Esenciální hypertenze a Arg16Gly polymorfizmus genu pro β₂-adrenergní receptor

Souhrn

Záměr studie:
V multifaktoriální patogenezi esenciální hypertenze hraje sympatoadrenální aktivita významnou úlohu. Tkáňový účinek katecholaminů je zprostředkován adrenergními receptory. β₂-adrenergní receptory se svým vazodilatačním účinkem podílejí na regulaci TK. Odchylky v jejich struktuře mohou vést k omezení schopnosti vazodilatace, a tím ke vzniku hypertenze. Polymorfizmus genu β₂-adrenergního receptoru se tak jeví jako nadějný kandidátní gen pro analýzu jeho asociace s esenciální hypertenzí.

Soubory nemocných a metodika:
V této studii jsme sledovali vliv asociace polymorfizmu Arg16Gly genu pro β₂-adrenergní receptor na výskyt a stupeň hypertenze. Porovnávali jsme četnost jednotlivých genotypů (GG, AG, AA) a alel (G a A) u 3 skupin osob středního věku: a) u kontrolní skupiny s normálním TK ≤ 140/90 mm Hg (N, n = 122), b) u pacientů s hypertenzí dobře kontrolovanou antihypertenzní léčbou (KH, n = 156) a c) u skupiny hypertoniků rezistentních na trojkombinaci antihypertenziv (RH, n = 73). Arg16Gly polymorfizmus genu pro β₂-adrenergní receptor jsme stanovili PCR technikou z leukocytární DNA s následnou inkubací s restrikčním enzymem Ncol. Získané fragmenty jsme dělili pomocí elektroforézy na 3% Metaphore agarózovém gelu a barvili pomocí ethidium bromidu. Ke statistickému porovnání distribuce genotypů a alel mezi jednotlivými skupinami byl použit Kruskalův-Wallisův test (ANOVA), Fisherův exaktní test, χ² test a test lineární asociace.

Výsledky:
Nenalezli jsme signifikantní rozdíly v zastoupení počtu genotypů a frekvenci alel mezi jednotlivými sledovanými skupinami. Avšak při spojení skupiny KH a RH do jednoho souboru (n = 229 pacientů) byl nalezen významný rozdíl ve frekvenci alel ve spojené skupině hypertoniků oproti normotonikům (χ² = 4,5, p = 0,035). Toto pozorování bylo v souladu s testem lineární asociace mezi stupněm hypertenze a výskytem alely A (na 5% hladině významnosti) s posunem k nižšímu zastoupení alely A u vyšších stupňů hypertenze (RH). Při hodnocení průměrných hodnot TK byl nalezen trend k nižším hodnotám systolického i diastolického TK od genotypu GG, přes GA ke genotypu AA.

Závěry:
Naše současná pozorování podporují hypotézu, že se genetická odchylka genu pro β₂-adrenergní receptor (Arg16Gly polymorfizmus) může v kombinaci s dalšími faktory podílet na ovlivnění výše TK, a tak přispět k vývoji esenciální hypertenze.

Klíčová slova:
esenciální hypertenze - polymorfizmus - β₂-adrenergní receptor - patogenetická účast

Úvod

Arteriální hypertenze je multifaktoriální onemocnění, na kterém se komplexně podílí jednak genetické faktory, jednak změny zevního prostředí. Vyšší sympatická aktivita je zřejmá u řady pacientů s esenciální hypertenzí (EH) a sympatoadrenální hyperaktivita je zodpovědná za řadu odchylek prokazatelných u EH. Tak se geny ovlivňující produkci katecholaminů nebo geny ovlivňující aktivitu α- a β-adrenergních receptorů mohou podílet na vzniku EH [8,13].

β₂-adrenergní receptory (B₂AR) jsou exprimovány v mnoha tkáních jako např. srdci, adipocytech, bronchiálním a cévním hladkém svalstvu. Tyto receptory mimo jiné účinky zprostředkovávají také vazorelaxační účinek katecholaminů. Dlouhodobá redukce funkce B₂AR s následným oslabením vazodilatace se může podílet na vzestupu TK u EH. Proto je věnována značná pozornost možné úloze B₂AR genu jako kandidátnímu genu pro EH [3,22].

Gen pro B₂AR je neintronový gen lokalizovaný na chromozomu 5q31-32. Doposud bylo popsáno 17 polymorfizmů jednotlivých nukleotidů (single nucleotide polymorphisms - SNP). Tři z nich, které ovlivňují změnu aminokyselin Arg16Gly, Gln27Glu a Thr164Ile, byly testovány in vitro, zda ovlivňují buněčné funkce [2,18,20].

