Možnosti neinvazivní diagnostiky a monitorace karcinomů močového měchýře

Overview

Uroteliální karcinom (TCC) je onemocnění s vysokým počtem recidiv po iniciální léčbě a s tendencí k progresi při recidivě. Výraznějším problémem než incidence je tak prevalence tohoto onemocnění podmíněná vysokou četností recidiv povrchových nádorů. Pečlivé a dlouhodobé sledování pacientů s tímto onemocněním je tedy nezbytné. V současné době je standardní metodou monitorování pacientů s TCC cysto-skopie, která je invazivní, časově náročná, drahá a pro pacienta většinou velmi nepříjemná. Autor se ve své práci zabývá současnými možnostmi neinvazivní diagnostiky a monitorování TCC z pohledu možnosti cystoskopie buď úplně nahradit, nebo alespoň umožnit prodloužení intervalů mezi cystoskopickými kontrolami u nemocných s TCC. Jsou hodnoceny dosavadní výsledky (senzitivita, specificita) testů, které detekují uroteliální nádory většinou na základě vyšetření moči, ať už se jedná o detekci tumor specifických antigenů v moči, hodnocení antigenů na povrchu buněčných elementů v moči nebo detekci genetických abnormalit na subcelulární úrovni. V závěru jsou uvedeny i vlastní zkušenosti s prováděním Fluorescenční in situ hybridizace.

Klíčová slova:
uroteliální karcinom, neinvazivní diagnostika, nádorové markery

Karcinom močového měchýře (KMM) tvoří cca 4,5 % všech maligních onemocnění v dospělém věku u obou pohlaví (u mužů 6,6 % všech malignit, u žen 2,4 %). Muž­ská predominance je cca 3 : 1. U mužů se jedná o čtvrtou nejčastější malignitu (po karcinomu prostaty, plic a kolorekta, u žen je karcinom močového měchýře na devá­tém místě co do četnosti výskytu malignit) [1]. Jde o nádory vyššího věku, průměrný věk při záchytu onemocnění je asi 65 let. Na rozsáhlých statistikách, které hodnotí období posledních 30 let a srovnávají i např. jednotlivá pětiletá období mezi sebou, je patrný jednak nárůst celkové incidence tohoto onemocnění, ale i např. posun průměrného věku záchytu do niž­ších věkových kategorií, takže s nádorem měchýře se můžeme setkat i u jedinců mladších 40 let. V ČR byla podle po­sledních dostupných údajů NOR z r. 2008 incidence 35,92/100 000 u mužů a 13,54/100 000 u žen. Mortalita narůstá v posledních desetiletích poměrně málo. V roce 2008 činila standardizovaná morta­lita 11,82/100 000 u mužů a 4,93/100 000 u žen [2]. Výraznějším problémem než incidence je prevalence onemocnění podmíněná vysokou četností recidiv povrchových nádorů.

Uroteliální karcinom (TCC) je onemocnění s vysokým počtem recidiv po iniciální léčbě (70–80 %) a s tendencí k progresi při recidivě (30 %) [3]. Pečlivé a dlouho­dobé sle­dování pacientů s tímto onemocněním je tedy nezbytné. Ke standardním metodám mo­nitorování pacientů s TCC patří cysto­sko­pie. Toto vyšetření je inva­zivní, časově ná­ročné, drahé a i při použití flexibilních pří­strojů pro pacienta většinou velmi nepříjemné.

Z těchto důvodů jsou vyvíjeny četné snahy o nalezení neinvazivní metody schopné spolehlivě detekovat uroteliální nádory močového měchýře, a nahradit tak endoskopické vyšetření.

Neinvazivní diagnostika a monitoro­vání TCC je vysoce atraktivní variantou pro lékaře i pacienty. Metoda by měla být ne­invazivní, levná, snadno proveditelná a natolik specifická a senzitivní, aby mohla cystoskopii buď úplně nahradit, nebo alespoň umožnit prodloužení intervalů mezi cystoskopickými kontrolami u ne­mocných s TCC.

V poslední době byla díky pokrokům v oblasti molekulární biologie vyvinuta řada testů, které detekují uroteliální ná­dory na základě pouhého vyšetření moči.

Některé jsou založeny na detekci tumor specifických antigenů v moči, jiné hodnotí antigeny na povrchu buněčných elementů v moči nebo detekují genetické abnormality na subcelulární úrovni.

