Stanovení aktivity faktoru VIII u pacientů s těžkou hemofilií A léčených koncentráty s prodlouženým bio logickým poločasem – porovnání výsledků vybraných metod

Souhrn

Úvod: Adekvátní substituční léčba hemofilie zahrnuje monitorování aktivity FVIII (FVIII: C), které lze provádět buď jednofázovou koagulační metodou (one-stage clotting assay – OSA), nebo metodou s chromogenními substráty (chromogenic substrate assay – CSA). S příchodem koncentrátů FVIII s prodlouženým biologickým poločasem se však prohlubuje problém diskrepancí mezi metodami z důvodu úpravy molekuly FVIII. Cíl: Hodnocení míry diskrepance výsledků FVIII: C OSA a CSA u pacientů léčených koncentráty FVIII s prodlouženým poločasem. Metody: Stanovení FVIII: C ve vzorcích pacientů léčených koncentráty efmoroctocog alfa, rurioctocog alfa pegol, turoctocog alfa pegol a damoctocog alfa pegol pomocí OSA s reagenciemi Cephascreen® (Diagnostica Stago) a Pathromtin® SL (Siemens Healthineers) a CSA BIOPHEN^TM FVIII: C (Hyphen BioMed). Výsledky: Výsledky obou metod dobře korelovaly u efmoroctocog alfa, rozdíly byly do 21 %. U rurioctocog alfa pegol byla FVIII: C v rozsahu cca 15–200 % metodou OSA s oběma reagenciemi lehce nižší (průměrně o 11, resp. o 18 %), zatímco výsledky FVIII: C < 10 % byly naopak dle OSA vyšší v průměru o 54 % s Cephascreen® a až o 75 % s Pathromtin® SL. Výsledky turoctocog alfa pegol byly metodou OSA nižší než CSA, pro rozsah 15–200 % průměrně o 36, resp. 25 %, přičemž pro nižší hladiny FVIII: C byly nejednoznačné, s odchýlením oběma směry. Výsledky damoctocog alfa pegol byly metodou OSA jen mírně vyšší (Cephascreen® průměrně o 18 %) pro hladiny FVIII: C > 10 %, ale výrazně vyšší než CSA u FVIII: C < 10 % (průměrně o 91 % s reagencií Cephascreen® a o 100 % u Pathromtin® SL). Závěr: Na základě našeho pozorování výsledky FVIII: C metodou OSA excelentně korelují s reagenciemi Cephascreen® a Pathromtin® SL s CSA Hyphen u pacientů léčených koncentrátem efmoroctocog alfa. Z ostatních koncentrátů korelují excelentně pouze výsledky rurioctocog alfa pegol (jen Cephascreen®) a damoctocog alfa pegol, a to pouze FVIII: C > 10 %.

Klíčová slova:

hemofilie A – aktivita FVIII – EHL koncentráty

ÚVOD

Hemofilie A je geneticky podmíněné krvácivé onemocnění způsobené defektem v genu (F8), vedoucí ke kvalitativnímu či kvantitativnímu defektu proteinu FVIII. Dle výsledku aktivity FVIII se dělí na lehkou (5–40 %), středně těžkou (1–5 %) a těžkou (< 1 %) formu. Fyziologická hladina aktivity FVIII se pohybuje v rozsahu 50–150 %. Léčba spočívá v nahrazení chybějícího FVIII buď profylakticky, nebo on-demand pomocí plazmatických (pdFVIII) či rekombinantních (rFVIII) koncentrátů podávaných intravenózně. Profylakticky je možné použít i bispecifickou monoklonální protilátku emicizumab nebo v rámci studií genovou terapii. V posledních letech byly vyvinuty nové koncentráty s upravenou molekulou FVIII umožňující delší setrvání v cirkulaci pacienta (extended half-life – EHL). Úprava molekuly zahrnuje fúzi rFVIII s Fc fragmentem lidského imunoglobulinu G1 (IgG), polyethylenglykolem (PEG) nebo albuminem. PEGylace prodlužuje biologický poločas FVIII, protože ho chrání před enzymatickou degradací, a fúze s Fc částí IgG či albuminem chrání FVIII před degradací lysozomy. Nespornou výhodou těchto koncentrátů je méně častá intravenózní aplikace, avšak modifikace molekuly způsobuje problémy při laboratorním monitorování, kdy dochází k falešnému nadhodnocení nebo podhodnocení výsledků [1–4].

Problematika monitorování souvisí s diskrepancí výsledků mezi metodami a tyto jsou popsány jak u koncentrátů FVIII o plné délce, tak s deletovanou B-doménou, kdy výsledky CSA metody vycházejí ve srovnání s OSA vyšší. Rozdílné výsledky se objevují nejen mezi výše zmíněnými metodami, ale i v rámci samotné OSA, což souvisí s velkou variabilitou dostupných APTT reagencií lišících se v typu požitého povrchového aktivátoru a obsahu fosfolipidů [5–8].

