA – chromosomal microarray). Súbor a metodika: Analyzovaných bolo 1 029 prenatálnych vzoriek cytogenetickým hodnotením karyotypu (n = 1 029), cytogenomickými metódami MLPA (n = 144) a CMA (n = 111). Všetky nebalansované zmeny boli potvrdené metódou MLPA alebo CMA. Výsledky: Z analyzovaného súboru plodov, po odčítaní aneuploidií – 107 (10,40 %, n = 1 029), bolo analýzou karyotypu zachytených 22 štruktúrnych aberácií (2,39 %, n = 922) – deväť nebalansovaných zmien (0,98 %), 10 balansovaných zmien (1,08 %), jeden prípad nejasnej mozaiky (0,09 %), jeden prípad prítomnosti marker chromozómu (0,09 %) a jeden prípad diskordancie pohlavia (0,09 %). U 255 vzoriek s fyziologickým karyotypom indikovaných k cytogenomickému vyšetreniu bolo zachytených celkom osem (7,21 %, n = 111) patologických variant metódou CMA. Metódou MLPA bolo z týchto ôsmich patogénnych variant zachytených päť (3,47 %, n = 144). Celkový záchyt patogénnych variant metódami MLPA a CMA vrátane konfirmačných vyšetrení patologického karyotypu je 14 (5,14 %) a 17 (6,25 %) (n = 272). Záchyt patologických variant v skupine s izolovanými poruchami bol nižší než v skupine s mnohopočetnými poruchami (5,08 vs. 21,42 %). Záver: Potvrdila sa vyššia úspešnosť záchytu patologických variant so zmenou v počte kópií, metódou CMA než MLPA.

Klíčová slova:

MLPA – vrodené vývojové poruchy – CMA – varianty so zmenou v počte kópií

Úvod

Prenatálna diagnostika a prevencia vrodených porúch

V celkovej populácií sa vyskytuje 2–3 % narodených detí s vývojovou vrodenou poruchou [1]. Prenatálna diagnostika zahŕňa súbor vyšetrovacích metód a postupov, vďaka ktorým sa dá odhaliť prítomnosť vrodených vývojových porúch u plodu [2]. Prenatálna diagnostika kongenitálnych porúch v ČR výrazne ovplyvňuje konečnú početnosť vrodených anomálií v populácii novorodencov. V súčasnosti je trend vyšetrovať takéto poruchy v čo možno najrannejšom štádiu tehotenstva a zachytiť tak najväčší počet štruktúrnych malformácií [3]. Najčastejšie morfologické poruchy v populácii sú vrodené srdcové poruchy (VSP) [4] a tvoria až 40 % zo všetkých zachytených vrodených malformácií [5]. Prenatálny záchyt VSP má narastajúcu tendenciu, u niektorých defektov, napr. hypoplázie a výrazné poruchy srdcových komôr, je to až 100 % [6]. V približne 50 % prípadov spontánnych potratov existuje vyššia frekvencia pridružených chromozómových abnormalít, hlavne aneuploidií [7].

U niektorých typov vrodených porúch sa početnosť v novorodeneckej populácii znižuje vďaka úspešnej prenatálnej diagnostike, niektoré však aj napriek úspešnosti diagnostických postupov vykazujú vyšší záchyt alebo sú to defekty, ktoré zatiaľ nie je možné prenatálne diagnostikovať a ich početnosť sa v populácii mení [3].

Metodika prenatálneho genetického vyšetrenia plodu

Prednostne sa na genetické vyšetrenie využíva invazívny odber choriových klkov (CVS – chorionic villus sampling) a plodovej vody (amniocentéza), analýzou ktorých je možné získať najpresnejší genetický profil plodu [2], napr. metódou QF-PCR (kvantitatívna fluorescenčná PCR analýza) [8].

V súčasnej laboratórnej praxi je na prenatálne hodnotenie prítomnosti významných variant so zmenou v počte kópií (CNV – copy number variants), najviac využívaná mikročipová analýza (CMA – chromosomal microarray) a metóda MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification). CMA má oproti konvenčnej cytogenetike svoje výhody. Poskytuje detailnejší obraz karyotypu a naviac zaznamenáva zmeny v CNVs nájdených práve u pacientov s fyziologickým karyotypom [9]. Avšak nie je možné týmito metódami zachytiť balansované prestavby, Robertsonské translokácie a inverzie. Naviac neposkytujú informáciu zahŕňajúcu umiestnenie rozsiahlej inzercie, ani jej orientáciu [10,11]. Podrobnejšiu analýzu jednotlivých génov je možné získať celogenomovým alebo celoexomovým sekvenovaním (WGS/WES – whole-genome sequencing/whole-exome sequencing) pomocou špeciálnych panelov génov [12,13]. V súčasnosti je dôležitou súčasťou skríningového vyšetrenia v tehotenstve neinvazívne genetické testovanie (NIPT – non-invasive prenatal testing) voľnej fetálnej DNA z krvného séra matky. Táto metóda sa vyznačuje vysokou senzitivitou a špecificitou v rozmedzí 92–100 % [14]. V súčasnosti je v ČR toto vyšetrenie v plnom rozsahu hradené pacientom.