Lidský B₂AR zprostředkovává relaxaci cévního hladkého svalstva, a tím vede k vazodilatační odpovědi na adrenalin. Odchylky v genomu pro B₂AR, např. ve smyslu polymorfizmu, mohou modifikovat tuto jejich základní funkci s omezením schopnosti vazodilatace po specifických podnětech. Zhoršení vazodilatace v přítomnosti normální nebo zvýšené vazokonstrikční odpovědi může vést ke zvýšené cévní reaktivitě, a tak k hypertenzi [5].

Jak molekulárně genetické, tak lidské cévní studie sledovaly úlohu B₂AR u EH. Výsledky studií vztahů mezi polymorfizmem genu pro B₂AR a hypertenzí jsou nejednotné. Kotanko et al [14] našli, že Gly16 polymorfizmus je asociován s hypertenzí u karibských Afričanů. Pozitivní asociace s hypertenzí byla také prokázána u bílých Evropanů [22], smíšené městské populace v Brazílii [19] a nedávno také u rodin čínského původu, avšak u německé populace je to spíše alela Arg26, která určuje genetickou predispozici k hypertenzi [22]. Nechybí ani protikladné studie, které nenašly asociaci polymorfizmu genu pro B₂AR s EH [11,23,24].

Ani studie úlohy polymorfizmů Arg16Gly a Glu17Gln u zdravých dobrovolníků nedávají konzistentní výsledky. Některé z nich podporují nález snížené odpovědi na stimulaci β-adrenergními agonisty u homozygotů Gly16 [5,7], jiné se pak domnívají, že je to naopak Arg16 receptor, který podmiňuje cévní desenzitizaci [4]. Proto jsme si v předkládané studii položili otázku, zda je Arg16Gly polymorfizmus B₂AR asociován s výskytem a tíží hypertenze i v naší české populaci.

Sledované soubory a metodika

V této naší práci navazující na naši dřívější studii [12] jsme se zaměřili na vliv polymorfizmu Arg16Gly genu B₂AR na výskyt a tíži hypertenze. Vyšetřili jsme jednotlivé genotypy GG, GA a AA, stejně tak frekvenci jednotlivých alel A a G u kontrolních osob bez hypertenze (n = 122, K), u nemocných s EH, u kterých došlo při běžné kombinační léčbě k normalizaci TK (n = 156, KH) a u skupiny pacientů s hypertenzí, kde ani trojkombinací antihypertenziv obsahující diuretikum se nám nepodařilo snížit TK na cílové hodnoty TK, tj. TK < 140/90 mm Hg (n = 73, RH). Základní klinická a laboratorní data jsou shrnuta jako průměry jednotlivých skupin v tab. 1.

Krev ke genetickému vyšetření byla odebírána z kubitální žíly u pacientů po 15minutovém klidu na lůžku. DNA ke stanovení genomu byla extrahována z leukocytů periferní krve a Arg16Gly polymorfizmus genu pro B₂AR byl detegován pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) s užitím restrikčního enzymu Ncol. Fragmenty vzniklé po opakované inkubaci byly separovány pomocí elektroforézy na 3% Metaphore agarózovém gelu a znázorněny barvením pomocí ethidium bromidu (obr. 1). Produkt PCR o 207 bp zůstal nerozštěpen v přítomnosti alely Arg16, zatímco v přítomnosti alely Gly16 byl produkt štěpen na 2 fragmenty o 189 a 18 bp. Výsledky Arg/Arg homozygotů byly potvrzeny reamplifikací. Všechny alely byly odečítány jedním pracovníkem.

Získané výsledky byly statisticky zpracovány a jsou vyjádřeny jako průměry jednotlivých skupin ± SE. Pro neparametrické srovnání bylo užito χ² testu. Vliv jednotlivých alel byl posuzován pomocí logistické regresní analýzy. Rozdíly mezi jednotlivými skupinami byly testovány pomocí Mannova-Whitneyova testu, z dalších statistických metod bylo využito analýzy variance (ANOVA), Kruskalova-Wallisova testu, Fischerova exaktního testu a testu lineární asociace. Výsledky s p < 0,05 byly považovány za signifikantní.

