Nádory slinivky břišní II.

Overview

Karcinom slinivky břišní patří k nádorům s nejhorší prognózou. Dosud se nepodařilo spolehlivě odhalit rizikové faktory. Vzhledem k tomu, že Česká republika patří ke státům s nejvyšším výskytem tohoto onemocnění na světě, iniciovala Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny studii případů a kontrol nádorů slinivky břišní. Tato studie má odhalit rizikové faktory specifické pro středoevropský region, Českou republiku zvláště.

Výsledky epidemiologické části studie nepodaly vysvětlení relativně vysokého výskytu tohoto nádoru ve střední Evropě. První genetické analýzy přinášejí zajímavé výsledky, které je však třeba potvrdit na větších souborech.

Klíčová slova:
karcinom slinivky břišní, rizikové faktory, genetické analýzy.

Úvod

Česká republika se řadí mezi státy s nejvyšším výskytem nádorových onemocnění na světě. V některých případech patříme do skupiny s absolutně nejvyšším výskytem (4). K těmto nádorům se řadí i nádory slinivky břišní (graf 1, obrázek 2, 3).

Vzhledem k této relativně vysoké četnosti a také vzhledem k tomu, že socioekonomický dopad rakoviny pankreatu je značný zejména díky pozdnímu záchytu a vysoké mortalitě, iniciovala Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny (IARC) studii případů a kontrol nádorů slinivky břišní v České republice s cílem nalézt alespoň potenciální rizikové faktory, které by alespoň částečně objasnily vysoký výskyt těchto nádorů u nás a ve středoevropském regionu.

Udává se, že až 98 % všech nádorů slinivky břišní vychází z z exokrinní části pankreatu, dvě třetiny z nich jsou lokalizovány v hlavě pankreatu (3). Tato lokalizace může vést k relativně časnějšímu záchytu vzhledem k možné blokádě Vaterské papily, může dojít k záměně za tumor Vaterské papily, duodena nebo žlučovodu. Diagnózu lze stanovit zobrazovacími metodami (CT, ERCP), stanovení stagingu se provádí endoultrasonografií (EUS) s aspirační biopsií (FNAB) (8).

V letech 2004–2006 jsme řešili grantový projekt Studie případů a kontrol nádorů pankreatu podpořený prostředky z Interní grantové agentury Ministerstva zdravotnictví ČR (IGA 8090-3). Od roku 2007 řešíme grantový projekt Vliv faktorů životního prostředí a genetické determinanty nádorů pankreatu (genetický profil) IGA 9422-3.

Opět se jedná o studii případů a kontrol, i metodika sběru dat a biologického materiálu je shodná se studií předchozí. Nová studie zdvojnásobí soubor pacientů a kontrol. Vzhledem k zapojení chirurgického pracoviště, které se specializuje na tuto problematiku, je diagnostika v době záchytu přesnější a máme možnost získat i část tkáně z tumoru. Pokračování projektu navýší velikost souborů a soustředí se na genetické analýzy biologického materiálu, především krevních vzorků, následně i tkáně z tumoru.

V roce 2006 jsme publikovali v Praktickém lékaři (5) metodickou část této studie. Článek byl zaměřen na způsob sběru dat a na analýzu faktorů životního stylu a některé choroby ve vztahu k nádorům slinivky břišní. Výsledky naší studie nepotvrdily ani v literatuře uváděné rizikové faktory, což mohlo být způsobeno malým rozsahem souboru.

Metodika

Kontakt na nemocné s nádory slinivky břišní získáváme ze spolupracujícího pracoviště Chirurgické kliniky 2. LF UK a ÚVN Praha, jejíž tým se na léčbu tohoto onemocnění dlouhodobě specializuje. Resekční výkon je jedinou současnou léčebnou metodou, která má potenciálně léčebné výsledky a signifikantně prodlužuje život nemocných (1). Tříleté přežívání po provedené resekci dosahuje 22 %, nejlepších výsledků je pochopitelně dosahováno ve stadiu I. Většina pacientů však spadala dle klasifikace nádorů do stádia III a vyšších (6). Případnou adjuvantní chemoterapii zajišťuje spolupracující onkologické pracoviště.

U nemocných indikovaných k operačnímu řešení karcinomu bylo vyžadováno předoperační provedení ERCP, kontrastního CT vyšetření a EUS s FNAB. K radikálnímu výkonu byli indikováni nemocní ve stadiu I, II a zčásti III, k paliativnímu resekčnímu výkonu pacienti ve stadiu III a IVa bez předoperačně zjištěné angioinvaze (6).

Všichni nemocní, kteří byli indikováni k operačnímu výkonu na Chirurgické klinice 2. LF UK a ÚVN včetně paliativních výkonů, byli zařazeni do studie. Vzhledem k tomu, že primární indikace k výkonům neprobíhá na chirurgické klinice, je možné, že část pacientů, jejichž zdravotní stav či zjevná neresekabilita nepředpokládá možnost operačního výkonu, není odeslána na kliniku, a tedy nemůže být zařazena do studie. Další otázkou je, kolik pacientů s nádorem slinivky břišní nebylo diagnostikováno vzhledem k nemožnosti provedení některých vyšetření pro závažný zdravotní stav nemocných.