MOŽNOSTI NEINVAZIVNÍ DIAGNOSTIKY KARCINOMŮ MOČOVÉHO MĚCHÝŘE

Cytologické vyšetření moči

Hodnotí se jednotlivé uroteliální buňky nebo jejich shluky uvolněné buď spontánně do moči, nebo získané aktivním proplachem močového měchýře. Základy onkologické cytologie moči se datují od r. 1856, kdy byla publikována práce zabývající se charakteristikou normálních a nádorových buněk v moči pacientů s nádory močového měchýře [4]. V souvislosti s rozvojem nových technologií v mi­nulém století – zejména v barvicích meto­dách – došlo k zařazení cytologie moči mezi základní a standardně používané diagnostické postupy.

Při vyšetření spontánní moči je senzitivita cytologie udávána 31–90 % [5]. Konkrétní hodnota senzitivity je závislá na stupni histologické diferenciace nádoru (3–22 % pro nádory G1, 10–61 % pro G2 a 32–90 % pro G3). Velký význam má cytologie především při detekci tumoru in situ (Tis), který je endoskopicky obtížně detekovatelný. Senzitivita cytologie ze spontánní moči se u TIS udává mezi 60 a 73 %) [6]. Na jedné straně je velkou výhodou cytologie její vysoká specificita, která se pohybuje mezi 81 a 100 %, na druhé straně je problémem nízká senziti­vita, hlavně u dobře diferencovaných nádorů, jejichž buňky mají obvykle mikro­skopicky téměř normální vzhled. Naopak u uroteliálních karcinomů 2. a 3. stupně nacházíme v sedimentu buňky s typickými znaky malignity, což vede k podstatně vyšší senzitivitě metody [7]. K hodnocení nálezu je používaná pětistupňová škála podle Papanicolaua (PAP I, II – negativní nález, PAP III – suspektní nález, PAP IV, V – pozitivní nález), nezbytnou součástí hod­nocení však musí být i písemný komentář, který musí obsahovat informace o validitě vzorku (obsah buněk, event. cytolýza, překrytí erytrocyty nebo zánětlivými buňkami), hodnocení z hlediska onkolo­gické cytologie (suspektní nebo nádorové buňky přítomny, či nepřítomny) [8]. Odběr proplachové tekutiny aktivním proplachem při cystoskopii vede k odloučení většího počtu nádorových buněk v porovnání se spontánní močí, což by mělo vést ke zvýšení senzitivity až na 75 % detekce TCC [9]. Pozitivní výsledek proplachové cyto­logie je udáván 10 % u nádorů G1, 50 % u G2 a 90 % u G3. U Tis je senzitivita 80–90 % [10]. Nevýhodou poplachové cytologie je její invazivita (zavedení rigidního cystoskopu). Některé publikace však signifikantní rozdíl mezi vyšetřením spontánní moči a proplachu močového mě­chýře nepotvrzují [11].

Významným limitujícím faktorem cytologického vyšetření je jeho subjektivita podmíněná zkušenostmi a schopnostmi cytopatologa. Tento faktor by mohl být eliminován pomocí systému Quanticyt, který vychází z karyometrické analýzy a hodnotí tvar jádra a obsah DNA. Cílem je objektivizace hodnocení nálezu v proplachové cytologii. Určitou nevýhodou této metody je potřeba přítomnosti většího množství buněk ve vyšetřovaném vzorku, což v praxi není vždy splněno [12]. Poža­davek na vyšetření proplachové tekutiny a nikoli spontánní moči vyčleňuje tuto metodiku z oblasti neinvazivní diagnostiky.

METODY DETEKUJÍCÍ NÁDOROVÉ ANTIGENY V MOČI

Nuclear matrix protein 22 (NMP22)

Nukleární matrix byla jako základní strukturální element jádra poprvé popsána v roce 1974 [13]. Tato nechromatinová struktura podporuje zachování tvaru jádra, podílí se na organizaci DNA, plní funkci při replikaci DNA, transkripci a tvorbě RNA. NMP-22 je jaderný protein mitotického aparátu zajišťující správnou distribuci chromatinu do dceřinné buňky. Intra­celulární hladina NMP 22 je u nádorových buněk 25× vyšší než u normální buněčné uroteliální populace [14]. NMP-22 je uvolňován z buněčného jádra maligních buněk během jejich apoptózy. Takto uvolněná bílkovina je přístupna snadné de­tekci z moči pomocí dvou monoklonálních protilátek na principu kvantitativní enzymové imunoanalýzy s imunosorbentem vázaným na pevné fázi.

