Jednonukleotidová substituce c.645+32C>T v genu APC je nepatogenním polymorfismem s výskytem přibližně u 16 % české populace

Overview

Východisko.
Familiární adenomatózní polypóza je autozomálně dominantně dědičné onemocnění charakterizované predispozicí ke vzniku polypů v tlustém střevě a v rektu a ke kolorektálnímu karcinomu. Příčinou onemocnění jsou zárodečné mutace v genu APC. Cílem studie bylo stanovit frekvenci jednonukleotidové substituce c.645+32C>T v intronu 5 genu APC u pacientů s mnohočetnou střevní polypózou a v obecné populaci a pokusit se objasnit, zda je tato substituce nepatogenním polymorfismem (tj. populační variantou) nebo onemocnění způsobující mutací.

Metody a výsledky.
Frekvence substituce c.645+32C>T v genu APC byla studována v souboru 170 pacientů s fenotypem familiární adenomatózní polypózy nebo její atenuované formy metodou denaturační gradientové gelové elektroforézy a přímou sekvenací. Dále byla frekvence této substituce vyšetřena u souboru 200 neonkologických pacientů pomocí metody alelické specifické polymerázové řetězové reakce. Substituce c.645+32C>T byla zjištěna u 27 ze 170 pacientů s mnohočetnou střevní polypózou (tj. 15,9 %) a dále u 32 z 200 pacientů v kontrolní skupině (tj. 16 %). Rozdíl ve výskytu substituce mezi pacienty s polypózou a kontrolní skupinou nebyl statisticky významný (p = 0,979; test chí-kvadrát).

Závěry.
Jednonukleotidová substituce c.645+32C>T v intronu 5 genu APC je nepatogenním polymorfismem, tedy populační variantou, která se vyskytuje přibližně u 16 % české populace.

Klíčová slova:
familiární adenomatózní polypóza, gen APC, mutace, polymorfismus.

Familiární adenomatózní polypóza je autozomálně dominantně dědičné onemocnění charakterizované predispozicí ke vzniku stovek až tisíců polypů v tlustém střevě a v rektu s počátkem jejich vývoje již v dětském věku a ke kolorektálnímu karcinomu. Příčinou onemocnění jsou zárodečné mutace v genu APC (z angl. „adenomatous polyposis coli“). Mutace v prvních pěti exonech genu APC, exonu 9 a v oblasti 3’ konce genu vedou k fenotypu atenuované formy familiární adenomatózní polypózy, která je spojena s menším počtem polypů (obvykle do 100) a pozdním počátkem jejich vzniku, riziko rozvoje kolorektálního karcinomu je však rovněž vysoké (1). U několika pacientů s klinickým fenotypem atenuované formy familiární adenomatózní polypózy jsme zachytili jednonukleotidovou substituci c.645+32C>T v intronu 5 genu APC. Cílem studie bylo stanovit frekvenci této jednonukleotidové substituce u pacientů s mnohočetnou střevní polypózou v obecné populaci a pokusit se objasnit, zda je tato substituce nepatogenním polymorfismem (tj. populační variantou) nebo patogenní mutací způsobující střevní polypózu.

SOUBOR NEMOCNÝCH A POUŽITÉ METODY

Do studie bylo zařazeno 170 pacientů s fenotypem familiární adenomatózní polypózy nebo její atenuované formy. Od pacientů byl obdržen informovaný souhlas. Substituce c.645+32C>T v genu APC byla detekována metodou denaturační gradientové gelové elektroforézy (DGGE) a/nebo přímou sekvenací v rámci vyšetření 5. exonu a přilehlých intronických sekvencí (2, 3). Sekvence primerů pro detekci pomocí DGGE: „forward primer“ se svorkou: 5’ CCCCGCCCGGCCCGCCCCGCCCCCCGCCCCCCCTCCCGGCCCGCCCCCCTGGCGCCCCGCTACAAGATATTGA TAC TTTTTTA-3’; „revers primer“, 5’ TGTAATTCATTTTAT TCCTAATAGCTC-3’. Sekvence primerů pro detekci pomocí přímé sekvenace: „forward primer“, 5’-TACAAGATATTGATACTTTTT TA-3’; „revers primer“, 5’-TGTAATTCATTTTATTCCTAATAG CTC-3’. Podmínky PCR byly následující: 95 °C 5 min (95 °C 60 s, 52 °C 90 s, 72 °C 90 s)₃₀ 72 °C 7 min. Gradient při DGGE byl 20 : 70 % a délka trvání elektroforézy 2 hodiny.

