Identifikace významu exprese MT-3 pro buňky neuroblastomu

Souhrn

Východiska:
Rezistence nádorových buněk k cytostatikům je způsobena řadou mechanizmů, které se často kombinují. Patří k nim redukovaný vstup cytostatika do buňky nebo jeho zvýšený eflux, zvýšená oprava DNA, defekty apoptotických drah, zvýšené odbourávání cytostatika a také zvýšená hladina intracelulárních thiolů glutathionu a metalothioneinů (MT). Bylo popsáno, že vysoká koncentrace thiolových skupin v cytoplazmě váže platinové alkylační deriváty a chemorezistence je způsobena přenosem platiny z cytostatika na MT, které je inaktivují. Protože jsme v našich předchozích studiích prokázali zvýšení hladin MT v rezistentních neuroblastomových (NB) liniích, ale ne v senzitivních liniích po inkubaci s platinovými cytostatiky, zabývali jsme se významem MT-3 pro buňky NB.

Metoda:
Buňky NB linie SiMa transfekované vektorem obsahujícím lidský MT-3 a GFP nebo pouze GFP (kontrola). Expresní microarray Human Cancer 3711 ElectraSense medium density 4 × 2k array slides s 1 609 DNA probami (Custom Array, Bothell, WA, USA), exprese MT-3 a nejvíce exprimovaných genů validována real-time polymerázová řetězová reakce (RT-PCR). Citlivost k CDDP (cisplatina) – MTT test, vyšetření klonogenicity, průkaz štěpení kaspázy 3 Western blottem a volné kyslíkové radikály fluorescenční mikroskopií po barvení CellROX Deep Red Reagent. Hladiny mRNA MT-3 ve 23 vzorcích vysoce rizikových NB buňkách normální lidské kůry nadledviny a bovinní nadledviny byly vyšetřeny RT-PCR.

Výsledky:
Expresní microarray prokázala downregulaci 3 a over-expresi 19 genů u MT-3 transfekovaných NB buněk. Pomocí genové ontologie bylo zjištěno, že over-exprimované geny řídí onkogeny indukovanou senescenci (CDKN2B a ANAPC5), a zvýšeně exprimované byly i geny glutathion S-transferázy M3, kaspázy 4 a DNAJB6 (chaperon neuronálních proteinů). Prokázali jsme sníženou senzitivitu MT-3 transfekovaných buněk k CDDP (24 h IC₅₀ 7,48 ± 0,97 a 19,81 ± 1,2 µg/ml), vyšší počet kolonií po inkubaci s CDDP, snížené štěpení kaspázy 3 po inkubaci s CDDP a nižší volné kyslíkové radikály po jejich indukci CDDP. Buňky vysoce rizikových NB exprimovaly MT-3 významně více než nenádorové buňky nadledviny, ale nepodařilo se prokázat jednoznačný vztah k průběhu onemocnění.

Závěr:
Prokázali jsme vztah mezi MT-3 a geny onkogeny indukované senescence a některými dalšími geny významnými pro osud buňky (glutathion S-transferáza M3, kaspáza 4 a DNAJB6) a významný podíl MT-3 na rezistenci k CDDP. Vysoké hladiny MT-3 u vysoce rizikového NB by mohly být jednou z příčin častých recidiv u tohoto nádoru.

Klíčová slova:
neuroblastom – metalothionein 3 – chemoresistence

Úvod

Rezistence nádorových buněk k cytostatikům je jednou z hlavních příčin stále nepříliš uspokojivých výsledků léčby zhoubných nádorů. Je způsobena řadou mechanizmů, které se často kombinují. Patří k nim redukovaný vstup cytostatika do buňky nebo jejich zvýšený eflux, zvýšená oprava poškozené DNA, defekty apoptotických drah, zvýšené odbourávání cytostatika a také zvýšená hladina intracelulárních thiolů glutathionu a metalothioneinů (MT). Bylo popsáno, že vysoká koncentrace thiolových skupin v cytoplazmě váže platinové alkylační deriváty, a chemorezistence je tak způsobena přenosem platiny z cisplatiny (CDDP), karboplatiny i ostatních platinu obsahujících cytostatik na MT, které je inaktivují [1]. V našich předchozích studiích jsme prokázali zvýšení hladin MT v neuroblastomových liniích rezistentních k CDDP po inkubaci s platinovými cytostatiky, ale ne v senzitivních liniích za stejných podmínek. Při kultivaci v mediu bez cytostatik však ani senzitivní ani rezistentní linie neexprimovaly MT zvýšeně [2]. Také u pacientů s hepatoblastomem léčených karboplatinou bylo zjištěno, že pacienti nereagující na léčbu měli vyšší procento buněk exprimujících MT [3]. Suganuma et al [4] prokázali signifikantně vyšší množství MT v buňkách karcinomu žaludku rezistentních k léčbě CDDP. Většina prací ale poukazuje na ubikvitární izoformy MT, a to MT-1 a MT-2. Role dalších izoforem v rozvoji chemorezistence nádorových onemocnění je dosud neznámá.

