Rodinná studie polymorfismu antigenů systému MNS

Souhrn

SOUHRN: Úvod: Mutace v genech GYPA a GYPB kódujících systém MNS mohou způsobit sníženou až vymizelou expresi antigenů na povrchu erytrocytů. Může tak dojít k diskrepantnímu nálezu mezi výsledky imunohematologického a genetického vyšetření. Cílem této studie bylo prokázat, že diskrepantní nález při vyšetřování antigenů systému MNS může být způsoben mutací genu GYPB, a prověřit, zda se tato mutace vyskytuje i u potomků pacientky. Materiál a metodika: Na Transfuzním oddělení Krajské nemocnice Liberec, a. s., (KNL) byl v roce 2019 u pacientky A1 vyšetřen rozšířený fenotyp MNS imunohematologickými metodami: sloupcovou aglutinací a zkumavkovou technikou. Na Ústavu hematologie a krevní transfuze (ÚHKT) byl nález konfirmován metodou sloupcové aglutinace a byl stanoven genotyp pomocí PCR Fluogene. V roce 2022 byly vyšetřeny vzorky krve potomků pacientky A1 imunohematologickými metodami: fenotyp metodou sloupcové aglutinace a metodou pevné fáze na Transfuzním oddělení KNL a metodou sloupcové aglutinace v ÚHKT. Genetické vyšetření bylo v KNL provedeno pomocí real-time PCR ERY Q KKD/MNS-TYPE na Oddělení genetiky a molekulární diagnostiky (OGMD) a v ÚHKT metodami PCR: PCR Fluogene a ID CORE XT. Výsledky: U pacientky A1 byl zjištěn diskrepantní nález v antigenu S: fenotyp antigenů S–s+ a genotyp S+s+. U této pacientky byl dále zachycen zeslabený antigen M a negativita antigenu N. Vyšetřeni byli všichni pokrevně příbuzní pacientky (potomci) – celkem 9 (3 synové, 1 dcera, 4 vnoučata a 1 pravnuk). U potomků probandky byl zjištěn antigen S+, nebo S–, nikdy však nebyl zachycen diskrepantní výsledek mezi imunologickými a genetickými metodami. Závěr: U pacientky A1 byl zachycen diskrepantní nález ve výsledcích vyšetřovacích metod pro antigen S, který byl velmi pravděpodobně způsobený genetickou změnou v genu pro glykoforin B. Tato mutace se nepřenesla na žádného z potomků.

Klíčová slova:

erytrocytární antigeny – diskrepantní nález – rodinná studie

ÚVOD

Vyšetřování systému krevních skupin MNS má v transfuzním lékařství význam pro podávání kompatibilních transfuzních přípravků. Nesoulad v tomto antigenním systému erytrocytů může být vzácně příčinou i hemolytického onemocnění plodu/novorozence [1]. Mutace v genech pro erytrocytární antigeny mohou způsobit jejich sníženou až vymizelou tvorbu. Může tak dojít k vzácnému diskrepantnímu nálezu mezi imunohematologickým a genetickým vyšetřením, kdy má pacient genetickou metodou potvrzenou přítomnost genu pro antigen, který však není detekovatelný běžnými imunohematologickými metodami [2]. Principem tohoto diskrepantního nálezu není chyba, ale detekce genu v jiném místě, než se nachází kauzální mutace.

Antigeny systému MNS, glykoforiny A a B, jsou kódovány geny GYPA (8 exonů, chromozom 4q31.21) [3] a GYPB (8 exonů, chromozom 4q31.21) [4], které jsou z 97 % homologní [4]. V internetové databázi alel erytrocytárních antigenů jsou uvedeny mutace genu GYPB způsobující fenotyp S–. U genu GYPB jsou detekovány většinou mutace substituční, translokační, deleční vedoucí k poruše čtecího rámce a k produkci nefunkčního proteinu nebo mutace intronové mající za výsledek alternativní sestřih pre-mRNA (např. mutace v intronu 4) [5].