Výsledky

Klinická charakteristika sledovaných souborů kontrol a pacientů s hypertenzí je shrnuta v tab. 1. Nemocní s hypertenzí měli ve srovnání s kontrolní skupinou normotoniků lehce vyšší průměrný věk a vyšší průměrný systolický i diastolický TK. Zvýšení TK bylo výraznější u skupiny rezistentních hypertoniků, a to i přes léčbu trojkombinací antihypertenziv. Abychom si ověřili reprodukovatelnost našich navazujících studií a pro jejich srovnání byla k současným sledovaným souborům osob středního věku přiřazena i skupina mladších normotenzních mužů, vyšetřovaných za stejných podmínek a stejnými metodami v naší dřívější studii [12].

O rozložení četnosti jednotlivých genotypů GG, GA a AA, včetně četnosti alel G a A v jednotlivých sledovaných skupinách dává přehled tab. 2. Pro získání většího souboru jsme, vedle individuálního hodnocení skupiny hypertoniků dobře reagujících na léčbu a hypertoniků rezistentních k léčbě, ještě obě skupiny spojili do jednoho společného souboru hypertoniků a porovnávali pak se skupinou normotoniků.

Ve frekvenci genotypů a alel studovaného polymorfizmu B₂AR mezi souborem dříve sledovaných mladých normotoniků a současně prezentovaným souborem normotoniků středního věku byla nápadná shoda, svědčící pro dobrou reprodukovatelnost a přesnost užité metody.

V prezentované studii jsme nenalezli statisticky významné rozdíly v četnosti genotypů a alel Arg16Gly polymorfizmu genu pro B₂AR mezi normotoniky, hypertoniky reagujícími na léčbu a nemocnými rezistentními k antihypertenzní léčbě. Naproti tomu test na lineární asociaci mezi stupněm hypertenze a výskytem alely A naznačuje posun směrem k nižšímu zastoupení alely A u vyšších stupňů hypertenze (p = 0,031).

Ve spojeném souboru pacientů s kontrolovanou i rezistentní esenciální hypertenzí (n = 229 pacientů) byl naznačen u hypertoniků trend k nižší četnosti AA proti GG genotypu a prokázán signifikantní rozdíl v četnosti alel na 5% hladině významnosti ve smyslu nižší frekvenci alely A a vyšší frekvenci alely G. Toto pozorování je v souhlasu s výsledkem testu lineární asociace (p = 0,013).

Diskuse

V multifaktoriální patogeneze EH se uplatňuje řada regulačních mechanizmů. Mezi nimi významnou roli zaujímá bezesporu i vysoká sympatoadrenální aktivita. Ta je určována na jedné straně vysokou biosyntézou a uvolňováním katecholaminů, jejich plazmatickou hladinou, ale na 2. straně rovněž aktivací sympatoadrenálních receptorů v efektorových tkáních. Prokázali jsme dříve [17] asociaci mezi polymorfizmem genu pro tyrozin-hydroxylázu a strukturou levé komory srdeční u mladých, dosud normotenzních mužů. V předkládané studii se zabýváme především polymorfizmem B₂AR. β₂-adrenergní receptory ovlivňují kardiovaskulární aparát komplexně: ovlivněním vazodilatace, srdeční frekvence a srdečního výdeje, až po zvýšené uvolňování noradrenalinu ze sympatických zakončení a metabolické účinky ovlivňující lipolýzu v adipocytech [1,15,16]. V souvislosti s metabolickými vlivy B₂AR je i nález Bengtssona et al [2] vyšší pravděpodobnosti vzniku hypertenze u pacientů s diabetes mellitus 2. typu - homozygotních nositelů Arg16 alely, zvláště u štíhlých pacientů.

Odchylky v genomu pro B₂AR ve smyslu např. polymorfizmu mohou modifikovat jejich základní funkci a u B₂AR omezením schopnosti vazodilatace po specifických podnětech vést ke zvýšení TK a po dlouhodobém působení ke vzniku hypertenze [5]. Svědčí pro to i experimentální nálezy nižší systémové vazodilatace u homozygotů Gly16 po stimulaci B₂AR salbuterolem.

