#PAGE_PARAMS# #ADS_HEAD_SCRIPTS# #MICRODATA#

Identifikace významu exprese MT-3 pro buňky neuroblastomu


Authors: T. Eckschlager 1;  A. Vícha 1;  P. Jenčová 1;  MA. Merlos Rodrigo 2;  S. Dostálová 3;  H. Buchtelová 3;  V. Strmiska 3;  P. Michálek 3;  Z. Heger 3;  V. Adam 3
Authors‘ workplace: Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol, Praha 1;  Centrum molekulární medicíny, CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno 2;  Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta Mendelovy univerzity v Brně 3
Published in: Klin Onkol 2018; 31(Supplementum1): 145-147
Category: Article

Overview

Východiska:
Rezistence nádorových buněk k cytostatikům je způsobena řadou mechanizmů, které se často kombinují. Patří k nim redukovaný vstup cytostatika do buňky nebo jeho zvýšený eflux, zvýšená oprava DNA, defekty apoptotických drah, zvýšené odbourávání cytostatika a také zvýšená hladina intracelulárních thiolů glutathionu a metalothioneinů (MT). Bylo popsáno, že vysoká koncentrace thiolových skupin v cytoplazmě váže platinové alkylační deriváty a chemorezistence je způsobena přenosem platiny z cytostatika na MT, které je inaktivují. Protože jsme v našich předchozích studiích prokázali zvýšení hladin MT v rezistentních neuroblastomových (NB) liniích, ale ne v senzitivních liniích po inkubaci s platinovými cytostatiky, zabývali jsme se významem MT-3 pro buňky NB.

Metoda:
Buňky NB linie SiMa transfekované vektorem obsahujícím lidský MT-3 a GFP nebo pouze GFP (kontrola). Expresní microarray Human Cancer 3711 ElectraSense medium density 4 × 2k array slides s 1 609 DNA probami (Custom Array, Bothell, WA, USA), exprese MT-3 a nejvíce exprimovaných genů validována real-time polymerázová řetězová reakce (RT-PCR). Citlivost k CDDP (cisplatina) – MTT test, vyšetření klonogenicity, průkaz štěpení kaspázy 3 Western blottem a volné kyslíkové radikály fluorescenční mikroskopií po barvení CellROX Deep Red Reagent. Hladiny mRNA MT-3 ve 23 vzorcích vysoce rizikových NB buňkách normální lidské kůry nadledviny a bovinní nadledviny byly vyšetřeny RT-PCR.

Výsledky:
Expresní microarray prokázala downregulaci 3 a over-expresi 19 genů u MT-3 transfekovaných NB buněk. Pomocí genové ontologie bylo zjištěno, že over-exprimované geny řídí onkogeny indukovanou senescenci (CDKN2B a ANAPC5), a zvýšeně exprimované byly i geny glutathion S-transferázy M3, kaspázy 4 a DNAJB6 (chaperon neuronálních proteinů). Prokázali jsme sníženou senzitivitu MT-3 transfekovaných buněk k CDDP (24 h IC50 7,48 ± 0,97 a 19,81 ± 1,2 µg/ml), vyšší počet kolonií po inkubaci s CDDP, snížené štěpení kaspázy 3 po inkubaci s CDDP a nižší volné kyslíkové radikály po jejich indukci CDDP. Buňky vysoce rizikových NB exprimovaly MT-3 významně více než nenádorové buňky nadledviny, ale nepodařilo se prokázat jednoznačný vztah k průběhu onemocnění.

Závěr:
Prokázali jsme vztah mezi MT-3 a geny onkogeny indukované senescence a některými dalšími geny významnými pro osud buňky (glutathion S-transferáza M3, kaspáza 4 a DNAJB6) a významný podíl MT-3 na rezistenci k CDDP. Vysoké hladiny MT-3 u vysoce rizikového NB by mohly být jednou z příčin častých recidiv u tohoto nádoru.

