Polydentátne ligandy pre moderné rádiofarmaka obsahujúce ⁶⁴Cu - review

Molekulárne zobrazovacie techniky (PET, SPECT) zohrávajú dôležitú úlohu v nukleárnej medicíne. ⁶⁴Cu sa javí ako významný rádionuklid, ktorý má potenciál si nájsť svoje uplatnenie v diagnostike ako aj v terapii. Avšak ⁶⁴Cu musí byť do živého organizmu dopravená vo forme rádiofarmaka s cielenou biodistribúciou a dostatočnou in vivo stabilitou. Preto je často rozhodujúcou súčasťou celého rádiofarmaka polydentátny ligand, ktorý tvorí komplex s rádionuklidom medi. Tento prehľadový článok je venovaný najmä klasifikácii ligandov, ktoré dokážu tvoriť stabilné cheláty s ⁶⁴Cu.

Kľúčové slová:
bifunkčné chelátory, polydentátne ligandy, ⁶⁴Cu, moderné rádiofarmaká, review

Úvod

Zobrazovacie techniky nukleárnej medicíny (SPECT, PET) spolu s rádiofarmakami umožňujú vizualizáciu, charakterizáciu a meranie biologických procesov v živých organizmoch na molekulárnej a bunkovej úrovni. Tradične používané izotopy ako ¹⁸F, ¹⁵O, ¹³N a ¹¹C sa zabudovávajú iba do malých molekúl, ktorých často zdĺhavá rádiosyntéza a krátky efektívny polčas výrazne obmedzujú možnosti ich použitia.

S neustálym rozvojom látok s cielenou biodistribúciou ako sú proteíny, peptidy, špecifické protilátky a nanočastice narastá aj potreba nových rádionuklidov s vhodnými vlastnosťami. Medzi takéto rádionuklidy patrí v súčasnosti ⁶⁴Cu s nasledujúcou jadrovou charakteristikou: t_1/2 = 12,7 h; β⁺ 18 %, E_β+ = 653 keV; β^- 39 %, E _β- = 579 keV; EC 44 %, E_EC = 1675 keV ¹. Jej produkcia je možná vo vyhovujúcom množstve a kvalite v cyklotrónoch pomocou jadrovej reakcie ⁶⁴Ni(p,n)⁶⁴Cu ².

Rádiofarmaka obsahujúce ⁶⁴Cu môžeme rozdeliť do dvoch hlavných skupín:

1. špecificky navrhnuté priamo značené malé molekuly
2. biologické nosiče s cielenou biodistribúciou (peptidy, protilátky) značené cez polydentátne ligandy.

Do prvej skupiny patria napr. ⁶⁴Cu-PTSM (pyruvalde-hyd-bis-(N⁴-metyltiosemikarbazón)) (L1) ³ používaný pri meraní krvného prietoku v srdci ⁴ alebo mozgu ⁵, ⁶⁴Cu-ATSM (diacetyl-bis-(N⁴-metyltiosemikarbazón)) (L2) ⁶ používaný na zobrazenie hypoxického tkaniva v tumoroch a srdci, a napokon ⁶⁴Cu-DO2P (1,4,7,10-tetraazacyklododekán-1,7-di(metylfosforečná) kyselina) (L3) ako vhodné diagnostikum pre Dubin-Johnsonov syndróm ⁷ (Obr. 1).

Druhá skupina zahŕňa predovšetkým látky peptidového charakteru, ktoré sa selektívne viažu na dané receptory. Pozornosť sa sústreďuje predovšetkým na receptor pre peptid uvoľňujúci gastrín (GRPR). Pripravených a testovaných už bolo veľké množstvo derivátov bombezínu značených ⁶⁴Cu. Medzi ďalšie cieľové receptory patrí napríklad integrínový α_vβ₃ receptor, na ktorý sa viažu proteíny obsahujúce takzvanú RGD sekvenciu, alebo somatostatínový receptor, ktorý obsahuje väzbové miesto pre oktreotidové analógy. Biomolekuly ako bombezín, RGD peptidová sekvencia a oktreotidové analógy sa po naznačení ⁶⁴Cu stávajú účinnými PET diagnostikami pri rakovine prostaty, neuroendokrinných tumoroch alebo pri sledovaní účinnosti terapie na spomalenie/zastavenie angiogenézy v nádoroch ⁸.