Jako referenční metoda pro stanovení účinnosti koncentrátů FVIII je Evropským lékopisem stanovena metoda s chromogenními substráty [6,9]. Dle doporučení Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (SSC ISTH) by měli výrobci své koncentráty testovat proti aktuálnímu WHO Mezinárodnímu standardu (World Health Organization International Standard – WHO IS) pro koncentráty FVIII a použít jak OSA, tak CSA a pro stanovování aktivity FVIII OSA metodou využití rozdílné APTT reagencie. Co se týče vyšetřování vzorků od pacientů léčených koncentráty FVIII, tak dle SSC ISTH je optimální testovat vzorky proti produkt-specifickému standardu. Tento postup je však pro rutinní laboratoře obtížně implementovatelný [10].

 

Metody stanovení aktivity FVIII

Aktivitu FVIII lze vyšetřovat v zásadě třemi metodami – jednofázovou koagulační metodou, klasickou dvoufázovou koagulační metodou a metodou s chromogenními substráty. V klinických laboratořích je pro stanovení FVIII: C nyní nejvíce využívaná jednofázová koagulační metoda, neboť je jednoduchá, rychlá a snadno automatizovatelná. Dle literatury je však pro nízké hodnoty FVIII: C citlivější metoda s chromogenními substráty [11,12].

 

Jednofázová koagulační metoda

Metoda je založena na principu aktivovaného parciálního tromboplastinového testu, kdy je k ředěné testované plazmě přidána v ekvivalentním množství FVIII-deficitní plazma a následně APTT reagencie obsahující fosfolipidy a povrchový aktivátor. Po přidání vápenatých iontů se měří čas do vytvoření fibrinových vláken, která jsou detekována mechanicky nebo opticky dle principu analyzátoru. FVIII-deficitní plazma musí obsahovat všechny ostatní koagulační faktory, vyjma FVIII, v normální aktivitě, tak aby výsledný koagulační čas závisel pouze na aktivitě FVIII v testovaném vzorku. Výsledek FVIII: C v % je odečten z kalibrační křivky, která je získána měřením různých ředění standardu s přesně udanou aktivitou FVIII [2,12,13]. V závislosti na použitém aktivátoru a fosfolipidech je metoda různě citlivá na deficit koagulačních faktorů, přítomnost protilátek typu lupus antikoagulans či léčbu heparinem [2,11].

V současné době mají laboratoře k dispozici množství APTT reagencií lišících se v typu povrchového aktivátoru a obsahu fosfolipidů. Bylo prokázáno, že právě typ aktivátoru má velký vliv na výsledky FVIII: C při substituční léčbě hemofilie, především EHL koncentráty. Jako povrchový aktivátor slouží kaolin, křemičitany, kyselina ellagová nebo polyfenoly. Je třeba dodat, že zároveň existují rozdílné aktivátory typu křemičitanů (např. koloidní křemičitany) a kyseliny ellagové, což znamená, že ne všechny APTT reagencie s obsahem křemičitanů či kyseliny ellagové poskytují stejné výsledky FVIII: C [1].

 

Metoda s chromogenními substráty

Metoda s chromogenními substráty je založena na podobném principu jako dvoufázová koagulační metoda. V prvním kroku probíhá inkubace testované plazmy spolu s faktorem IXa (FIXa), trombinem, fosfolipidy, vápenatými ionty a nadbytkem faktoru X (FX). Během inkubace dochází k aktivaci FVIII trombinem a vytvoření koagulačně aktivního komplexu – vnitřní tenázy, která aktivuje FX na FXa. V druhém kroku probíhá hydrolytické štěpení specifického chromogenního substrátu aktivovaným FXa za vzniku p-nitroanilinu. Měřena je absorbance určité vlnové délky. Intenzita barvy vzniklého p-nitroanilinu odpovídá aktivovanému FX a tím i aktivitě FVIII v testovaném vzorku. Aktivita FVIII v % je odečtena z kalibrační křivky, která je získaná měřením několika ředění standardu s přesně udanou aktivitou FVIII.

Komerčně dostupné jsou různé diagnostické sety, které se liší původem obsažených proteinů (humánní nebo bovinní). Výhodou CSA je, že není citlivá na pre-aktivaci FVIII trombinem a díky většímu ředění vzorku ani na nespecifické inhibitory, heparin nebo přímá orální antikoagulancia (DOACs) [1,11,12,14].