V řadě publikovaných studií byla udávána senzitivita 42–85 %, specificita 60–95 % [15–19]. Např. výsledky, které publikovali Grossmann et al u 1 331 vy­šetřovaných pacientů, ukázaly senzitivitu 55,7 % a specificitu 85,0 %. Cytologické vyšetření u stejného souboru přineslo senzitivitu 15,8 % a specificitu 99,2 %. Kombinace NMP22 + cystoskopie vedla k detekci 99,0 % nádorů oproti 91,3 % detekcí pouhou cystoskopií. NMP22 je snadno proveditelný test, který má lepší senzitivitu než močová cytologie, je senzitivní i u dobře diferencovaných nádorů a není ovlivněn BCG instilacemi [20].

Bladder Tumor Antigen Test (BTA)

Tato vyšetření jsou charakterizována detekcí antigenu v moči pomocí mono­klonální protilátky připravené na myších imunizovaných proteiny z moči pacientů s TCC. Antigen (bladder tumor antigen) je ve své podstatě human complement factor H-releated protein (hcfHrp – BTA) vy­značující se podobnou strukturou a funkcí jako komplement-faktor H. Během vzniku a růstu tumoru zabezpečuje hcfHrp to, že chrání tumor před imunitním systémem hostitele. Na základě tohoto testu byly do praxe uvedeny dvě variace – BTA Stat a BTA TRAK test.

BTA Stat test

Základem metodiky tohoto kvalitativního vyšetření je jednokroková rychlá imuno­chro­matografická esej pro detekci bladder tumor antigenu (BTA). Provedení testu samotného je velice jednoduché: 3–5 ka­pek čerstvé moči je přidáno na kazetovou malou membránu. Pokud dojde do 5 minut k zčervenání pásku, je test pozitivní. Provedení ještě jedné kontroly nás ujistí o správnosti výsledku testu. Senzitivita BTA Stat testu je udávána mezi 53 a 83 % a je přímo úměrná stupni dife­renciace tumoru. Většinou je senzitivita vyšší než u standardního cytologického vyšetření. Specificita je udávána od 54–93 % [21–23]. Nevýhodou je, že uro­infekce a přítomnost litiázy může vést až v 62 % k falešně pozitivním výsledkům BTA testu. Četnost falešně pozitivních výsledků a nízká prediktivní hodnota do jisté míry limituje využití BTA Stat testu ke screeningu symptomatických pacientů. Na druhou stranu má jistě své místo v monitorování pacientů s TCC a při screeningu symptomatických pacientů s vysokým rizikem onemocnění [24,25].

BTA TRAK test

Je základní a pro laboratoř určená forma BTA testu, rovněž zaměřená proti hcfHrf--related proteinu. Oproti single step kvalita­tivnímu BTA Stat testu je BTA TRAK kvantitativní two step-ELlSA-esej s pevnou fází. Dalším rozdílem je, že u BTA Stat testu musíme užít vždy čerstvou moč, kdežto u BTA TRAK testu může být moč uchová­vána až jeden týden při teplotě 4 °C. Sen­zitivita tohoto testu je udávána 58–78 %, specificita 51–79 % [23,26]. Pokud jde o využití BTA TRAK testu ke sledování pacientů s Ta a T1 uroteliálními nádory močového měchýře, byly učiněny závěry, že průměrná hodnota BTA TRAK testu byla signifikantně vyšší u pacientů s recidivou uroteliálního nádoru než u nemocných bez recidivy. Nebyl prokázán přínos stanovení individuálních prahových hodnot vycházejících z hladiny markeru před zahájením primární léčby, respektive po jejím ukončení. U vybraných pacientů s nízkou hodnotou markeru lze uvažovat o pro­dloužení intervalu do příští cystoskopické kontroly [27].

BLCA4

Na základě analýz tkáně uroteliálních karcinomů močového měchýře a zdravého urotelu byly detekovány hlavní složky komplexu jaderné bílkovinné matrix. Tento komplex jaderné bílkovinné matrix u TCC se sestává ze šesti různých proteinů: BLCA 1–6, které jsou specifické pouze pro maligní tkáň, naproti tomu ve zdravé tkáni se vyskytují tři jiné proteiny bílkovinné matrix, a to BLNL 1–3 [28,29]. Byla prokázána signifikantně vyšší hladina BLCA-4 v moči pacientů s TCC a předpo­kládá se, že tento marker by mohl dosáhnout vyšší specificity než ostatní testy, je však nutno potvrzení v klinických studiích.

Fibrinogen/fibrin-degradační produkty (FDP)

Výzkum FDP v moči jako markerů KMM probíhá od roku 1970. Fibrinogen/fibrin--degradační produkty jsou bílkovinné fragmenty vzniklé působením plazminogenu na fibrin a fibrinogen. Vaskulární endo­teliální růstový faktor (VEGF), který je produkován buňkami TCC, vede ke zvýšené permeabilitě cév v okolí nádoru, a tím ke zvýšené koncentraci proteinů v plazmě. Fibrinogen se mění na fibrin, který je dále štěpen plazminem na fibrin degradační produkty, které jsou detekovatelné pomocí monoklonálních protilátek.