Cieľom tejto práce je poskytnúť logický prehľad polydentátnych ligandov pre ⁶⁴Cu (nazývaných aj bifunkčné chelátory), ktoré sú súčasťou moderných rádiofarmák s cielenou biodistribúciou z druhej vyššie menovanej kategórie.

Prehl‘ad polydentátnych ligandov

Meď sa vo všetkých používaných alebo vyvíjaných rádiofarmakách vyskytuje v oxidačnom stupni II. Oproti Tc, Re alebo Y je vhodnejšia na značenie látok peptidového charakteru, pretože nízkou hodnotou reakčného pH sa dá minimalizovať jej nešpecifická väzba na proteín ⁹. In vivo stabilita komplexu ⁶⁴Cu–(polydentátny ligand)–biomolekula je kľúčovou vlastnosťou pri vývoji, príprave a klinickom použití takýchto rádiofarmák. Preto je kinetická inertnosť a odolnosť voči transchelatácii a redukcii ⁶⁴Cu často dôležitejšia ako termodynamická stabilita daného komplexu ^{10, 11}.

Na základe chemickej štruktúry sa dajú polydentátne ligandy používané v nukleárnej medicíne pri príprave rádiofarmák obsahujúcich ⁶⁴Cu rozdeliť do nasledujúcich skupín:

• acyklické polyaminokarboxylové zlúčeniny
• cyklické polyamíny
• cyklické polyaminokarboxylové zlúčeniny
• premostené cyklické polyaminokarboxylové zlúčeniny
• hexaazamakrobicyklické zlúčeniny
• deriváty triaminocyklohexánu

Acyklické polyaminokarboxylové zlúčeniny

Do tejto skupiny ligandov patria DTPA (L4), EDTA (L5) a ich deriváty (Obr. 2).

Aj napriek tomu, že DTPA a EDTA tvoria s Cu termodynamicky stabilné komplexy s hodnotami logK_cu-DTPA = 21,4 a logK_cu-EDTA = 18,7, v ľudskom sére dochádza k rýchlej transchelatácii medi a vzniku Cu-albumín komplexu ¹². Snaha o zvýšenie stability komplexov zavedením rigídnych chemických skupín do štruktúry ligandu alebo jeho konjugácia s protilátkou neboli úspešné ¹³. Preto sa v súčasnosti už dané ligandy pri vývoji nových rádiofarmák nepoužívajú.

Cyklické polyamíny

Cyklén (1,4,7,10-tetraazacyklododekán) (L6) a cyklám (1,4,8,11-tetraazacyklotetradekán) (L7) (Obr. 3) tvoria s Cu za biologických podmienok kineticky veľmi stále komplexy. Pri inkubácii v sére sa po 48 h uvoľní z komplexu iba 0,5 % Cu. Tieto komplexy majú vyššiu akumuláciu v obličkách, ktorá je spôsobená ich kladným nábojom, a v pečeni dochádza k ich zvýšenej disociácii ¹⁴

Nevýhodou týchto ligandov je nízka efektivita značenia pri príprave rádiofarmák, ktorá dosahuje iba 33 %. Alternatívny a náročnejší postup značenia, pri ktorom sa najskôr pripravil chelát s meďou a až na záver sa chemicky naviazal na protilátku, viedol k celkovej efektivite značenia iba 52 % ¹⁵. Dané nevýhody sa pokúšajú prekonať zástupcovia nasledujúcich skupín ligandov.

Cyklické polyaminokarboxylové zlúčeniny

Táto skupina je odvodená od cyklických polyamínov. Zavedenie karboxymetylovej skupiny umožňuje tvorbu komplexov s vyšším koordinačným číslom. Do danej kategórie ligandov patria DOTA (1,4,7,10-tetraazacyklododekán-1,4,7,10-tetrakarboxylová kyselina) (L8), TETA (1,4,8,11-tetraazacyklotetradekán-1,4,8,11-tetrakarboxylová kyselina) (L9) a NOTA (1,4,7-triazacyklononán-1,4,7-trikarboxylová kyselina) (L10) (Obr. 4).