Dále byla tato substituce vyšetřena u anonymního souboru 200 neonkologických pacientů. Byla navržena metoda alelické specifické polymerázové řetězové reakce (PCR, z angl. „polymerase chain reaction“) pro detekci této substituce. Sekvence primerů byly následující: normální „forward primer“, 5‘-GTTTCTAAGTGA TAAAACAAC-3‘; mutovaný „forward primer“, 5‘-GTTTCTAAG TGATAAAACAAT-3‘; společný „revers primer“, 5‘-TTGCTC AGCAGCCATGATAA -3‘ (obr. 1). Jako kontrola správné amplifikace byl použit pár primerů užívaných pro detekci mutace G20210A v genu pro protrombin: „forward primer“, 5’ TCTAGAAACAG TTGCCTGGC-3’; „revers primer“, 5’ ATAGCACTGGGAGCATT GAAGC-3’. Podmínky PCR byly následující: 94 °C 5 min (94 °C 40 s, 55 °C 40 s, 72 °C 40 s)₃₅ 72 °C 7 min. Fragmenty byly rozděleny elektroforeticky na 5% nedenaturačním polyakrylamidovém gelu a vizualizovány pomocí barvení stříbrem. U vzorků bez substituce byl přítomen fragment pouze ve zkumavce s normálním „forward primerem“. Byl-li pacient heterozygotní pro sledovanou substituci (tj. jednu alelu genu má normální a druhou se substitucí), byl fragment přítomen ve zkumavce jak s normálním, tak s mutovaným „forward primerem“. Fragment pro protrombin, tj. vnitřní kontrola amplifikace, byl přítomen v každém vzorku (obr. 2).

Výsledky

Substituce c.645+32C>T byla zjištěna u 27 ze 170 pacientů s familiární adenomatózní polypózou nebo její atenuovanou formou (tj. 15,9 %) a dále u 32 z 200 pacientů v kontrolní skupině (tj. 16 %). Rozdíl ve výskytu substituce mezi pacienty s polypózou a kontrolní skupinou nebyl statisticky významný (p = 0,979; test chí-kvadrát).

Diskuze

Jednonukleotidová substituce c.645+32C>T v intronu 5 genu APC je relativně často zachycována u pacientů s familiární adenomatózní polypózou nebo její atenuovanou formou. Její patogenní význam není jasný. Z výsledků naší studie vyplývá, že se tato substituce vyskytuje přibližně u 16 % české populace, tedy se stejnou frekvencí jako u pacientů se střevní polypózou. Vzhledem k prevalenci výskytu familiární adenomatózní polypózy včetně její atenuované formy u 1 na 5000 až 7500 jedinců (1) se tedy v případě této substituce jedná o nepatogenní polymorfismus, tedy populační variantu, jejíž nosičství pro příslušnou osobu nepředstavuje zvýšené riziko střevní polypózy.

Zkratky

APC – z angl. „adenomatous polyposis coli“

DGGE – denaturační gradientová gelová elektroforéza

PCR – z angl. „polymerase chain reaction“

Děkujeme RNDr. Janě Zapletalové, Ph.D. za provedení statistické analýzy.

Práce byla podpořena projekty IGA Ministerstva zdravotnictví ČR č. NR/9092-3 a Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy ČR č. MŠM 0021620808.

MUDr. Pavlína Plevová

Oddělení lékařské genetiky FN

tř. 17. listopadu 1790, 708 52 Ostrava

fax: +420 596 917 340, e-mail: pavlina.plevova@volny.cz