Accu-Dx-test (Intracel, Inc., Rockville, Maryland) umožňuje kvantitativní měření fibrin-degradačních produktů v moči a výsledek testu je k dispozici do 10 minut. Tato esej je založena na hema­glutinační imunoinhibiční reakci. V lite­ratuře udávaná senzitivita je vyšší než u cytologie (52–70 %), specificita je udávána 68–91 % [30,31].

Kyselina hyaluronová (HK) a hyaluronidáza

Kyselina hyaluronová (KH) je nesulfurikovaný glykosaminoglykan, který je součástí extracelulární matrix a zprostředkovává adhezi maligních buněk a jejich migraci. KH se může vázat na receptory na povrchu buněk, nejčastěji s CD44, a tímto regulovat buněčnou adhezi, proliferaci a migraci. Fragmenty KH, které vznikají degradací enzymem hyaluronidázou, stimulují angiogenezi. V případě TCC se zdá, že buňky TCC indukují tvorbu KH ve fibroblastech. Hyaluronidáza je endoglykozidáza štěpící KH. U člověka je produkována především v játrech. Produkce hyaluronidázy maligními buňkami karcinomu měchýře je závislá přímo úměrně na invazivním potenciálu TCC. Při srovnání HK a hyaluronidázy je senzitivita hyaluronidázy nižší při detekci dobře diferencovaných TCC než pro průkaz hůře diferencovaných karcinomů a naopak. Kyselina hyaluronová i hyaluronidáza mohou být detekovány v moči pomocí eseje na bázi podobné ELISA. Existuje i kombinace obou metod označovaná jako HA-Haase test.

Publikované výsledky udávají celkovou senzitivitu 91 % (G1 86 %, G2 95 %, G3 93 %) [32], resp. senzitivitu 91 % a specificitu 84 % [33].

Cytokeratiny (CK)

CK jsou ve vodě nerozpustné proteiny intermediálních filament tvořících cyto­skeleton buňky. Jsou produkovány především buňkami epitelu. V lidských buňkách bylo popsáno více než 20 různých typů CK, a tak může být určitý epitel charakterizován specifickou kombinací cytokeratinové exprese [34]. Epiteliální buňky tvoří od 2–10 podtypů CK a výsledná kombinace určuje jak typu epitelu, tak i stupeň jeho diferenciace, čehož je možno využít při diagnostice malignity. Pří destrukci buňky dochází k uvolňování fragmentů cytokeratinu do séra a do moči, kde je možno je laboratorně detekovat. Zvýšená exprese CK byla pozorována i u pacientů s KMM, ale ty nejsou specifické pro uroteliální nádory.

Existuje několik diagnostických laboratorních postupů založených na detekci CK fragmentů v moči pacientů s KMM.

CYFRA 21-1: elektrochemoluminiscenční imunoesej, založená na detekci fragmentu cytokeratinu 19 z moči i séra pomocí dvou monoklonálních protilátek (BM 19,21 a KS 19,1). Cytokeratin 19 je přítomen jak v normálních uroteliálních buňkách, tak i u nádorově změněného urotelu. V některých publikacích je senzitivita udávána 84–97 %, nevýhodou je vysoký počet falešně pozitivních výsledků u pacientů s jinými urologickými onemocněními (urolitiáza, infekce, BCG terapie) [35,36]. Jako nejlepší koncentrace k detekci primárních karcinomů močového měchýře je udávána hodnota 4,9 µg/l (senzitivita 79,3 %, specificita 88,6 %), optimální práh k detekci recidivy TCC je udáván 4,04 µg/l (senzitivita 76,2 %, specificita 84,2 %). Cyfra 21-1 nabízí výrazně vyšší senzitivitu při detekci tumorů G1 ve srovnání s cytologickým vyšetřením moči [37]. Existují však i práce, které možnost praktického využití této metody k neinvazivní diagnostice monitorování pacientů s TCC zpochybňují [38].

Tissue Polypeptide specific Antigen (TPS) Assay – ELlSA esej: vyráběná firmou IDL Biotech a založená na TPS prot­i­lát­kách, které se přednostně váží na CK fragmenty 18 a 8. V publikovaných pracích je udáváno, že je pozitivní korelace s veli­kostí, stupněm diferenciace a sta­diem onemocnění. Sen­zitivita je udávána 73 % pro nově detekované a 50 % pro recidivující tumory, specificita 70 %, resp. 63 %. Při 95% specificitě je senzitivita pro nově detekované tumory 33 % a pro recidivy 18 %. Nízká senzitivita a specificita ­u recidivujících nádorů je vysvětlována především rozdílem v bio-lo­gických vlastnostech nádorů [39].