Diskrepance výsledků a doporučení pro monitorování EHL

Diskrepance výsledků FVIII: C mezi metodami jsou popisovány jak pro koncentráty rFVIII o plné délce, tak s deletovanou B-doménou. Literatura uvádí, že výsledky FVIII: C CSA metody jsou vyšší ve srovnání s OSA, klinicky však tato diskrepance není u koncentrátů o plné délce významná, neboť se pohybuje do 20 %. Významné rozdíly jsou u rFVIII s deletovanou B-doménou, kdy výsledky OSA jsou nižší oproti CSA s rozdílem 20–50 %. Uvádí se, že nejen koncentráty s deletovanou B-doménou, ale i takové, které mají B-doménu zkrácenou, vedou k diskrepancím [1,5–7,11]. Dle Peyvandi et al. (2016) se tento problém tolik netýká plazmatických derivátů FVIII. Např. pro Fanhdi® (Grifols) se v literatuře uvádí poměr CSA/OSA 0,97–1,11 [11].

Jak již bylo zmíněno výše, nejvíce problematické je monitorování modifikovaných rekombinantních koncentrátů. Klinicky významné diskrepance jsou popsané pro PEGylované rFVIII koncentráty turoctocog alfa pegol a damoctocog alfa pegol, způsobené pravděpodobně interakcí s křemičitany obsaženými v APTT reagencii, která vede k horšímu zpřístupnění pegylovaného rFVIII pro štěpení trombinem a tím k podhodnocení výsledků OSA metody. Zdá se, že PEGylované koncentráty je možné monitorovat pomocí OSA s kyselinou ellagovou či polyfenoly. Naproti tomu u koncentrátu rurioctocog alfa pegol, který je rovněž PEGylovaný, ale s molekulou rFVIII o plné délce, jednoznačné diskrepance popsány nebyly, ale zároveň se uvádí, že je nezbytné provést další testování [1,5–7,11]. Vhodnost použití vybraných APTT reagencií pro monitorování jednotlivých EHL koncentrátů shrnuje tab. 1.

Efmoroctocog alfa (rFVIIIFc; Elocta®)

Rekombinantní molekula FVIII zkrácená o B-doménu navázaná na Fc doménu lidského IgG1. Dle Souhrnu údajů o přípravku (Summary of Product Characteristics – SPC) lze monitorování provádět jak OSA, tak CSA. U OSA je však nutno brát zřetel na to, že výsledky mohou být ovlivněny typem APTT reagencie a referenčním standardem [15]. Podle několika studií jsou výsledky FVIII: C CSA metody vyšší ve srovnání s OSA [3,16]. Světová hemofilická federace (World Federation of Hemophilia – WFH) doporučuje k monitorování pacientů metodu OSA nebo CSA s kalibrací pomocí plazmatického standardu s návazností na WHO IS [13].

 

Rurioctocog alfa pegol (Adynovi®)

Pegylovaná rekombinantní molekula FVIII o plné délce. Jedná se vlastně o octocog alfa s navázaným 20 kDa polyethylenglykolem. V EU/UK je doporučeno účinnost koncentrátu stanovovat CSA metodou. Dle SPC není doporučena konkrétní metoda k monitorování této léčby a lze použít jak OSA, tak CSA [17]. Dle studie Bulla et al. (2017) výsledky vzorků FVIII deficitní plazmy obohacené o přesné množství rurioctocog alfa pegol (30–80 %) jsou nadhodnoceny OSA metodou o 28–32 % a CSA o 69–82 %. Nadhodnocení výsledků bylo navíc výraznější u nízkých hladin. Odpovídajících výsledků bylo dosaženo při kalibraci pomocí produkt-specifického standardu [5]. V terénní studii Turecek et al (2016), ve které byly testovány rovněž vzorky FVIII deficitní plazmy obsahující definované koncentrace rurioctocog alfa pegol (5 %, 20 % a 80 %), však takto výrazné nadhodnocení publikované nebylo. Výsledky průměrného recovery OSA a CSA metody napříč všemi koncentracemi byly 113 % a 114 % [18]. Young et al. (2019) ve své práci zmiňují, že reagencie obsahující křemičitany vedou k nižším hladinám FVIII: C než reagencie s kyselinou ellagovou nebo polyfenoly [1]. Výsledky dalších prací výrazné diskrepance nepotvrdily. Z důvodu protichůdných výsledků uvedených v současné literatuře WFH nevydala konkrétní doporučení pro monitorování léčby tímto koncentrátem [13].

 

Turoctocog alfa pegol (Esperoct®)

Turoctocog alfa pegol je rekombinantní molekula FVIII se zkrácenou B-doménou a navázanou molekulou polyethylenglykolu o molekulové hmotnosti 40 kDa. Dle SPC nejsou k monitorování léčby vhodné reagencie na bázi oxidu křemičitého, protože způsobují podhodnocení. Aktivátor na bázi oxidu křemičitého totiž způsobuje zpomalení aktivace molekuly turoctocog alfa pegol trombinem ve srovnání s nativním FVIII. WFH doporučuje stejné reagencie/metody jako UHKCDO a BIMHO (tab. 1) [1,5–7,11,13,19,20].