Výsledky dosavadních studií polymorfizmů B₂AR však nedávají jednoznačné konzistentní výsledky. Příčinou mohou být etnické a rasové rozdíly mezi jednotlivými studovanými kohortami, dále rozdíly ve věku, pohlaví, přítomnost obezity a dalších fenotypických rozdílů [6,9,21]. Z výsledků je patrné, že B₂AR nepůsobí na výši TK přímo, ale prostřednictvím a v kontextu s celou řadou intermediárních fenotypů. Některé práce pak neprokazují žádnou asociaci mezi polymorfizmy genu pro B₂AR a hypertenzí [23,24], ale spíše mezi Gly16 polymorfizmem a astmatem bronchiálním [20]. Z tohoto hlediska jsou zajímavé nálezy Iaccarina et al [9], kteří při sledování 3 polymorfizmů genu pro B₂AG (Arg16Gly, Gln27Glu, Ileu164Thr) nenašli asociaci žádného z těchto polymorfizmů s hypertenzí, ale u varianty alely Glu27 byla prokazatelná asociace s poškozením cílových orgánů, např. 1,4krát vyšší riziko vzniku srdeční hypertrofie, korelace s větším vnitřním systolickým a diastolickým objemem levé komory. Cévní poškození nebylo ovlivněno popsanými polymorfizmy, a to přes nález vyššího výskytu dyslipidemie u varianty Glu27 alely. Naproti tomu Pereira et al [19] u etnicky smíšené brazilské populace pomocí univariační (jednosměrné) analýzy prokázali asociaci systolického TK s genotypem Arg16Gly a Thr164Ile. V této studii mnohočetná logistická regresní analýza prokázala 1,48krát zvýšení rizika hypertenze u nositelů Gly16/Gly16 genotypu a 1,31krát vyšší riziko obezity u Gln27/Gln27 genotypu nebo 1,48krát vyšší riziko obezity u nositelů alely A. Tyto nálezy ukazují na možnost pevné, ale komplexní genetické vazby mezi B₂AR variantami, hypertenzí a obezitou, tak jak to vyplývá z klinických pozorování např. u nemocných s metabolickým syndromem. Studium vztahu mezi polymorfizmy B₂AR prokázalo také vztah incidence kardiovaskulárních příhod u starších osob [6] s nižším rizikem výskytu koronárních příhod u Gln27 homozygotů, stejně jako u homozygotů Gly16 oproti nositelům alely Arg16.

V naší studii jsme sledovali zastoupení jednotlivých genotypů a alel B₂AR polymorfizmu genu u poměrně rozsáhlých souborů kontrolních normotenzních osob středního věku a porovnávali je se soubory hypertoniků dobře a špatně reagujících na antihypertenzní léčbu a ve sloučeném souboru všech hypertoniků. U našich souborů jsme nalezli trend k nižšímu výskytu genotypu AA a výskytu alely A oproti GG genotypu u pacientů s hypertenzí a plynulý nárůst genotypu GG a vyšší zastoupení alely G, zvláště při sloučení obou skupin hypertoniků do jednoho souboru. Tento nález je v souhlasu i s nálezy dalších autorů [3,22]. V naší studii test lineární asociace mezi stupněm hypertenze a výskytem alely A naznačil nižší výskyt alely A u vyšších stupňů hypertenze a ve spojeném souboru hypertoniků nižší frekvenci alely A a vyšší výskyt alely G u hypertoniků ve srovnání s normotenzní skupinou. Podobně i Snieder et al [21] při sledování polymorfizmu Arg16Gly pro B₂AR u mladých Američanů evropského i afrického původu prokázali, že nositelé 1 nebo 2 Gly alel mají vyšší hodnoty systolického a pulzního tlaku.

Nepodařilo se nám, na rozdíl od sledování polymorfizmů jiných kandidátních genů, najít jednoznačný specifický rozdíl pro skupinu hypertoniků rezistentních k léčbě jako např. u studie nitric-oxid syntázy u podobných souborů nemocných [10].

Tyto naše výsledky spolu s výsledky některých dalších autorů podporují názor, že genetická variabilita genu pro B₂AR se podílí na predispozici k vyššímu TK a vzniku hypertenze. Avšak rozdílnosti mezi jednotlivými studiemi ukazují, že účinek B₂AR genu není asi přímý, ale je zprostředkován v součinnosti a interakcí s řadou odchylek dalších genotypů a intemediárních fenotypů.

Závěr

Naše studie polymorfizmu genu pro B₂AR naznačuje, že rozdíly ve frekvenci alel u hypertoniků spolu s posunem k nižšímu zastoupení alely A (wild type) u vyšších stupňů hypertenze (hypertenze rezistentní na antihypertenzní léčbu) naznačuje možnost, že genetická odchylka B₂AG genu pro adrenergní receptor v kombinaci s dalšími genetickými a získanými odchylkami může přispívat ke vzniku a vývoji hypertenze a některých dalších přidružených chorob, jako jsou např. obezita, dyslipoproteinemie nebo metabolický syndrom.

Řešení výzkumného grantu bylo podpořeno projektem IGA MZ ČR číslo NA-7171-3.

RNDr. Marie Jáchymová

www.vfn.cz

e-mail: mjach@lf1.cuni.cz

Doručeno do redakce: 3. 12. 2004

Přijato po recenzi: 11. 1. 2005