Cyklické polyaminokarboxylové kyseliny majú dobrú efektivitu značenia rádionuklidmi medi a vyššiu in vivo stabilitu v porovnaní s cyklickými polyamínmi. DOTA bola použitá pri značení viacerých monoklonálnych protilátok a biologicky aktívnych molekúl (Cetuximab, Abegrin, RGD peptid – sekvencia Arg-Gly-Asp a ďalšie). Tieto štúdie však preukázali zároveň aj nešpecifickú akumuláciu ⁶⁴Cu-DOTA-biomolekula v retikuloendotelovom systéme a nižšiu in vivo stabilitu v porovnaní s TETA alebo NOTA ^16,-18. Naviac, neselektivita väzby Cu-DOTA zapríčinila, že sa v súčasnosti používa pri príprave rádiofarmák značených meďou už len ojedinele. Hoci ⁶⁴Cu-TETA komplexy sú stabilnejšie než ⁶⁴Cu-DOTA komplexy, taktiež bola pozorovaná ich in vivo nestabilita. Po intravenóznej aplikácii ⁶⁴Cu-TETA-oktreotid dochádza po 20 h až k 70% transchelatácii ⁶⁴Cu na superoxiddismutázu v pečeni a časť uvoľnej medi sa viaže aj na ceruloplazmín ¹⁹. Bifunkčný chelátor NOTA použil Prasanphanich a kolektív pri značení bombezínového analógu. Dané rádiofarmakum malo najnižšiu akumuláciu v pečeni v porovnaní s DOTA a TETA analógmi ²⁰. Aj keď sa NOTA pôvodne používala pri príprave rádiofarmák obsahujúcich ⁶⁸Ga, dobrá in vivo stabilita ⁶⁴Cu-NOTA komplexu ju predurčujú na širšie uplatnenie pri značení moderných rádiofarmák.

Premostené cyklické polyaminokarboxylové zlúčeniny

Nedávno sa upriamila pozornosť na skupinu takzvaných premostených cyklických polyaminokarboxylových zlúčenín. Hoci meďnaté komplexy týchto zlúčenín majú konštantu stability (logK) podobnú ako ich nepremostené analógy, miera ich in vivo stability je často o niekoľko poriadkov vyššia ²¹. Zástupcovia danej skupiny sú CB-DO2A (4,10-bis(karboxymetyl)-1,4,7,10-tetraazabicyklo[5.5.2]tetradekán) (L11) a CB-TE2A (4,11-bis(karboxymetyl)-1,4,8,11-tetraazabicyklo[6.6.2]hexadekán) (L12).(Obr. 5).

Boswell a kolektív priamo porovnávali biodistribúciu a in vivo stabilitu ⁶⁴Cu-CB-DO2A a ⁶⁴Cu-CB-TE2A s ich nepremostenými analógmi. Premostené komplexy mali lepšiu klírens a vyššiu odolnosť voči transchelatácii medi, ktorú sledovali 4 h po aplikácii: CB-DO2A vs. DOTA = 61 % vs. 90 %; CB-TE2A vs. TETA = 13 % vs. 75 %. Po 20 h od aplikácie bola miera transchelatácie ⁶⁴Cu z ⁶⁴Cu-CB-TE2A komplexu na proteíny v krvi iba 24 % (v prípade ⁶⁴Cu-TETA je to 92 %) ^{22 - 24}. Somatostatínový analóg značený ⁶⁴Cu pomocou CB-TE2A mal vysokú rádiochemickú čistotu, vyššiu afinitu k cieľovému tkanivu a nižšiu akumuláciu v obličkách, pečeni a krvi pri porovnaní s rovnakým somatostatínovým analógom značeným ⁶⁴Cu pomocou TETA ^{25, 26}.

Nevýhodou CB-TE2A je však zložitý postup značenia a citlivosť na reakčné podmienky ²⁷. Problémy súvisiace so značením vyriešila zámena karboxymetylovej za fosfonylmetylovú skupinu a príprava CB-TE2P (1,8-bis(fosfonylmetyl)-1,4,8,11-tetraazabicyklo[6.6.2]hexa-dekán) (L13), ktorý má 90% výťažnosť značenia s ⁶⁴Cu, a CB-TE1A1P (1-fosfonylmetyl-8-karboxymetyl-1,4,8,11-tetraazabicyklo[6.6.2]hexa-dekán) (L14), ktorý dosahuje až 100% výťažnosť pri značení ^{28, 29} (Obr. 6).