 

Damoctocog alfa pegol (Jivi®)

Jedná se o rekombinantní FVIII s deletovanou B-doménou a navázaným 60 kDa polyethylenglykolem, přesněji s dvěma 30 kDa molekulami polyethylenglykolu. SPC uvádí, že přesnou aktivitu je možné vyšetřit CSA nebo OSA metodou se specifickými reagenciemi. Reagencie na bázi oxidu křemičitého (např. APTT-SP™ nebo STA® – PTT) mohou podhodnotit aktivitu FVIII, a naopak některé reagencie na bázi kaolinu mohou způsobit nadhodnocení [21,22].

MATERIÁL A METODIKA

Ve vzorcích plazmy pacientů, kteří byli léčeni koncentráty FVIII s prodlouženou dobou účinku – efmoroctocog alfa (10 pacientů), rurioctocog alfa pegol (13 pacientů), turoctocog alfa pegol (5 pacientů) a damoctocog alfa pegol (7 pacientů) –, byla vyšetřena aktivita FVIII dvěma metodami. Vzorky byly vyšetřovány v letech 2019–2023 na Oddělení klinické hematologie Fakultní nemocnice Brno v rámci standardní péče o pacienty s hemofilií. Měření probíhalo na přístroji STA R MAX (Stago, Francie) metodou s chromogenními substráty BIOPHEN^TM FVIII: C (HYPHEN BioMed, Francie) a jednofázovou koagulační metodou s využitím dvou APTT reagencií. Do května roku 2023 byla pro metodu OSA využívaná reagencie Cephascreen® (Diagnostica Stago, Francie) obsahující polyfenolický aktivátor a poté, co byla ukončena výroba této reagencie, Pathromtin® SL (Siemens Healthineers, Německo) obsahující aktivátor oxid křemičitý. Metody byly kalibrovány vůči plazmatickému standardu s návazností na WHO IS. Pro každou metodu byly vytvořeny dvě kalibrační křivky, pro nízké a vysoké rozmezí FVIII: C, v rozsahu přibližně 1,2–25 % a 6–110 % pro OSA Cephascreen®, v rozsahu přibližně 0,2–15 % a 10–150 % pro OSA Pathromtin® SL a v rozsahu přibližně 1,6–25 % a 10–200 % pro CSA Hyphen.

Pacientům bylo odebráno standardní množství žilní krve do zkumavek s antikoagulačním roztokem citrátem sodným 0,106 mol/l. Centrifugací 2 500 g 15 min byly získány vzorky citrátové plazmy, které byly šokově zmraženy v tekutém dusíku při –196 °C a skladovány při –80 °C v hlubokomrazícím boxu.

Reliabilita (vzájemná shoda) výsledků FVIII: C obou metod byla zjištěna pomocí koeficientu vnitrotřídní korelace ICC (intra-class correlation coefficient – ICC) s hladinou významnosti 0,05. U tohoto testu je nulovou hypotézou předpoklad nulové hodnoty ICC. P-hodnota vypovídá o shodě metod. Pokud je p menší než 0,05, zamítáme nulovou hypotézu, a jde tak o statisticky významnou korelaci metod. Hodnocen byl i samotný výsledek ICC – interpretace dle Koo a Li (2016) je následující: ICC menší než 0,5: nízká míra shody; ICC 0,5–0,75: mírná až střední míra shody; ICC 0,75–0,90: vysoká míra shody; ICC větší než 0,90: excelentní míra shody [23]. Výsledky s nízkou hodnotou ICC byly vizualizovány formou Bland-Altmanových grafů (hodnoty diference metod vyjádřené v % proti průměrům dvojic výsledků obou metod). Pro orientační posouzení, zda jsou výsledky OSA metody vyšší či nižší ve srovnání s CSA, byly spočítány průměry a průměrná procentuální odchylka: [OSA/CSA] × 100 (%). Za akceptovatelnou jsme považovali diskrepanci do 25 %.

VÝSLEDKY

EFMOROCTOCOG ALFA

OSA Cephascreen®–CSA Hyphen

Celkem bylo vyšetřeno 65 vzorků, 32 vzorků mělo hodnotu FVIII: C v rozsahu přibližně 10–200 % a 33 vzorků v rozsahu přibližně 1–14 %. Pro vzorky s FVIII: C 10–200 % je ICC 0,961 (p < 0,001) a pro 1–14 % ICC 0,922 (p = 0,000677), což odpovídá excelentní míře shody. Porovnáním průměrných hodnot obou metod bylo zjištěno, že výsledky FVIII: C rozsahu 10–200 % jsou OSA metodou v průměru o 10 % nižší ve srovnání s CSA (průměrná hodnota OSA je 62 %, medián 56 % a CSA 70 %, medián 59 %). Výsledky FVIII: C v rozsahu 1–14 % jsou OSA metodou naopak v průměru o 21 % vyšší než CSA (průměrná hodnota OSA činí 5,01 %, medián 4,06 % a CSA 4,15 %, medián 3,38 %).