Klíčová slova:
neuroblastom – metalothionein 3 – chemoresistence

Úvod

Rezistence nádorových buněk k cytostatikům je jednou z hlavních příčin stále nepříliš uspokojivých výsledků léčby zhoubných nádorů. Je způsobena řadou mechanizmů, které se často kombinují. Patří k nim redukovaný vstup cytostatika do buňky nebo jejich zvýšený eflux, zvýšená oprava poškozené DNA, defekty apoptotických drah, zvýšené odbourávání cytostatika a také zvýšená hladina intracelulárních thiolů glutathionu a metalothioneinů (MT). Bylo popsáno, že vysoká koncentrace thiolových skupin v cytoplazmě váže platinové alkylační deriváty, a chemorezistence je tak způsobena přenosem platiny z cisplatiny (CDDP), karboplatiny i ostatních platinu obsahujících cytostatik na MT, které je inaktivují [1]. V našich předchozích studiích jsme prokázali zvýšení hladin MT v neuroblastomových liniích rezistentních k CDDP po inkubaci s platinovými cytostatiky, ale ne v senzitivních liniích za stejných podmínek. Při kultivaci v mediu bez cytostatik však ani senzitivní ani rezistentní linie neexprimovaly MT zvýšeně [2]. Také u pacientů s hepatoblastomem léčených karboplatinou bylo zjištěno, že pacienti nereagující na léčbu měli vyšší procento buněk exprimujících MT [3]. Suganuma et al [4] prokázali signifikantně vyšší množství MT v buňkách karcinomu žaludku rezistentních k léčbě CDDP. Většina prací ale poukazuje na ubikvitární izoformy MT, a to MT-1 a MT-2. Role dalších izoforem v rozvoji chemorezistence nádorových onemocnění je dosud neznámá.

Z toho důvodu jsme se zabývali významem MT-3 pro buňky neuroblastomu (NB), a to nejen s ohledem na chemorezistenci k CDDP, ale také s ohledem na molekulární mechanizmy, které over-exprese MT-3 ovlivňuje.

Metoda

K experimentům byly užity buňky linie SiMa odvozené z vysoce rizikového NB s amplifikací MYCN transfekované vektorem obsahujícím geny kódující lidský MT-3 a GFP (selekční marker) nebo pouze GFP (kontrola). Exprese genů byla vyšetřena pomocí expresní microarray – Human Cancer 3711 ElectraSense medium density 4 × 2k array slides s 1 609 DNA probami (Custom Array, Bothell, WA, USA). Expresi MT-3 a pěti nejvíce ovlivněných genů jsme validovali pomocí real-time polymerázové řetězové reakce (RT-PCR) za využití SYBR Green Quantitative RT-PCR Kitu Eppendorf. Citlivost k CDDP jsme testovali MTT testem s různými koncentracemi CDDP (ředění od 20 μg/ml), vyšetřením klonogenicity buněk preinkubovaných s CDDP, průkazem štěpení kaspázy 3 Western blottem a detekcí volných kyslíkových radikálů (reactive oxygen species – ROS) fluorescenční mikroskopií po afinitním barvení (CellROX Deep Red Reagent). Hladiny mRNA MT-3 ve 23 vzorcích vysoce rizikových NB, buňkách normální lidské kůry nadledviny a bovinní nadledviny byly vyšetřeny pomocí kvalitativní RT-PCR.

Výsledky

Úspěšnost transfekce dosahovala přibližně 70 % a byla potvrzena jak mikroskopicky, tak analýzou exprese MT-3 na úrovni mRNA i proteinu. Expresní microarray prokázala down-regulaci 3 a over-expresi 19 genů u MT-3 transfekovaných NB buněk. Analýzou genové ontologie jsme zjistili, že MT-3 přímo reguluje expresi genů ovlivňujících onkogeny indukovanou senescenci (CDKN2B a ANAPC5). Významný regulační efekt byl zjištěn také u genů pro glutathion S-transferázu M3, kaspázu 4 a DNAJB6 (chaperon pro neuronální proteiny).