Hexaazamakrobicyklické zlúčeniny

Ďalšou skupinou polydentátnych ligandov sú hexaazamakrobicyklické ligandy typu sarcophogine: Sar (L15), DiamSar (L16), SarAr (L17) (Obr. 7).

Pri značení dochádza v priebehu niekoľkých minút k 100% naviazaniu medi (⁶⁴Cu) z roztoku pri 25 °C a v rozsahu pH 4-10. Viaceré práce zaoberajúce sa stabilitou a biodistribúciou komplexov medi so sarcophaginom a jeho derivátmi potvrdili ich stabilitu v ľudskom sére po dobu 7 dní. Dané komplexy mali rýchly klírens z krvi a nízku akumuláciu v orgánoch citlivých na radiačnú záťaž ^{30 - 32}. Hexaazamakrobicyklické ligandy boli použité pri značení protilátok proti karcinómu hrubého čreva a viaceré experimenty na laboratórnych zvieratách potvrdili prednosti týchto ligandov pri vývoji rádiofarmák obsahujúcich meď ³³. Širšie uplatnenie sarcophaginu a jeho derivátov pri príprave rádiofarmák s cielenou biodistribúciou si vyžaduje ešte viacero štúdii zameraných na dlhodobé sledovanie in vivo stability, biodistribúcie a vylučovania.

Deriváty triaminocyklohexánu

Štruktúra týchto ligandov je založená na 1,3,5-triaminocyklohexáne s naviazanými pyridylovými alebo imidazolovými zvyškami na troch aminoskupinách. Park a kolektív študovali vznik a stabilitu komplexu ⁶⁴Cu-tachpyr (N,N’,N’’-tris-(2-pyridylmetyl)-1,3,5-cis,cis-triaminocyklohexán) (L18) (Obr. 8). Skúmaný komplex vykazoval stabilitu v ľudskom sére počas 7 dní ³⁴. Ma a kolektív pripravili niekoľko derivátov základnej štruktúry ligandu. V mnohých prípadoch bola 100% výťažnosť reakcie pri ich značení meďou a mali vysokú odolnosť voči transchelatácii s EDTA alebo TETA ³⁵. Stále však chýbajú údaje o ich biodistribúcii a in vivo stabilite. Snahy použiť deriváty triaminocyklohexánov ako bifunkčné chelátory pri značení peptidov boli zatiaľ neúspešné a sprevádzané viacerými komplikáciami pri samotnej syntéze a následnom značení ³⁶.

Záver

Vývoj rádiofarmák obsahujúcich ⁶⁴Cu zaznamenal v poslednom desaťročí výrazný pokrok. Kľúčovým faktorom v celom procese sa stáva polydentátny ligand, ktorý musí s ⁶⁴Cu pri miernych reakčných podmienkach dostatočne rýchlo a dobre reagovať. Naviac vzniknutý komplex musí byť in vivo stabilný a odolný voči transchelatácii a redukcii. Takéto rádiofarmakum musí mať dobrý krvný klírens a vysokú špecifickú akumuláciu v cieľovom tkanive. Zatiaľ sa javia ako najperspektívnejšie ligandy premostené polyaminokarboxylové zlúčeniny ako CB-TE2A poprípade ich fosfonylmetylové analógy: CB-TE2P, CB-TE1A1P. Ďalšími sľubnými kandidátmi sú aj sarcophagin a jeho deriváty, aj keď si ich širšie uplatnenie bude ešte vyžadovať viacero štúdií biodistribúcie a in vivo stability.

Poďakovanie

Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe zmluvy č. APVV-0204-10 a grantom VEGA MŠVVaŠ č. 1/0664/12.

Roman Staník

Katedra farmaceutickej analýzy a nukleárnej farmácie, FaF UK v Bratislave, Slovensko

stanik@fpharm.uniba.sk