 

OSA Pathromtin® SL–CSA Hyphen

Těmito metodami bylo vyšetřeno celkem 21 vzorků; 12 vzorků mělo FVIII: C v rozsahu 20–120 % a 9 vzorků v rozsahu 1–10 %. Výsledek ICC pro rozsah FVIII: C 20–120 % je 0,92 (p = 0,00517) a pro FVIII: C 1–10 % ICC 0,963 (p = 0,00111). Výsledky ICC odpovídají rovněž excelentní míře shody.

Výsledky OSA metody jsou v průměru o 15 % nižší než CSA v rozsahu FVIII: C 20–120 % (průměrná hodnota OSA 65 %, medián 73 % a CSA 76 %, medián 85 %). Vzorky s FVIII: C 1–10 % vycházejí naopak v průměru o 18 % OSA metodou vyšší (průměrná hodnota OSA je 4,53 %, medián 3,40 % a CSA 3,84 %, medián 2,68 %).

Graf 1 demonstruje srovnání výsledků FVIII: C OSA s reagenciemi Cephascreen®, Pathromtin® SL a CSA Hyphen, z kterého vyplývá, že v rozsahu přibližně 40–100 % jsou výsledky obou OSA mírně nižší než CSA.

 

RURIOCTOCOG ALFA PEGOL

OSA Cephascreen®–CSA Hyphen

Celkem bylo vyšetřeno 55 vzorků; FVIII: C 27 vzorků byla v rozsahu přibližně 15–200 % a 28 vzorků 1–13 %. Výsledek ICC pro rozsah 15–200 % dosahuje hodnoty 0,962 (p < 0,001), ale pro vzorky s FVIII: C 1–13 % pouze 0,582 (p = 0,0177). Diference nízkých výsledků jsou znázorněné formou Bland-Altmanova grafu (graf 2).

Výsledky FVIII: C v rozsahu 15–200 % jsou průměrně o 11 % nižší metodou OSA (průměrná hodnota OSA je 68 %, medián 66 % a CSA 76 %, medián 79 %), ale výsledky FVIII: C 1–13 % jsou naopak metodou OSA vyšší, průměrně o 54 % (průměrná hodnota OSA je 5,22 %, medián 4,96 % a CSA 3,38 %, medián 2,96 %).

Z grafu 2 je patrné, že větší rozdíly mezi výsledky můžeme pozorovat u FVIII: C 10–13 %. Výsledky pod 10 % jsou OSA metodou vyšší pouze o 35 % ve srovnání s CSA.

 

OSA Pathromtin® SL–CSA Hyphen

Vyšetřeno bylo 18 vzorků, v rozsahu FVIII: C 80–150 % 4 vzorky a 14 vzorků s FVIII: C menší než 10 %. Výsledek ICC pro rozsah 80–150 % činí 0,726 (p = 0,0713) a pro FVIII: C menší než 10 % 0,71 (p = 0,00112). Hodnoty ICC odpovídají pouze střední shodě. Výsledky v rozsahu 80–150 % nedosahují statisticky významné korelace pravděpodobně z důvodu malého počtu pozorování.

Výsledky v rozsahu 80–150 % jsou v průměru o 18 % nižší OSA metodou (průměr OSA je 95 %, medián 105 % a CSA 116 %, medián 132 %), výsledky FVIII: C menší než 10 % jsou metodou OSA v 6 případech vyšší, průměrně o 75 %, zatímco v 8 případech jsou shodné (celkový průměr OSA 4,1 %, medián 2,62 a CSA 4,5 %, medián 2,94 %).

Z porovnání výsledků 5 vzorků s FVIII: C menší než 13 % vyšetřených metodami OSA Cephascreen® a Pathromtin® SL jsme navíc zjistili, že výsledky s reagencií Cephasreen® jsou v průměru o 50 % vyšší než u Pathromtin® SL.

 

TUROCTOCOG ALFA PEGOL

OSA Cephascreen®–CSA Hyphen

Vyšetřeno bylo celkem 42 vzorků, z toho 26 vzorků s FVIII: C v rozsahu přibližně 15–200 % a 16 vzorků s FVIII: C menší než 13 %. Hodnota ICC pro rozsah 15–200 % činí 0,708 (p = 0,0395) a pro FVIII: C menší než 13 % 0,869 (p < 0,001). Diference výsledků FVIII: C 15–200 % jsou znázorněné formou Bland-Altmanova grafu (graf 3).