Pokud pacienti souhlasí s účastí ve studii, podepíší informovaný souhlas, který obsahuje informace o studii, o jejích cílech, o možných rizicích a benefitech. Obsahuje rovněž souhlas s jednotlivými částmi studie a informaci o tom, že mohou kdykoliv ze studie odstoupit nebo absolvovat pouze její část. Je-li to možné, ještě před operací vyplní pracovníci ÚHE s pacienty formou řízeného pohovoru dotazník, který zahrnuje otázky na rodinnou a a osobní anamnézu včetně stručné pracovní anamnézy a relativně rozsáhlá část je věnována stravě.

V rámci odběrů na oddělení je pacientům odebrána krev. Při operaci je odebrán vzorek tkáně z tumoru. Tkáň i krev (po zpracování) jsou uloženy v hlubokomrazícím boxu (-79 °C), následně je transportována do příslušné laboratoře k analýzám. Informace z dotazníků jsou vkládány do databáze pod kódovými čísly, anonymně.

Kontrolní skupinu tvoří pacienti, které náhodně zastihneme u praktických lékařů. Pokud lidé, kteří přicházejí buď na odběry, nebo na preventivní prohlídky ke svému praktickému lékaři souhlasí s účastí ve studii, je jim odebrána krev a pracovníci ÚHE s nimi vyplní formou řízeného pohovoru dotazník shodný s dotazníkem pro případy.

V průběhu první studie jsme získali informace a biologické vzorky od 150 párů případů a kontrol. Zpracovaná krev byla analyzována v prvním roce druhé studie ve spoluřešitelských genetických laboratořích. V průběhu prvního roku řešení nového projektu jsme zachytili 72 potenciálních případů nádorů slinivky břišní a 39 osob kontrolních. Z těchto 72 případů bylo 40 mužů a 32 žen, 16 mužů a 23 žen v kontrolním souboru.

Izolace DNA z lymfocytů se provádí pomocí magnetické separace na přístroji KingFisher. Úsek genomové DNA obsahující sledovaný polymorfismus (variace v DNA přítomná u více než 1 % populace) je namnožen PCR (polymerázovou řetězovou reakcí) a naštěpen restrikčním enzymem, který rozezná divokou a variantní alelu. Výsledek je odečten pomocí agarozové elektroforézy, která umožňuje roztřídění vzorků na divoké (w/w), variantní (v/v) a heterozygotní (w/v) nosiče. Tato metoda restrikční analýzy je považována za klasickou.

Dále používáme novější metody jako je DNA sekvenování a nejnovější metodou, kterou používáme, je „real time PCR”, která pomocí fluorescenčně značených sond umožňuje rychlé a spolehlivé hodnocení jednotlivých genotypů.

Vzorky byly podrobeny studiu genetických polymorfismů biotransformačních enzymů:

• cytochromu P450 CYP1B1 (kodon 432, aminokyselinová záměna Leu-Val a 453, Asn-Ser),
• epoxid hydroláza EPHX1 (113, Tyr-His a 139, His-Arg),
• NADP(H)-chinon oxidoreduktáza NQO1 (187, Pro-Ser),
• glutathion S-transferáza GSTP1 (105, Ile-Val),
• GSTM1 (null-delece celého genu), a 
• GSTT1 (null-delece celého genu) metodami, které byly již zavedeny v rámci předchozích studií a jsou zmíněny výše.

Výsledky byly hodnoceny pomocí Pearsonova chí kvadrát testu a riziko bylo vyjádřeno pomocí Mantel-Hanszelova modelu odhadu relativního rizika (OR) a konfidenčních intervalů na hladině významnosti 95 % (95 % CI). K analýzám byl použit program SPSS v.14.

Výsledky

Celkem bylo předáno do konce roku 2007 do laboratoře 408 vzorků krví kontrolních osob a pacientů s nádorem pankreatu k izolaci DNA. V této skupině se nachází 165 vzorků kontrolních subjektů, 193 případů nádorů pankreatu, 25 vzorků s pankreatitidou a 25 nejasných případů. Izolace DNA byla úspěšně provedena u 340 vzorků.

Z předběžného statistického hodnocení souboru vyplývá, že hrubý odhad relativního rizika (crude odds ratios) se neliší mezi skupinami kontrolních subjektů (n=165) a klinicky potvrzených případů (n=193) pro polymorfismy v genech CYP1B1, NQO1, GSTP1 a GSTT1.