CNV ako príčina genetickej poruchy

Častou príčinou genetických porúch sú zmeny v CNVs. Vyskytujú sa v rozsahu chromozómových aneuploidií až po mikroduplikácie a mikrodelécie, vrátane malých štruktúrnych variant, ktoré ovplyvňujú jednotlivé gény a exóny. V ľudskom genóme sa vyskytuje asi 10 % CNV variant [15]. Benígne CNVs sú často malé, intergénové alebo zahŕňajú gény, ktoré tolerujú zmeny v počte kópií, zatiaľ čo patogénne CNV sa nachádzajú v dôležitých génoch zapojených do vývoja [16]. Mnoho CNV variant sa vyznačuje neúplnou penetranciou a variabilnou expresivitou, čo je ovplyvnené ďalšími genetickými, epigenetickými a environmentálnymi faktormi [17].

Materiál a metodika

Na analýzu DNA boli použité prenatálne vzorky choriových klkov, plodovej vody a potratového tkaniva, od tehotných pacientok vyšetrených na Ústave lekárskej genetiky vo Fakultnej nemocnici v Olomouci alebo externých pacientok, ktorých vzorky boli poslané na Ústav lekárskej genetiky na genetickú analýzu. Všetky pacientky podpísali informovaný súhlas s výskumom. Odber vzoriek genetického materiálu prebehol za spolupráce s Centrom fetálnej medicíny vo Fakultnej nemocnici v Olomouci a analýza genetického materiálu a vyhodnotenie dát prebiehalo od roku 2015 do roku 2020 na Ústave lekárskej genetiky vo Fakultnej nemocnici v Olomouci a vybrané vzorky na pracoviskách Gennet v Prahe a Ústave molekulárnej a translačnej medicíny, Univerzity Palackého v Olomouci.

V súbore vyšetrovaných plodov bolo 441 ženského pohlavia, 581 mužského pohlavia, u štyroch vzoriek z potratového tkaniva došlo k zlyhaniu kultivácie buniek, preto nebolo možné určiť pohlavie a ďalšia genetická analýza už nebola vykonaná. U dvoch vzoriek potratového tkaniva došlo ku kontaminácii primárnej vzorky a nebolo možné stanoviť karyotyp. U jednej vzorky bola prítomná genetická diskordancia pohlavia s fenotypom.

Pre fyziologický nález v karyotype, bolo u 144 plodov indikované vyšetrenie metódou MLPA na pracovisku Ústavu lekárskej genetiky a u 111 plodov metódou CMA na externých pracoviskách Ústavu molekulárnej a translačnej medicíny, Univerzity Palackého v Olomouci a Gennet v Prahe (tab. 1).

Na prvotnú analýzu genetického materiálu boli použité komerčne dodávané kity SALSA^® MLPA KIT P036, P070, P245, P297, na analýzu srdcových porúch kity P250, P311 a pre ďalšie typy aberácií na základe indikácie lekára kity P424, ME028, ME030, ME032 od firmy MRC-Holand (Holandsko) a CMA a/alebo SNP (single nucleotide polymorfism) array (Illumina – San Diego, CA, USA a Affymetrix – Santa Clara, CA, USA), vrátane verifikačných testov. Vzorky boli všetkými pracoviskami analyzované na základe doporučených postupov od výrobcov.

Na cytogenetickú analýzu karyotypu boli použité nakultivované fibroblasty (CVS, potratové tkanivo, plodová voda). Získané mitotické chromozómy boli po príslušnej fixácii ofarbené roztokom Giemsa – G pruhovanie, nasnímané svetelným mikroskopom Olympus BX 41 (Olympus, Japonsko) a vyhodnotené v programe Lucia Cytogenetics (Laboratory Imaging, s.r.o, Praha, ČR).

Kapilárna elekroforéza vzoriek prebiehala na prístrojoch ABI Prism 3130 (Aplied Biosystems) a SeqStudio (Thermofisher, Waltham, Massachusets, USA) podľa doporučeného postupu v protokole od firmy MRC-Holand. Dáta získané kapilárnou elektroforézou boli hodnotené v komerčne dostupnom programe Coffalyser.Net (www.mlpa.com).