Výsledky FVIII: C v rozsahu 15–200 % jsou metodou OSA v průměru o 36 % nižší ve srovnání s CSA (průměrná hodnota OSA 52 %, medián 47 % a CSA 81 %, medián 77 %). U výsledků FVIII: C menší než 13 % nelze, dle našeho pozorování, jednoznačně určit, zda jsou hodnoty OSA metody spíše nižší či vyšší než CSA.

 

OSA Pathromtin® SL–CSA Hyphen

Pro porovnání výsledků těchto metod bylo vyšetřeno celkem 12 vzorků, 6 vzorků s FVIII: C v rozsahu 20–170 % a 6 vzorků s FVIII: C menší než 10 %. Pro výsledky v rozsahu 20–170 % je hodnota ICC 0,89 (p = 0,027) a pro FVIII: C menší než 10 % 0,839 (p = 0,00503).

Výsledky OSA metody jsou v rozsahu 20–170 % v průměru o 25 % nižší ve srovnání s CSA (průměrná hodnota OSA 63 %, medián 55 % a CSA 84 %, medián 76 %). Rovněž výsledky FVIII: C menší než 10 % jsou metodou OSA nižší, průměrně o 19 % (průměrná hodnota OSA 3,65 %, medián 3,78 % a CSA 4,52 %, medián 4,57 %).

DAMOCTOCOG ALFA PEGOL

OSA Cephascreen®–CSA Hyphen

Vyšetřeno bylo celkem 34 vzorků, 16 vzorků s FVIII: C v rozsahu přibližně 10–200 % a 18 s FVIII: C menší než 10 %. Hodnota ICC je pro rozsah 10–200 % 0,941 (p = 0,000504) a pro FVIII menší než 10 % pouze 0,523 (p = 0,0943). Diference výsledků FVIII: C menší než 10 % jsou znázorněné formou Bland-Altmanova grafu (graf 4).

V průměru jsou výsledky FVIII: C v rozsahu 10–200 % OSA metodou o 18 % vyšší než CSA (průměrná hodnota OSA 72 %, medián 57 % a CSA 61 %, medián 53 %). Výraznější diskrepance jsme pozorovali u vzorků s aktivitou FVIII menší než 10 %, výsledky OSA metody jsou vyšší než CSA, a to v průměru o 91 % (průměrná hodnota OSA metody 5,28 %, medián 3,84 % a CSA 2,77 %, medián 2,57 %).

OSA Pathromtin® SL–CSA Hyphen

Těmito metodami bylo vyšetřeno pouze 7 vzorků, 3 vzorky v rozsahu FVIII: C 39–74 % a 4 vzorky s FVIII: C menší než 10 %. Výsledek ICC je pro rozsah 39–74 % 0,919 (p = 0,0172) a pro FVIII: C menší než 10 % pak 0,00 (p = 0,6), což znamená, že mezi metodami není žádná korelace.

Výsledky v rozsahu 39–74 % dosahovaly oběma metodami prakticky stejných hodnot, k dispozici byl však omezený počet vzorků, tudíž nelze učinit jednoznačný závěr stran diskrepancí. Výsledky vzorků s FVIII: C menší než 10 % jsou OSA metodou v průměru o 100 % vyšší než CSA (průměrná hodnota OSA 5,27 %, medián 5,42 % a CSA 2,63 %, medián 2,76 %).

 

DISKUZE

Diskrepance výsledků aktivity FVIII při monitorování substituční léčby modifikovanými koncentráty vedou k potřebám upravit metodiky v klinických laboratořích, aby byla zajištěna adekvátní léčba. Cílem této práce bylo porovnat výsledky FVIII: C jednofázové koagulační metody s metodou s chromogenními substráty u pacientů léčených vybranými EHL koncentráty. Metoda s chromogenními substráty je Evropským lékopisem stanovena jako referenční metoda pro stanovení účinnosti koncentrátů FVIII a je doporučována i pro vyšetřování vzorků pacientů organizacemi, jako jsou britská UKHCDO a francouzská BIMHO, vyjma produktu rurioctocog alfa pegol, u kterého nejsou výsledky zcela jasné, a je proto nutné provést další studie.

Britská skupina UKHCDO obecně doporučuje metodu, která byla ověřena na nízkých, středních a vysokých hladinách FVIII: C a poskytuje výsledky do ± 20 % od cílové hodnoty pro FVIII: C větší než 30 % a do ± 30 % od cílové hodnoty pro FVIII: C v rozsahu 10–30 % [5]. Množství laboratorních studií pak považuje za akceptovatelnou diskrepanci mezi cílovou a naměřenou hodnotou do 25–30 % [5,20]. V našem případě jsme cílovou hodnotu neznali, neboť jsme porovnávali výsledky od reálných pacientů, proto jsme vycházeli z doporučení, že CSA je vhodnější k monitorování EHL a výsledky OSA jsme porovnávali vůči CSA.