Byly publikované studie popisující diskrepantní nálezy ve výsledcích antigenu S testovaných imunohematologickými a genetickými metodami. V brazilské populaci u osob se sérologicky negativním antigenem S byl v 10 % antigen S geneticky pozitivní, fenotyp S–s+ a genotyp S+s+ podmiňovala heterozygotní mutace IVS5+5g>t, resp. c.270+5G>T (rs139511876) genu GYPB [6]. V jiné studii byl popsán případ 3 pacientů s fenotypem S–s+ a současně genotypem S+s+. Jednalo se o mutace genu GYPB: již uvedenou c.270+5G>T (rs139511876) a současně navíc c.230C>T (rs79492560) [7], označené v databázi genů: MK208314 [8]. Následkem těchto mutací v jednom genu je blokována exprese antigenu S [7]. Změny exprese S antigenu způsobují také hybridní geny (spojení fragmentů genů pro glykoforiny A a B do jednoho genu). Vznikne tak alela GYP (B-A) a GYP (B-A-B) s fenotypem S–s+ [5].

U pacientky A1 léčené pro diagnózu low-grade B-NHL bez specifického hematologického fenotypu se nepodařilo sérologicky uzavřít výsledek antigenů MN. Vzorek byl přešetřen v Referenční laboratoři pro imunohematologii ÚHKT v Praze, kde byl zjištěn polymorfismus: zeslabená reakce při typování antigenu M, antigen N negativní a diskrepantní nález při typování antigenu S: fenotyp S–, avšak genotyp S+. Výsledek byl uzavřen jako susp. mutace glykoforinů a bylo doporučeno provést rodinnou studii. Vzorek pacientky byl odeslán ke genotypizaci do zahraniční laboratoře (Inno-train diagnostik GmbH, Kronberg, Německo). Cílem této studie bylo prokázat, že polymorfismus antigenů v systému MNS může být způsobený mutací genů pro glykoforin, a prověřit, zda se tato mutace vyskytuje i u potomků pacientky.

MATERIÁL A METODIKA

V roce 2019 byla vyšetřena pacientka A1 a v roce 2022 její potomci. Rozšířený fenotyp (systém MNS) byl stanoven na Transfuzním oddělení KNL imunohematologickými metodami: antigeny MN metodou sloupcové aglutinace v kartách DG Gel Neutral a antigeny Ss metodou sloupcové aglutinace v kartách DG Gel Coombs na analyzátoru Erytra (Grifols, Španělsko) a aglutinační metodou a metodou pevné fáze na analyzátoru Galileo NEO (Immucor, USA). Antigeny Ss byly pouze u pacientky A1 vyšetřeny zkumavkovou metodou pomocí diagnostik ImmuClone (Immucor Medizinische Diagnostik GmbH, Německo). Genetické vyšetření bylo provedeno real-time PCR soupravou ERY Q KKD/MNS-TYPE (BAG Diagnostics GmbH, Německo), termocykler CFX96 Real Time system C1000 (Bio-Rad, USA), software PlexTyper na hodnocení produktů (BAG Diagnostics GmbH, Německo) na Oddělení genetiky a molekulární diagnostiky (OGMD) KNL.

V ÚHKT byl vyšetřen rozšířený fenotyp MNS pomocí sloupcové aglutinace DiaClon (Bio-Rad, USA), MonoType Dual, DG Gel Neutral (Grifols, Španělsko) a ImmuClone (Immucor Medizinische Diagnostik GmbH, Německo). Genotypizace byla provedena pomocí PCR Fluogene na principu detekce PCR produktu fluorescencí (Inno-train diagnostik GmbH, Německo) a ID CORE XT na principu technologie Luminex (Progenika Biopharma, S.A., Španělsko).

VÝSLEDKY

U pacientky A1 byl zjištěn fenotyp antigenů S–s+ a genotyp S+s+. Dále byla detekována zeslabená reakce při vyšetření antigenu M a antigen N negativní. Antigen M v homozygotní formě byl zeslabený při sérologickém vyšetření s použitím diagnostik Monotype Dual, avšak jasně pozitivní při použití diagnostik ImmuClone nebo geneticky pomocí PCR Fluogene. V zahraniční laboratoři byly u pacientky A1 zjištěny antigeny M+N–S+s+ metodou PCR Fluogene, avšak M+N–S–s+ pomocí ID CORE XT. Sekvenace genů GYPA a GYPB tam však nebyla provedena bez uvedení důvodu. Vzhledem k úmrtí pacientky nebyl možný odběr nového vzorku k detailnímu dovyšetření.