Tissue Polypeptide Antigen (TPA): je součástí cytoskeletonu normální epiteliální buňky. TPA esej (Sangtec Medical, Swe­den) je zaměřena na detekci cytokeratinových fragmentů 8, 18 a 19.

Při hodnocení senzitivity a specificity sérového TPA bylo zjištěno, že hladiny TPA korelují se stadiem tumoru, stupněm histologické diferenciace a se stadiem diseminace při iniciálním vyšetření tumoru, ale nejsou spolehlivé k detekci nebo monitoringu relapsu onemocnění [40]. Celková senzitivita TPA je 50 %, specificita 85 % u pacientů s anamnézou TCC. Kombinace TPA a močové cytologie zvyšuje celkovou senzitivitu až na 80 %. Proto je doporučováno využití TPA v kombi­naci s jinými diagnostickými modalitami – zejména s močovou cytologií [41].

Cytokeratin 20 Assay (CK 20): se vy­sky­tuje selektivně v epiteliálních buňkách gastrointestinálního a močového traktu. Genovou přítomnost CK 20 je možno stanovit z buněk močového sedimentu pacientů s KMM pomocí RT-PCR metodiky. Všeobecná senzitivita je udávána až 86,7 %, specifita 96,7 % [42].

UBC ELlSA Test (UBC IRMA): kvantitativní test vyvinutý k detekci KMM. Jedná se o ELISA metodiku umožňující detekovat ve vodném prostředí rozpustné fragmenty CK 8 a CK 18. Esej je dvoustupňová a využívá pevné fáze. Senzitivita je udávána v rozsahu 40–81 %, specificita 65–95 % [22,23]. Pokud jde o využití k detekci recidivy onemocnění, byla zjištěna velmi nízká senzitivita UBC IRMA testu (12,1 %), proto není doporučeno využití tohoto testu ke snížení četnosti cystoskopických kontrol při sledování pacientů s TCC [43].

UBC Rapid Test: je určen k in vitro kva­li­tativnímu měření fragmentů CK 8 a CK 18. Pozitivní výsledek je vyjádřen barevnou změnou testovacího proužku, který v případě pozitivního výsledku ztmavne. Tento test je srovnatelný svým použitím s BTA Stat testem. V publikovaných studiích je udávána senzitivita 49–78 % a specificita 79–97 % [23,44].

TESTY DETEKUJÍCÍ BUNĚČNÉ ABNORMALITY NEBO NITROBUNĚČNĚ VÁZANÉ ANTIGENY

Stanovení telomerázové aktivity

Telomery jsou koncové struktury chromozomu, které jsou u člověka tvořeny stovkami až tisíci opakujících se identických sekvencí TTAGGG. Jejich funkcí je stabilizovat a chránit chromozomy před spojením, rekombinací jejich ramének a přichycení se pomocí nukleární matrix k jaderné membráně. Při každém buněč­ném cyklu dochází ke zkracování konců telomer ztrátou 50–200 nukleotidů. Po zkrácení na kritickou délku, při které se buňka již dále dělit nedokáže, je de­struována mechanizmem apoptózy [45]. K základním znakům malignity patří naopak schopnost prakticky neomeze­ného buněčného dělení a to je umožněno zachováním délky konců telomer. Hlavním mechanizmem zachování délky telomer je působení ribonukleoproteinu s aktivitou reverzní transkriptázy – telomerázy. Telo­meráza se připojuje k TTAGGG sekvencím, tím prodlužuje délku telomery a zvyšuje stabilitu chromozomu. Telomeráza je inaktivní v normálním lidské epitelové tkáni, ale při vzniku malignity dochází ke její aktivaci [46]. U přibližně 80 % pacientů s nádorem močového měchýře je možno detekovat telomerázovou aktivitu v moči [47,48]. Aktivitu telomerázy je možno měřit pomocí TRAP (Telomeric Repeat Amplifi­cation Protocol) [49] nebo vyšetřo­váním komponent telomerázové RNA [50]. U metody TRAP je aktivní telomeráza extra­­hována ze vzorků tkáně nebo odlou­če­ných buněk. TTAGGG telomerové sek­vence jsou syntetizovány in vitro a namnoženy pomocí PCR (Polymerase Chain Reaction), pro­dukty jsou pak vizualizovány.