Výsledky FVIII: C při léčbě efmoroctocog alfa dosahují podobných hodnot všemi testovanými metodami (ICC se blíží 1,0 a p hodnoty dosahují statisticky významné korelace). I přes výbornou shodu lze pozorovat, že výsledky nad 10 % dosahují oběma OSA lehce nižších hodnot (průměrně o 10, resp. 15 %), zatímco výsledky pod cca 10 % naopak hodnot vyšších (průměrně o 21, resp. 18 %). Podobné výsledky publikovali i Lowe et al. (2020), kdy v rámci kontrol UK NEQAS BC byly do 81 center zaslány 2 vzorky pacientů léčených koncentrátem efmoroctocog alfa a 2 vzorky FVIII-deficitní plazmy obohacené o definované množství tohoto koncentrátu. Z testování vyplynulo, že vzorky s FVIII: C ≤ 11 % dosahovaly OSA metodou o 15 % vyšších hodnot, přičemž vzorky s FVIII: C 55–70 % byly naopak CSA metodou vyšší o 20 %. Autoři zároveň uvádějí, že není rozdíl mezi vzorky od pacientů a uměle připravenými vzorky [24].

U léčby rurioctocog alfa pegol dobře koreluje OSA Cephascreen® a CSA v rozsahu FVIII: C 15–200 %, u nízkých hodnot (menší než 13 %) je korelace nejednoznačná, dle ICC je patrná spíše slabší shoda a výsledky OSA jsou vyšší v průměru o 54 %. Co se týče korelace OSA Pathromtin® SL a CSA, tak pro rozsah 80–150 % dosahuje ICC pouze střední shody bez statisticky významné korelace, což je způsobeno pravděpodobně malým počtem pozorování. Výsledky nižší než 10 % jsou těmito metodami ve střední shodě se statisticky významnou korelací, přestože jsme v několika případech pozorovali výrazně vyšší výsledky OSA metodou.

Nadhodnocení výsledků OSA metodou u vzorků s nízkou FVIII: C bylo pozorováno i v jedné mezinárodní terénní studii (Turecek PL et al., 2016). Průměrné recovery vzorků FVIII-deficitní plazmy obohacené o rurioctocog alfa pegol s aktivitou 5 % bylo 124,3 %. Vzorky s FVIII: C 80 % dosahovaly naopak recovery 101 %. Obecně vyšší výsledky byly pozorovány u APTT reagencií na bázi kyseliny ellagové/polyfenolů než u reagencií na bázi oxidu křemičitého/kaolinu. Výsledky CSA metody s různými sety napříč všemi koncentracemi byly s recovery 114 % (rozsah 95–124 %) [18]. Stejně tak i výsledky našeho měření ukázaly, že hodnoty OSA jsou u FVIII: C menší než 13 % vyšší než CSA a že výsledky OSA Cephascreen® jsou zároveň vyšší než OSA Pathromtin® SL.

Výsledky koncentrátu turoctocog alfa pegol jsou obecně OSA metodami nižší než CSA. Vyšší diskrepanci jsme pozorovali u vzorků s FVIII: C větší než 15 %. Dle průměrných hodnot jsou výsledky OSA Cephascreen® nižší o 36 % a dle ICC panuje mezi metodami pouze střední shoda. Dobré shody u vzorků s FVIII: C větší než 20 % dosahuje s CSA Hyphen OSA Pathromtin® SL, průměrné hodnoty OSA jsou však nižší o 25 %. Obě OSA statisticky významně korelují s CSA u vzorků s FVIII: C menší než 13 %. Podle výsledků studie Hillarp A. et al (2017), ve které byly analyzovány vzorky FVIII-deficitní plazmy s turoctocog alfa pegol o aktivitě 3 %, 20 %, 60 % a 90 % ve dvou centrech (Sheffield, UK a Malmö, Švédsko) na analyzátorech ACL TOP (IL, Bedford, MA, USA), CS5100i (Sysmex® Kobe, Japonsko) a BCS® XP (Siemens, Marburg, Německo), dochází s chromogenním setem Hyphen k nadhodnocení výsledků (recovery 126–144 %), zatímco recovery OSA Pathromtin® SL bylo 90–105 % v prvním centru a 94–95 % v druhém centru [25]. Rovněž naše výsledky dosahovaly chromogenní metodou Hyphen vyšších hodnot, výsledky OSA Cephascreen® i Pathromtin® SL byly u vzorků s FVIII: C větší než 15 % nižší v průměru o 36 % a 25 %.