Výsledky

Z analyzovaného súboru plodov, po odčítaní detegovaných aneuploidií – 107 (10,40 %, n = 1 029), bolo analýzou karyotypu zachytených 22 štruktúrnych aberácií (2,39 %, n = 922) – deväť nebalansovaných zmien (0,98 %), 10 balansovaných zmien (1,08 %), jeden prípad nejasnej mozaiky (0,09 %), jeden prípad prítomnosti marker chromozómu (0,09 %) a jeden prípad diskordancie pohlavia (0,09 %) (tab. 2, 3). Všetky nebalansované zmeny boli potvrdené metódou MLPA alebo metódou CMA. U 255 vzoriek s fyziologickým karyotypom, indikovaných k cytogenomickému vyšetreniu na základe prevažne ultrasonografických nálezov u plodu, bolo zachytených celkom osem patologických variant (7,21 %, n = 111) metódou CMA (tab. 4). Metódou MLPA bolo z týchto ôsmi patogénnych variant zachytených päť variant (3,47 %, n = 144). Celkový záchyt patogénnych variant metódami MLPA a CMA vrátane konfirmačných vyšetrení patologického karyotypu je 14 (5,14 %) a 17 (6,25 %, n = 272) (tab. 5). Molekulárne cytogenetickým hodnotením vzoriek s fyziologickým karyotypom (alebo neúspešným chromozomálnym vyšetrením – zlyhanie kultivácie), boli spolu s patogénnymi variantami zachytené i varianty neznámeho významu (VOUS – variant of unknown significance) – metódou MLPA boli zachytené dve VOUS varianty u jednej vzorky a po jednej VOUS variante u piatich vzoriek (n = 144), metódou CMA u jednej vzorky štyri VOUS varianty a po jednej VOUS variante u siedmich vzoriek (n = 111). Z týchto zachytených variant, v troch prípadoch bola VOUS varianta zaznamenaná oboma metódami (podrobnejší zoznam záchytu VOUS variant u jednotlivých plodov tab. 6).

Diskusia

Najväčšiu diagnostickú výťažnosť vo vyšetrovanom súbore plodov mala metóda CMA (tab. 5), čo potvrdzujú skúsenosti zaznamenané v dostupnej literatúre (tab. 7). Tieto výsledky len podporujú odporučenie, používať techniku CMA ako prvotný testovací krok v prenatálnej diagnostike. Rozdiel medzi záchytom metódou MLPA a metódou CMA tvoril 3,73 %. Pridaná hodnota metódy MLPA voči karyotypu je 3,47 % (n = 255) a u CMA je to 7,21 % (n = 255). Výhodou karyotypizácie je záchyt balansovaných zmien, ktorý v tomto súbore tvoril 1,08 % (n = 922).

Najväčší benefit priniesla analýza molekulárne cytogenetickými metódami v indikačnej skupine s mnohopočetnými vrodenými poruchami – 21,42 % v porovnaní so záchytom izolovaných porúch 5,08 %. Na základe zistení z retrospektívnych analýz sa v 4,5–15 % prípadov zistila prítomnosť chromozómových abnormalít u izolovaných porúch [12,18,19] a 15–38 % prípadov s mnohopočetnými poruchami, zistenými ultrazvukovým vyšetrením [12,20–22].

Celkovo zachytených patogénnych variant metódami MLPA a CMA (MLPA – 144 plodov, CMA – 111 plodov) bolo osem (7,21 %, n = 111) a metódou MLPA bolo z týchto ôsmich patogénnych variant zachytených iba päť variant (3,47 %, n = 144) a u 4,31 % (11/255) plodov varianty s nejasným významom, z celkového súboru 255 pacientov s už cytogeneticky overeným fyziologickým karyotypom. Tieto hodnoty sú konzistentné s nálezmi publikovanými v dostupnej literatúre, ktorej súhrn je v tab. 7. Z týchto štúdií je jasné, že technika CMA je vhodná na skríning celého genómu, vďaka čomu sa zvyšuje záchyt patologických CNV variant. Avšak aj napriek všetkým vyššie uvedeným zisteniam, má klasické cytogenetické hodnotenie karyotypu nenahraditeľné miesto v celom hodnotiacom procese. A to hlavne pre detekciu balansovaných prestavieb [23], mozaík [24] a polyploidií [25], ktoré sú cytogenomickými metódami (MLPA, CMA) náročne identifikovateľné a častokrát nezistiteľné.