Publikované práce udávají senzitivitu metody 70–90 % a velmi variabilní spe­cificitu, která je udávána až 99 % [30,47,48,51,52]. Limitací metody TRAP je nutnost zpracování vzorku moči do 24 hod a přítomnost alespoň 50 buněk produkujících telomerázu.

Senzitivitu je možno zvýšit detekcí telomerázové RNA v moči (hTR – human telomerase RNA; utery – human telome­rase reverse transcriptase). Některé studie udávají senzitivitu až 95 % (75% pro G1) a specificitu 94 % [53].

Detekce chromozomálních abnormalit – analýza mikrosatelitů

Mikrosatelity jsou opakující se DNA sekvence několika nukleotidů přítomné v celém geonomu. Změny těchto sekvencí (ztráta hererozygozity – LOH) avizují gene­tickou nestabilitu buňky. Byly pozorovány změny na 4., 8., 9., 11., 17. a 18. chromozomu, což vede k deleci tumor supresoro­vého genu p16 a p53 na 9. a 17. chromozomu.

Jako substrát se používá DNA extrahovaná z odloučených buněk močovéhosedi­mentu, která je testována na souboru 24 markerů lokalizovaných na různých chromozomech. LOH-detekce je založena na rozdílu výsledků testu genotypu získa­ného z krve („normální genotyp“) a genotypu získaného z DNA odloučených buněk močového sedimentu („maligní genotyp“). Je udávána senzitivita 58–87 %, v kombinaci s močovou cytologiíí je senzitivita 88 % a specificita 97 %. Rovněž byla popsána korelace mezi četností alterací mikrosatelitů, stadiem a stupněm diferenciace nádoru. Průměrná četnost alterací na locus je 27,4 % u nádorů G3, 19,3 % u nádorů G2 a u nádorů G1 nebyly alte­race detekovány. U invazivních nádorů je udávána četnost alterací 26,5 % a u ná­dorů superficiálních 12,3 % [54–57].

ImmunoCyt

ImmunoCyt vyráběný firmou Diagno-Cure Inc. (Sainte Foy, Que., Canada) kombinuje techniku standardní cytologie s imunofluorescencí. Tento test je někdy považován spíše za pomocnou metodu pro cytologii než za samostatnou molekulární esej. Jsou využívány tři monoklonální fluorescenční protilátky detekující odpovídající antigeny: 19A211 identifikuje přítomnost povrchového buněčného sialoglykoproteinu s vysokou molekulární hmotností, který se vyskytuje pouze na nádorových buňkách, častěji u povrchových forem KMM s níz­kým gradem. 19A211 antigen má 77% senzitivitu u povrchových KMM (TaT1), ale jen 10% senzitivitu u T3–T4 KMM.

M344 a LDQ10 jsou značeny fluorescinem a jsou namířeny proti skupině mucinů, které jsou vyjádřeny na většině maligních buněk KMM, ale nikoli na buňkách zdravého urotelu. Výhodou ImmunoCyt testu je vysoká schopnost detekce dobře diferencovaných tumorů s nízkým gradingem [58]. Testy však vyža­dují značnou erudici v práci s fluores­cenčním mikroskopem, což ztěžuje široké využití v rutinní praxi. I když senzitivita samotného ImmunoCytu je vyšší než sen­zitivita cytologie, kombinace obou těchto metod zvyšuje senzitivitu oproti cytologii samotné nebo samotným molekulárním esejím [59–62].

DALŠÍ MOŽNOSTI NEINVAZIVNÍ DETEKCE KMM

Buněčné adhezivní molekuly a Iigandy

CD44 glykoprotein

CD44 je transmembránový glykoprotein kódovaný skupinou genů lokalizovaných na krátkém raménku 11. chromozomu. Studie zaměřené na hodnocení tkáně tumorů prokazují expresi izoforem CD44 (zejména CD44v8-10) v buňkách a čerstvých biopsiích z různých histologických typů malignit. Izoformy antigenu CD44 jsou detekovány pomocí reverzní PCR. Nevýhodou je nutnost okamžitého provedení PCR po odběru vzorku moči.

Výsledky publikovaných prací ukazují zejména na prognostický význam exprese CD44v8-10 pro prognózu karcinomu mo­čo­vého měchýře. Bylo zjištěno, že vysoké hladiny CD44v8-10 jsou detekovány v nádorových buňkách získaných z moči pacientů s invazivními karcinomy měchýře ve srovnání s hodnotami u pacientů s nádory povrchovými. Je předpoklad, že hladiny CD44v8-10 se mohou stát pro­gnos­tickým predikátorem a indikátorem roz­sahu onemocnění u pacientů s TCC [63].