U všech 9 potomků pacientky bylo zjištěno, že antigen S byl buď pozitivní, nebo negativní, nikoliv zeslabený, u žádného z nich nebyl zachycen diskrepantní nález u antigenu S (obr. 1).

U všech potomků byl zjištěn antigen M+ v homozygotní formě stejně jako u pacientky A1. U všech potomků bylo dosaženo stejných výsledků srovnáním imunohematologických a genetických metod. Rozdíly ve vyšetření potomků nebyly zjištěny ani mezi laboratořemi ÚHKT a KNL.

DISKUZE

Diskrepantní nález v antigenu S u pacientky A1 nebyl zjištěn u jejích potomků. Potomci měli antigen S+, nebo S– potvrzený sérologicky i geneticky v obou laboratořích, tedy tato genetická změna se nepřenesla na žádného z nich. Pokud nejsou gen GYPB nebo introny mutované, výsledky fenotypu i genotypu se shodují.

V zahraniční laboratoři byl u pacientky A1 zjištěn genotyp M+N–S+s+ metodou PCR Fluogene, avšak M+N–S–s+ pomocí ID CORE XT. V obou metodách byly pravděpodobně použity DNA primery nasedající na odlišné sekvence genu GYPB kódujícího antigen S, v případě ID CORE XT primer pravděpodobně nasedal v již mutované oblasti.

U pacientky A1 se s vysokou pravděpodobností jednalo o genetickou změnu, známou nebo novou. Byly publikované případy pacientů s fenotypem S–s+ a genotypem S+s+, kdy nedochází k expresi antigenu S z důvodu mutací genu GYPB: současně c.230C>T a c.270+5G>T [7] nebo samostatně c.270+5G>T [6]. Další příčinou mohly být hybridní alely GYP (B-A) a GYP (B-A-B) s fenotypem S–s+ [5], avšak nepodařilo se zjistit, zda komerčně dostupné soupravy PCR budou detekovat alterovaný glykoforin B, a tedy jejich genotyp bude S+.

Protilátky anti-S jsou klinicky významné, mohou způsobit i těžké hemolytické onemocnění plodu/novorozence a závažnou, až fatální hemolytickou potransfuzní reakci [1]. Pacientka A1 byla v laboratorním informačním systému označena jako antigen S negativní a při výskytu protilátky anti-S bychom museli podávat transfuzní přípravky erytrocytů S–.

Dále byl u pacientky A1 zjištěn zeslabený M antigen, u všech potomků však byl normální M antigen, navíc alela M v homozygotní formě. V bělošské populaci je homozygozita M zastoupena ve 28–30 % [1]. Diskrepantní nález by nebyl zachycen, kdyby nebylo doplněno genetické vyšetření z důvodu zeslabeného M antigenu. Z toho lze odvodit, že takové diskrepantní nálezy se mohou v populaci vyskytovat ve vyšším počtu. Jak bylo popsáno např. v brazilské studii [6], mohou být náhodně odhaleny při genetickém vyšetření z jiného důvodu. Při úmrtí jedinců mohou vymizet z populace.

Diskrepantní nálezy mezi genotypem a fenotypem u erytrocytárních antigenů je nutné objasnit. Pro zjištění příčiny polymorfismu by bylo vhodné provést sekvenaci genů GYPA a GYPB, která však nebyla provedena z rozhodnutí zahraniční laboratoře bez uvedení důvodu. Vzhledem k úmrtí pacientky nebyl možný odběr nového vzorku k detailnímu genetickému dovyšetření. Mohla být objevena nová alela nebo varianta. Nové mutace se vyskytují zejména tehdy, když testovaní jedinci pocházejí z minoritních etnických skupin, což v naší populaci není běžné. Dále se diskrepantní nálezy mohou objevit po zavedení velkoobjemové typizace DNA [9], např. při vývoji nových metod vyšetření v transfuzním lékařství (microarray) [10,11]. Pokud analýzou DNA nevyšetříme všechny nukleotidy genu, nemusí dojít k odhalení všech vzácných nebo nových mutací.

ZÁVĚR

U pacientky byl zachycen diskrepantní nález v antigenu S, způsobený velmi pravděpodobně genetickou změnou glykoforinu B, která se však nepřenesla na žádného z potomků. Diskrepantní nález by nebyl zachycen, pokud by neproběhlo genetické vyšetření z důvodu zjištěného zeslabeného antigenu M.

SEZNAM ZKRATEK