Mikroprostředí kostní dřeně a jeho role v patogenezi leukemií

Souhrn

Mikroprostředí kostní dřeně hraje zásadní úlohu v procesu krvetvorby. Má podpůrnou funkci pro klidové kmenové buňky usídlené v tzv. nikách kostní dřeně, vytváří podmínky pro rozrůzňování kmenových buněk a novotvorbu krevních elementů. Za určitých podmínek může dojít k osídlení (tzv. homing) mikroprostředí kmenovými buňkami kolujícími v periferní krvi (čehož se využívá u transplantací krvetvorných buněk). Je pravděpodobné, že podobný mechanismus využívá i nádorová (leukemická) buňka. Infiltruje mikroprostředí kostní dřeně a využívá výše zmíněných podpůrných funkcí mikroprostředí k nádorovému růstu, proliferaci a větší či menší diferenciaci leukemické populace.

Klíčová slova:
krvetvorba, mikroprostředí kostní dřeně, niky kmenových krvetvorných buněk

Stavba a mikroprostředí kostní dřeně

Kostní dřeň, která u dospělého člověka váží přibližně 2600 g, je největším orgánem lidského těla. Skládá se z krvetvorných buněk, krevních sinusoid, stromatu (z řeckého stroma, lůžko) a mezibuněčné matrix.

Krvetvorné buňky – v krvetvorné tkáni se nachází přibližně 1 až 4 hematopoetické kmenové buňky na 100 tisíc jaderných buněk. Identifikace nezralých kmenových hematopoetických buněk od více diferencovaných progenitorových buněk je možná na základě různých fyzikálních vlastností, imunofenotypických a funkčních znaků. Mezi imunofenotypické znaky hemopoetické kmenové buňky patří: CD34⁺ CD90⁺ Kit⁺ CD10^- CD14^- CD15^- CD16^- CD19^- CD20^- (1).

Endotelie krevních sinusoid hrají roli v přechodu zralých krevních elementů ze dřeně do periferního oběhu. Zralé krevní elementy pravděpodobně přecházejí cytoplazmou endotelií, ne mezibuněčnými prostory, jak se předpokládalo dříve. Dále hrají endotelie specifickou úlohu ve vychytávání hematopoetických progenitorových buněk z krevního oběhu a zajišťují jejich „homing“ do stromatu kostní dřeně (1).

Stroma představuje mikroprostředí kostní dřeně, ve kterém rostou a diferencují hematopoetické kmenové buňky. Skládá se z myofibroblastů (retikulární buňky), adipocytů, makrofágů, lymfocytů, plazmatických buněk, endoteliálních, mezenchymálních kmenových a dalších buněk. Myofibroblasty svými výběžky vytváří retikulární síť, v níž jsou zachyceny krvetvorné buňky. Retikulární síť je vyplněna mezibuněčnou hmotou, která je tvořena stromálními buňkami. Mezibuněčná hmota obsahuje různé vláknité proteiny, glykoproteiny a proteoglykany (např. kolagen typu I, III, IV, V, VI, fibronektin, laminin, hemonektin, tenascin, trombospondin aj.) (2–5). Stroma kostní dřeně řídí proliferaci, diferenciaci, obnovu a „homing“ hematopoetických progenitorových buněk a zajišťuje přechod zralých krevních elementů z kostní dřeně do periferního krevního oběhu. Tato funkce je zajištěna jednak stromálními buňkami, které vytváří a secernují růstové faktory, dále mezibuněčnými interakcemi (interakce stromálních buněk s hematopoetickými buňkami), a také interakcemi na molekulární úrovni (tedy mezi hematopoetickými buňkami a složkami extracelulární matrix). Termínem „homing“ označujeme proces, kterým hematopoetické kmenové buňky opouštějí krevní cirkulaci a selektivně osídlují stroma kostní dřeně, ve kterém vysoce specifickými mechanismy interagují s jednotlivými složkami dřeně a zahajují tímto proces krvetvorby (6). „Homing“ se nevyskytuje pouze u hematopoetických progenitorových buněk, které se v cirkulaci běžně objevují, ale také u hematopoetických kmenových buněk, které se do krevního oběhu dostanou arteficiálně transplantací kmenových hematopoetických buněk. Není zcela zřejmé, zda mechanismy „osídlení“ kostní dřeně jsou stejné pro transplantované a normálně cirkulující kmenové hematopoetické buňky. V obou případech však cirkulující progenitory nejprve přilnou k endoteliím krevních sinusoid a poté dochází k migraci progenitorů skrze endotelie do extravaskulárního prostoru uvnitř stromatu kostní dřeně. Proteiny mezibuněčné hmoty poté zahajují a udržují proces dlouhodobé krvetvorby (6). Výzkumy bylo prokázáno, že přihojení štěpu a „homing“ hematopoetických kmenových buněk mohou být zvýšeny inhibicí nebo úplnou delecí peptidázové aktivity proteinu CD26 na povrchu vysoce purifikovaných hematopoetických kmenových buněk (7).