LEWIS-X antigen

S antigenem X související antigeny jsou buněčné povrchové antigeny složené ze čtyř podskupin, ale jen LEWIS-X vykazuje korelaci s TCC. Za normálních okolností se v urotelu dospělých jedinců nevysky­tuje, ale bývá detekován ve více než 90 % u TCC bez ohledu na staging a grading karcinomu.

Bylo publikováno, že detekce LEWIS antigenu v epiteliálních buňkách z pro­plachové cytologie může dosáhnout sen­zitivity 86 % a specificity 87 % [64]. Golijanin et al detekovali senzitivitu 97 %, specificitu 85 %, pozitivní prediktivní hodnotu 76 % a negativní prediktivní hodnotu 98 % [65].

Molekuly (markery) asociované s karcinomem močového měchýře

Potenciálně významnou skupinou nádo­rových markerů jsou antigeny spojené s přítomností tumoru, resp. TCC. Většina esejí detekujících tyto molekuly je v sou­časnosti ve fázi vývoje a bude potřeba nějakého času k dosažení přesnějších výsledků.

DD23

DD23 je IgG1 mucine-monoklonální proti­látka vážící se s tumorem asociovaným antigenem vyjádřeným v tkáni KMM zhruba v 80 % bez ohledu na stadium a stupeň diferenciace tumoru. Ve zdravém urotelu není přítomen. Detekce DD23 může zvýšit diagnostickou výtěžnost, zejména pokud je používaná v kombinaci s imunocytologií nebo jako součást multiparametrické analýzy. Výsledky vyšetření nejsou ovlivněny předchozí intravezikální terapií [66,67].

Survivin

Antiapoptotický protein, který je produ­kován řadou malignit, vč. urotelu. Ve zdravém urotelu se nenachází, za normálních okolností je exprimován pouze v embryonálním období. V pilotní studii se detekce tohoto proteinu u pacientů s karcinomem močového měchýře za použití imunoeseje blížila 100 % s přibližně stejnou specificitou [68]. Studie prováděné v následujících letech však uváděly hod­noty senzitivity nižší. Senzitivita testu byla nejvyšší u špatně diferencovaných nádorů (68 %), u infiltrujících nádorů (80 %) a u nádorů větších než 5 cm (79 %). Pro 95% specificitu byl stanoven cutt-of na 39,2 pg/ml. Přestože celková senzitivita testu je relativně nízká, stanovení hladiny survivinu v moči může být použito pro předpověď přítomnosti invazivní formy onemocnění a nízké diferenciace tumoru [69]. Podle některých publikací může toto vyšetření predikovat odpověď pacientů na intravezikální terapii [70].

Fluorescenční in situ hybridizace

Je založena na schopnosti dvou komplementárních jednořetězcových DNA spolu navzájem hybridizovat. Pomocí značené sondy DNA lze v analyzovaném materiálu vyhledávat specifické cílové sekvence komplementární se sondou. Sonda je značena fluorescenční barvou, její přítomnost ve zkoumaném materiálu lze snadno sledovat fluorescenční mikroskopií.

Průkaz zhoubného nádoru močového měchýře pomocí UroVysion kitu (Vysis^®--Uro Vysion bladder cancer recurrence kit: Abbot Diagnostics) spočívá v detekci aneuploidie chromozomů 3, 7, 17 a ztrátě specifického signálu 9p21 metodou.

Fluorescenční in situ hybridizace kombinuje čtyři fluorescenční přímo značené DNA sondy. Tři centromerické (CEP 3 SpectrumRed, CEP 7 SpectrumGreen a CEP 17 SpectrumAqua) a jednu lokus specifickou sondu pro gen p 16 (9p21, LSI p16 SpectrumGold).

Na Urologické klinice a Ústavu patologie FN Brno bylo touto metodou vyšetřeno celkem 124 pacientů. Byla odebírána spon­tánní moč na cytologické a moleku­lárně biologické vyšetření, poté byla provedena cystoskopie s odběrem vzorků na histologické vyšetření.

Spontánní moč byla hodnocena:

1. Standardní cytologií na cytospino-vých preparátech barvených dle May-Grun­wald-Giemsy (MGG) a hematoxylin eosinem.
2. Fluorescenční in situ hybridizací.
3. Preparáty pro bioptické vyšetření byly zality do parafinu a následně barveny hematosylin-eosinem.

Všechna tři vyšetření byla provedena a vyhodnocena nezávisle.