Prínos a problematické hodnotenie VOUS variant

Významnou súčasťou výsledkov prenatálneho testovania sú VOUS varianty. Detekcia týchto variant je častá u genetických testov, ktoré zahŕňajú podrobnejšiu a komplexnú analýzu genómu [31]. Aplikácia CMA u plodu sa súčasne stretáva s výhradami pre nálezy VOUS variant, ktoré sú práve v prenatálnej diagnostike problematické na klinickú interpretáciu. U niektorých variant, ktoré boli skôr hodnotené ako patogénne sa ukazuje, že sa vyskytujú aj u zdravej populácie. Jedná sa o varianty, ktorých klinický dopad je veľmi variabilný a penetrancia neúplná. Často sú takéto varianty zdedené od zdravých rodičov. Jedným z príkladov je delécia v oblasti 15q11.2 zahŕňajúca 4 gény – NIPA1, NIPA2, TUBGCP5, CYFIP1 – označovaná ako mikrodelečný syndróm (OMIM *615656 – Chromosome 15q11.2 deletion „syndrome“) [32,33]. Dopady tejto CNV nie sú jednoznačné a v súčasnosti sa odborná verejnosť prikláňa ku klasifikácii „vysoko frekventná varianta s nízkou penetranciou“ (high-frequency low-penetrant variant). Predpokladá sa však, že prítomnosť tejto delécie dopĺňa ďalšie genetické (model „second-hit“, polygénna dedičnosť) a environmentálne faktory [34,35]. Efekty takýchto delécií v oblasti 15q11.2 môžu smerovať k pochopeniu dôležitých biologických mechanizmov, ale ich veľkosť je príliš malá na to, aby samostatne mohli vypovedať o relevantnosti hodnotenia klinického dopadu u jednotlivca [36]. Rovnako sa to týka aj nálezu mikroduplikácie 16p11.2 [37], ktorá v tejto práci bola klasifikovaná ako patogénna varianta, ale v súvislosti s prenatálnou diagnostikou sa odborná verejnosť začína prikláňať ku klasifikácii VOUS varianty, práve z dôvodu neúplnej penetrancie tejto varianty, častokrát zdedenej od zdravého rodiča.

Záver

V tejto práci sa potvrdila vyššia úspešnosť záchytu patologických CNV variant metódou CMA než metódou MLPA. Metódou MLPA sa nezachytili tri patogénne varianty, ktoré však boli zachytené CMA. Firma MRC Holland síce ponúka probemixy, ktorými by tieto varianty boli zachytené, ale v čase prebiehajúcich analýz Ústav lekárskej genetiky týmito probemixami nedisponoval, keďže by bolo finančne a časovo veľmi náročné disponovať všetkými dostupnými probemixami. Táto metóda je na druhej strane vhodná na overovanie patologických nálezov zistených prostredníctvom CMA.

Cytogenetickým hodnotením karyotypu bolo zachytených 10 balansovaných aberácií (1,08 %), z ktorých však ani jedna nebola zachytená použitými cytogenomickými metódami, keďže je to limitujúci technologický faktor oboch metód (MLPA a CMA). Vynechaním konvenčnej cytogenetiky by tak uniklo až 1 % aberácií, vďaka ktorým bolo možné určiť riziko genetickej nestability v rodine a ďalšie kroky z toho vyplývajúce.

V neposlednom rade má CMA vyšší podiel záchytu VOUS variant, ktoré do značnej miery komplikujú klinickú interpretáciu. Avšak na druhej strane sú zdrojom nového poznania. V tejto práci sa cytogenomickými metódami celkom zachytilo 15 variant u 11 plodov (n = 255). Záchyt patologických variant v skupine s izolovanými poruchami bol nižší než v skupine s mnohopočetnými vrodenými poruchami (5,08 vs. 21,42 %).

Aj napriek moderným medicínskym a laboratórnym diagnostickým technikám je pre mnoho vrodených defektov spôsob dedičnosti a príčina zatiaľ stále neznáma, ale rovnako sa mení aj klasifikácia už známych variant a odporučenia na ich interpretáciu, špeciálne v prenatálnej diagnostike.

ORCID autorov

A. Štefeková 0000-0003-4110-6680

P. Čapková 000-0002-5746-8670

V. Curtisová 000-0001-7829-2881

Z. Spurná 0000-0002-2533-0765

M. Procházka 0000-0002-9815-9401

R. Vrtěl 000-0002-2254-8099

Doručené/Submitted: 7. 3. 2023

Prijaté/Accepted: 20. 3. 2023

Mgr. Andrea Štefeková

Ústav lékařské genetiky

LF UP a FN Olomouc

Zdravotníků 248/7

779 00 Olomouc

Andrea.Stefekova@fnol.cz