Pozoruhodný výsledek byl nalezen pro gen EPHX1, kde se polymorfismus v exonu 3 předběžně jeví jako silný rizikový faktor (OR = 5,82 znamená 5,82-krát vyšší riziko vzniku nádoru pankreatu u nosičů variantní alely na hladině významnosti P < 0,001) (tab. 1).

Naopak, nosičství variantní alely v genu GSTM1 pravděpodobně působí jako protektivní faktor onemocnění (OR = 0,53, P = 0,015) (tab. 2).

První hodnocení epidemiologických údajů týkajících se především životního stylu nepřineslo statisticky významné výsledky, a to ani ty očekávané.

Věkové rozložení souboru případů a kontrol se neliší (5% hladina významnosti, Chí kvadrát = 6,497 d.f.= 4, P = 0,165. Věk (± 5 let) byl také jediným selekčním kritériem při výběru kontrolních osob. Věk je současně statisticky významným rizikovým faktorem [P = 0,031, log it(p_t) = -1,285 (0,598) + 0,021t (0,010)], model naznačuje, že riziko onemocnění stoupá významně s věkem. (obr. 1).

V našem souboru je ovšem zřetelný mírný rozdíl ve výskytu nádoru z hlediska věku a pohlaví: u mužů vzestup začíná již ve věku středním (od cca 40 let), u žen vzestup zaznamenáváme až po 50. roce věku, respektive až kolem 60. let.

Vliv věku je tedy prokazatelný, vliv pohlaví je naproti tomu nevýznamný (P = 0,554), onemocnění se tedy vyskytuje stejnoměrně u mužů i u žen.

Diskuse

Kouření bývá uváděno jako sice slabý, ale jediný prokázaný rizikový faktor vzniku karcinomu pankreatu (2). V našem souboru se kouření nepodařilo na 5% hladině významnosti prokázat jako rizikový faktor (P = 0,567), stejně jako konzumaci alkoholu (P = 0,276), další potenciální rizikový faktor karcinomu slinivky břišní. Jako statisticky nevýznamný rizikový faktor se v naší studii ukázalo i předchozí onemocnění slinivky břišní, a to i v rodinné anamnéze (P = 0,549), narozdíl od operace žlučových kamenů. Výskyt této operace v předchorobí byl velmi významný (P = 0,003). Další studie by měly rozhodnout, zda se jedná o rizikový faktor, nebo marker, který ve značném předstihu upozorňuje na počínající onemocnění.

Onemocnění, jejichž význam se často diskutuje v souvislosti s karcinomem slinivky břišní, je diabetes 2. typu (7). Výskyt diabetu v anamnéze u pacientů s karcinomem slinivky břišní je statisticky významně vyšší (p=0,007), pravděpodobně se však incidence zvyšuje v důsledku změn probíhajících ve slinivce, kdy na základě procesů v tkáni diabetes vzniká. Diagnóza onemocnění diabetem je totiž většinou stanovena v posledním roce (6 měsících) před vlastní diagnózou nádoru.

Z ovlivnitelných rizikových faktorů, kromě kouření a konzumace alkoholu, které však v naší studii neměly dostatečnou statistickou významnost, by podstatnou úlohu mohla hrát obezita vzhledem k tomu, jak přibývá v naší populaci obézních lidí.

S postupujícím onemocněním pacienti ztrácejí na váze, a to statisticky velmi významně (P < 0,0001), podstatný však je stav před vznikem onemocnění. V průběhu řízeného rozhovoru se snažíme zjistit, zda došlo v průběhu života k významným výkyvům v hmotnosti, především zda podstatnou část života netrpěl pacient nadváhou. Když jsme však hodnotili body mas index (BMI) ve 20 letech, tedy dlouho před vznikem onemocnění, a 2 roky před stanovením diagnózy, ani jeden z těchto údajů nebyl statisticky významný (P = 0,186; P = 0,982). V obou případech se však jednalo o údaje anamnestické, nikoliv antropometrické, a museli jsme spoléhat na paměť pacientů.

Závěr

V naší studii se dosud nepodařilo prokázat vliv ovlivnitelných rizikových faktorů. První výsledky genetické analýzy ukazují na možný vliv polymorfismů v genech biotransformace na vznik tohoto nádoru. Statistickým zhodnocením vzájemného možného ovlivnění genetických změn a rizikových faktorů by se mohl následně vysvětlit vysoký výskyt tohoto nádoru ve středoevropském regionu.

Nalezené výsledky bude třeba ověřit na větším souboru a zároveň posoudit možný vliv modifikujících faktorů (confounders) v oblasti životního stylu účastníků studie.

Práce byla podpořena grantem IGA MZ 9422–3, etická komise VFN a 1. LF UK vyslovila se studií souhlas.

Poděkování za technickou pomoc patří Lucii Kubátové, Ivě Otradovcové a DiZ. Šárce Adamčíkové.

MUDr. Ivana Holcátová, CSc.

Svatovítská 5

160 00 Praha 6

E-mail: ivana.holcatova@ lf1.cuni.cz