Malignita byla histologicky detekována celkem u 59 pacientů (58,4 %), negativní histologický nález byl u 42 pacientů (41,6 %), 23 vzorků bylo nehodnotitelných z důvodu nedostatečné kvality biologic­kého materiálu. Výsledek metody FISH s použitím kitu UroVysion byl pozitivní celkem ve 35 případech (34,7 %). FISH byla pozitivní i u pěti případů, které byly negativní jak v biopsii, tak v cytologii. Naopak negativní výsledek FISH byl zaznamenán u 21 případů, ve kterých byla jasně prokázána malignita.

Senzitivita metody je v našem souboru 58,9 %, specificita 88,1 %. Podle publikovaných prací je udávána pro UroVysion celková senzitivita 70–89 %, specificita 90–97 %. Podle literárních údajů nabízí FISH vyšší senzitivitu než cytologie, bez ohledu na stupeň diferenciace a stadium onemocnění. Současně FISH poskytuje srovnatelnou specificitu [71–74].

Aktuální informace o výsledcích FISH u 4 972 pacientů zazněly na posledním meetingu AUA ve Washingtonu. V Číně byla provedena studie v 52 centrech. Byli vy­šetřováni jednak asymptomatičtí pacienti, jednak pacienti s hematurií. Celková sen­zitivita FISH byla 82,6 %, standardní močová cytologie 32,0 %. Nebyly zjištěny významné rozdíly ve specificitě (94,5 vs 93,8 %). Dílčí senztivity u stadií Ta, T1, T2, T3 a T4 nádorů byly 81,5 %, 81,1 %, 91,2 %, 87,7 % a 94,4 % ve srovnání s cytologií z moči 23,8 %, 30,4 %, 44,5 %, 50,8 % a 66,7 %. Statisticky signifikantní rozdíl byl mezi senzitivitou metody FISH pro low-grade a high-grade tumory (79,0 vs 91,1 %) [75].

FISH není ovlivněna probíhající BCG terapií a může být užita i k monitoraci účinnosti intravezikální terapie u pacientů s povrchovým TCC.

FISH umožňuje rozhodnutí v případech atypického či nejasného cytologického nálezu [76,77]. Detekuje známky malignity na molekulární úrovni, což vede k časnější diagnóze a terapii, a může tak potenciálně dojít k prodloužení přežití [78]. Podle dosud publikovaných údajů se metoda FISH s kitem UroVysion jeví jako perspektivní neinvazivní metoda, která je schopná časně detekovat TCC.

Podle našich vlastních zkušeností je sice FISH relativně jednoduchá technika vhodná k zavedení do cytologických laboratoří, naše dosavadní výsledky však ne­dosahují dostatečné senzitivity – 58,9 % ani specificity – 88,1 %.

ZÁVĚR

Většina v současné době dostupných močových nádorových markerů je využí­vána především pro detekci a monitoring KMM, ale v posledních letech se stále častěji projevují trendy k využití TCC mar­kerů i k predikci dalšího vývoje onemocnění. Většina markerů má vyšší senzitivitu než rutinní cytologie moči, zvláště u karcinomu s nižším gradingem. Novější z močových markerů vykazují korelaci mezi stagingem a gradem onemocnění podobně jako cytologie. Prakticky všechny močové markery mají nižší specificitu než cytologie, zvláště jsou-li užity jednotlivě. Zlepšení specificity vyšetření můžeme očekávat při kombinovaném využití mar­kerů spolu s cytologií či při použití panelu markerů. Do budoucna bude třeba rozdělit markery na skupinu vhodnou k primární detekci malignit horního a dolního močo­vého traktu a na markery vhodné pro detekci recidivy onemocnění. Dále je nutné přesněji posoudit spolehlivost močových markerů v souvislosti s aplikací intravezikální chemo- a imunoterapie.

V EAU Guidelines pro karcinom močo­vého měchýře je uvedeno, že ačkoli exis­tuje celá řada zkoumaných močových markerů TCC, dosud žádný z nich nebyl akceptován jako standardní diagnostická metoda pro klinickou praxi. Tři testy jsou označeny jako nadějné – NMP22, UroVysion a ImmunoCyt. BTA test má limitovanou roli vzhledem k četným falešně pozitivním výsledkům a nízké senzitivitě u nízce dife­rencovaných tumorů [79].

V současné době, kdy žádný z potenciálních markerů primární detekce a moni­torace TCC nedosahuje dostatečné senzitivity a specificity, zůstává z pohledu možnosti neinvazivní detekce močová cytologie zlatým standardem a základním kamenem screeningových metod.

MUDr. Vítězslav Vít

prof. MUDr. Dalibor Pacík, CSc.

Urologická klinika FN Brno

Jihlavská 20, 625 00 Brno

vvit@fnbrno.cz