Nejvyšší míru diskrepance jsme pozorovali u vzorků obsahujících koncentrát damoctocog alfa pegol s FVIII: C menší než 10 %. Výsledky nedosahují statisticky významné korelace a jsou OSA metodami vyšší v průměru o 91 % a 100 %. Vzorky s FVIII: C větší než 10 % nabývají podobných hodnot oběma metodami a je mezi nimi dle hodnoty ICC excelentní míra shody. Mezinárodní laboratorní studie (Church et al., 2018) prokázala, že OSA Pathromtin® SL je vhodná k monitorování damoctocog alfa pegol. V této studii byly analyzovány vzorky FVIII-deficitní plazmy obsahující tento koncentrát v aktivitě 4,3 %, 37,5 % a 86,5 %. Průměrné recovery vzorků obsahující střední a vysokou aktivitu FVIII bylo 115 a 111 %. Výsledky vzorků s nízkou aktivitou FVIII ale byly nadhodnoceny s průměrným recovery 129 %. Vzorky byly vyšetřeny i CSA s recovery v rozsahu 101,4–117,1 % [21].

U většiny koncentrátů jsme pozorovali, že výsledky FVIII: C menší než 10 % vychází OSA metodou bez ohledu na APTT reagencii vyšší než CSA, kromě koncentrátu turoctocog alfa pegol, kde vychází OSA Pathromtin® SL nižší v průměru o 19 %. Dle literatury by měla být metoda s chromogenními substráty vhodnější pro nízké hodnoty FVIII: C, protože jednofázová koagulační metoda výsledky FVIII: C menší než 5 % nadhodnocuje [19,26]. Nadhodnocení nízkých hodnot FVIII: C je pravděpodobně způsobené tím, že v rámci přípravy kalibrační křivky pro nízké rozmezí je nutné mnohonásobně ředit plazmatický standard pufrem, čímž dochází k naměření delších koagulačních časů pro jednotlivé body. Při vyšetřování vzorků pak vzniká nepoměr mezi koagulačními časy testovaných vzorků (tyto nejsou tolik ředěny pufrem) a standardem a z kalibrační křivky je odečtena vyšší hodnota aktivity FVIII. Řešením tohoto problému by mohlo být předředění standardu pomocí FVIII-deficitní plazmy. Diskrepance mezi ředěním pufrem a FVIII-deficitní plazmou je pravděpodobně způsobena různým obsahem fibrinogenu, FV a vitamin K-dependentních faktorů [27,28].

 

ZÁVĚR

Naše data ukázala, že výsledky metod OSA a CSA dobře korelují v celé škále testovaných hladin FVIII: C u koncentrátu efmoroctocog alfa. U koncentrátu rurioctocog alfa pegol s CSA dobře korelují pouze výsledky větší než 15 % OSA Cephascreen® (Pathromtin® SL je v rozsahu 80–150 % s CSA ve střední shodě, ale bez statisticky významné korelace), u výsledků menších než 13 % je shoda obou OSA s CSA nejednoznačná. Hodnoty FVIII: C turoctocog alfa pegol větší než 15 % jsou OSA metodami nižší se slabší korelací, ale výsledky menší než 13 % statisticky významně korelují. Výrazně vyšší výsledky OSA ve srovnání s CSA jsme pozorovali u damoctocog alfa pegol u FVIII: C menších než 10 %, výsledky větší než 10 % však korelují dobře. Kromě jednoznačně vyšší diskrepance metod OSA a CSA u FVIII: C menší než 10 % pro koncentrát damoctocog alfa pegol jsou rozdíly mezi metodami pro ostatní výše zmíněné koncentráty klinicky akceptovatelné.

 

POUŽITÉ POJMY A ZKRATKY

APTT – aktivovaný parciální tromboplastinový test

BIMHO – Francouzská studijní skupina pro biologii hemoragických onemocnění (French Study Group on the Biology of Hemorrgahic Disease)

CSA – metoda s chromogenními substráty (chro\\mogenic substrate assay)

DOACs – přímá orální antikoagulancia (direct oral anticoagulants)

EHL – prodloužený poločas (extended half-life)

FVIII – koagulační faktor VIII

FVIII: C – koagulační aktivita FVIII

FIXa – aktivovaný koagulační faktor IX

FX – koagulační faktor X

FXa – aktivovaný FX

OSA – jednofázová koagulační metoda (one-stage clotting assay)

IgG – imunoglobulin G

kDa – kilodalton

pdFVIII – plazmatický FVIII (plasma derived)

PEG – polyethylenglykol

rFVIII – rekombinantní FVIII

SD – směrodatná odchylka (standard deviation)

SPC – souhrn údajů o přípravku (summary of product characteristics)

SSC ISTH – Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis

WHO – Světová zdravotnická organizace (World Health Organization)

UKHCDO – United Kingdom Haemophilia Centres Doctor’s Organisation

UK NEQAS BC – United Kingdom External Quality Assessment for Blood Coagulation

WFH – Světová federace hemofilie (World Federation of Hemophilia)

WHO IS – WHO Mezinárodní standard (WHO International Standard)