Z toho důvodu jsme se zabývali významem MT-3 pro buňky neuroblastomu (NB), a to nejen s ohledem na chemorezistenci k CDDP, ale také s ohledem na molekulární mechanizmy, které over-exprese MT-3 ovlivňuje.

Metoda

K experimentům byly užity buňky linie SiMa odvozené z vysoce rizikového NB s amplifikací MYCN transfekované vektorem obsahujícím geny kódující lidský MT-3 a GFP (selekční marker) nebo pouze GFP (kontrola). Exprese genů byla vyšetřena pomocí expresní microarray – Human Cancer 3711 ElectraSense medium density 4 × 2k array slides s 1 609 DNA probami (Custom Array, Bothell, WA, USA). Expresi MT-3 a pěti nejvíce ovlivněných genů jsme validovali pomocí real-time polymerázové řetězové reakce (RT-PCR) za využití SYBR Green Quantitative RT-PCR Kitu Eppendorf. Citlivost k CDDP jsme testovali MTT testem s různými koncentracemi CDDP (ředění od 20 μg/ml), vyšetřením klonogenicity buněk preinkubovaných s CDDP, průkazem štěpení kaspázy 3 Western blottem a detekcí volných kyslíkových radikálů (reactive oxygen species – ROS) fluorescenční mikroskopií po afinitním barvení (CellROX Deep Red Reagent). Hladiny mRNA MT-3 ve 23 vzorcích vysoce rizikových NB, buňkách normální lidské kůry nadledviny a bovinní nadledviny byly vyšetřeny pomocí kvalitativní RT-PCR.

Výsledky

Úspěšnost transfekce dosahovala přibližně 70 % a byla potvrzena jak mikroskopicky, tak analýzou exprese MT-3 na úrovni mRNA i proteinu. Expresní microarray prokázala down-regulaci 3 a over-expresi 19 genů u MT-3 transfekovaných NB buněk. Analýzou genové ontologie jsme zjistili, že MT-3 přímo reguluje expresi genů ovlivňujících onkogeny indukovanou senescenci (CDKN2B a ANAPC5). Významný regulační efekt byl zjištěn také u genů pro glutathion S-transferázu M3, kaspázu 4 a DNAJB6 (chaperon pro neuronální proteiny).

Řadou metod jsme prokázali sníženou senzitivitu k CDDP u MT-3 transfekovaných buněk oproti kontrolním buňkám. MTT testem byly zjištěny následující rozdíly v IC₅₀ po 24hodinové inkubaci (7,48 ± 0,97 a 19,81 ± 1,2 µg/ml). Prokázali jsme také vyšší počet kolonií po inkubaci s CDDP u buněk transfekovaných MT-3 než u buněk kontrolních, snížené štěpení kaspázy 3 po inkubaci s CDDP a přítomnost nižšího množství ROS po jejich indukci CDDP.

Vzorky tkání vysoce rizikových NB exprimovaly MT-3 významně více než nenádorové buňky nadledviny. Neprokázali jsme ale jednoznačný vztah k formě onemocnění ani k prognóze.

Diskuze

Naše experimenty prokázaly snížení citlivosti k CDDP u linie zvýšeně exprimující MT-3. Pro tuto linii je charakteristické zvýšení exprese některých genů ovlivňujících onkogeny indukovanou senescenci. Otázkou zůstává vlastní mechanizmus rezistence. Uvažovat lze o vazbě platinového cytostatika na MT, ale i změny v drahách onkogeny indukované senescence se mohou podílet na snížení citlivost k cytostatikům [5]. Lze spekulovat, zda by vysoké hladiny MT-3 u vysoce rizikového NB, které jsme v naší studii nalezli, nemohly být jednou z příčin velmi častých recidiv u tohoto nádoru [6].

Závěry

Prokázali jsme vztah mezi MT-3 a geny dráhy onkogeny indukované senescence a některými dalšími geny významnými pro osud buňky (glutathion S-transferáza M3, kaspáza 4 a DNAJB6) a významný podíl MT-3 na rezistenci k CDDP. Ve všech vzorcích vysoce rizikových NB jsme detekovali vysoké hladiny MT-3 m-RNA.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Práce byla podpořena AZV ČR grant 15-28334A

prof. MUDr. Tomáš Eckschlager, CSc.

Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol

V Úvalu 84 150 06 Praha 5

e-mail: tomas.eckschlager@lfmotol.cuni.cz

Obdrženo: 17. 2. 2018

Přijato: 16. 4. 2018