Řadou metod jsme prokázali sníženou senzitivitu k CDDP u MT-3 transfekovaných buněk oproti kontrolním buňkám. MTT testem byly zjištěny následující rozdíly v IC50 po 24hodinové inkubaci (7,48 ± 0,97 a 19,81 ± 1,2 µg/ml). Prokázali jsme také vyšší počet kolonií po inkubaci s CDDP u buněk transfekovaných MT-3 než u buněk kontrolních, snížené štěpení kaspázy 3 po inkubaci s CDDP a přítomnost nižšího množství ROS po jejich indukci CDDP.

Vzorky tkání vysoce rizikových NB exprimovaly MT-3 významně více než nenádorové buňky nadledviny. Neprokázali jsme ale jednoznačný vztah k formě onemocnění ani k prognóze.

Diskuze

Naše experimenty prokázaly snížení citlivosti k CDDP u linie zvýšeně exprimující MT-3. Pro tuto linii je charakteristické zvýšení exprese některých genů ovlivňujících onkogeny indukovanou senescenci. Otázkou zůstává vlastní mechanizmus rezistence. Uvažovat lze o vazbě platinového cytostatika na MT, ale i změny v drahách onkogeny indukované senescence se mohou podílet na snížení citlivost k cytostatikům [5]. Lze spekulovat, zda by vysoké hladiny MT-3 u vysoce rizikového NB, které jsme v naší studii nalezli, nemohly být jednou z příčin velmi častých recidiv u tohoto nádoru [6].

Závěry

Prokázali jsme vztah mezi MT-3 a geny dráhy onkogeny indukované senescence a některými dalšími geny významnými pro osud buňky (glutathion S-transferáza M3, kaspáza 4 a DNAJB6) a významný podíl MT-3 na rezistenci k CDDP. Ve všech vzorcích vysoce rizikových NB jsme detekovali vysoké hladiny MT-3 m-RNA.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Práce byla podpořena AZV ČR grant 15-28334A

prof. MUDr. Tomáš Eckschlager, CSc.

Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol

V Úvalu 84 150 06 Praha 5

e-mail: tomas.eckschlager@lfmotol.cuni.cz

Obdrženo: 17. 2. 2018

Přijato: 16. 4. 2018


Sources

1. Galluzzi L, Vitale I, Michels J et al. Systems biology of cisplatin resistance: past, present and future. Cell Death Dis 2014; 5: e1257. doi: 10.1038/cddis.2013.428.

2. Fabrik S, Krizkova D, Huska V et al. Employment of electrochemical techniques for metallothionein determination in tumor cell lines and patients with a tumor dinase. Electroanalysis 2008; 20 (14): 1521–1532.

3. Endo T, Yoshikawa M, Ebara M et al. Immunohistochemical metallothionein expression in hepatocellular carcinoma: relation to tumor progression and chemoresistance to platinum agents. J Gastroenterol 2004; 39 (12): 1196–1201. doi: 10.1007/s00535-004-14 71-1.

4. Suganuma K, Kubota T, Saikawa Y et al. Possible chemoresistance-related genes for gastric cancer detected by cDNA microarray. Cancer Sci 2003; 94 (4): 355–359.

5. Matt S, Hofmann TG. The DNA damage-induced cell death response: a roadmap to kill cancer cells. Cell Mol Life Sci 2016; 73 (15): 2829–2850. doi: 10.1007/s00018-016-2130-4.

6. Moroz V, Machin D, Faldum A et al. Changes over three decades in outcome and the prognostic influence of age-at-diagnosis in young patients with neuroblastoma: a report from the International Neuroblastoma Risk Group Project. Eur J Can 2011; 47 (4): 561–571. doi: 10.1016/j.ejca.2010.10.022.

Labels
Paediatric clinical oncology Surgery Clinical oncology

Article was published in

Clinical Oncology

Issue Supplementum1

2018 Issue Supplementum1

Most read in this issue
Topics Journals
Login
Forgotten password

Enter the email address that you registered with. We will send you instructions on how to set a new password.

Login

Don‘t have an account?  Create new account

#ADS_BOTTOM_SCRIPTS#