Přímé molekulární interakce mezi krvetvornými buňkami a buňkami stromatu zahrnují interakce ligand-receptor adhezivních molekul na povrchu hemopoetických α a β stromálních buněk. Je známo mnoho buněčných adhezivních molekul, které mohou být rozděleny do několika skupin: sialomuciny, selektiny, integriny a velká skupina imunoglobulinů (8).

Integriny jsou heterodimerické, transmembránové proteiny složené z α a β podjednotky, které jsou spojeny nekovalentní vazbou. Obě podjednotky mají extracelulární a intracelulární doménu. Je známo 18 typů podjednotek α a 8 typů podjednotek β. Do rodiny integrinů se řadí VLA-4 antigen (very late antigen) složený z podjednotky α₄ a β₁, který je exprimován na povrchu hematopoetických progenitorových buněk a váže se k adhezivní molekule skupiny imunoglobulinů VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule) přítomných na stromálních buňkách, makrofázích a endoteliích krevních sinusoid (9). U myší, kterým byla specificky vyřazena funkce α₄ integrinu, docházelo k hromadění hematopoetických kmenových a progenitorových buněk v periferní krvi a slezině a současnému snížení počtu hematopoetických kmenových buněk a progenitorů v kostní dřeni. U těchto myší dochází za normálních podmínek k dostatečné tvorbě krevních elementů, mají však opožděnou odpověď za stresových podmínek (po administraci erytropoetinu, opožděný „homing“ po transplantaci kmenových krvetvorných buněk a krátce trvající přihojení štěpu) (10). Podávání protilátek proti VLA-4 či VCAM-1 zvířatům zvyšuje uvolnění (mobilizaci) hemopoetických kmenových buněk a více diferencovaných progenitorových buněk z kostní dřeně (11, 12) a snižuje „homing“ hemopoetických kmenových buněk po transplantaci (13, 14). U pacientů s myelodysplastickým syndromem CD34+ progenitory kostní dřeně vykazují sníženou expresi VLA-4. Tito pacienti mají hypercelulární kostní dřeň, ale nedostatek cirkulujících hematopoetických buněk, svědčící pro chybné vyplavování buněk z kostní dřeně a zvýšenou intramedulární apoptózu (15). Delece genu pro VCAM-1 (16,17) sice nenarušuje hemopoezu či udržování kmenových hematopoetických buněk v kostní dřeni, ale ovlivňuje migraci, především T-lymfocytů, do kostní dřeně a megakaryopoezu (18).

Selektiny jsou buněčné adhezivní molekuly, jejichž funkcí je „homing“ lymfocytů do lymfatických tkání a podporují „rolling – kutálení“ a „adhezi – přilnutí“ leukocytů k buňkám endotelu. Hematopoetické kmenové buňky na svém povrchu také obsahují receptory pro selektiny (19, 20), které tak mohou hrát důležitou roli v migraci kmenových buněk skrz buňky endotelu (21).

Dalším příkladem receptoru a jeho ligandu, jež hraje důležitou roli v interakci mezi kmenovou buňkou a stromatem kostní dřeně, je chemotaktický receptor CXCR4 a jeho liganda SDF-1 (stromal-derived factor-1α) secernovaný stromatem kostní dřeně. Je to jediný známý chemokin, který vyvolává přímou chemotaktickou odpověď hematopoetických kmenových buněk cestou interakce s CXCR4 receptorem na jejich buněčném povrchu (22, 23). Myši, kterým chybí SDF-1 nebo CXCR4, mají porušenou krvetvorbu ve fetální kostní dřeni vzhledem ke snížené schopnosti hematopoetických kmenových buněk z fetálních jater k osídlování fetální kostní dřeně a dřeňové dutiny (24, 25). C3a složka komplementu, která je secernována stromálními buňkami kostní dřeně a jehož hladina je fyziologicky zvýšena při stresu, zvyšuje vazbu CXCR4 k SDF-1 a tím podporuje „homing“ hematopoetických kmenových buněk do kostní dřeně stejně jako stimuluje progenitorové buňky k migraci z kostní dřeně do periferní cirkulace (26).

Proteoglykany (proteiny s vysokým obsahem sulfátů) jako např. heparansulfát, chondroitinsulfát jsou proteiny extracelulární matrix, které mohou přispívat k adhezi mezi kmenovými krvetvornými buňkami a stromatem (27–30). Proteoglykany mohou koncentrovat solubilní růstové faktory jako např. GM-CSF, který se váže k heparansulfátu v extracelulární dřeňové matrix (31, 32).

Niky krvetvorných kmenových buněk

Pojem nika kmenové krvetvorné buňky byl poprvé použit Schofieldem v roce 1978 (33), avšak teprve v nedávné době byla pokusy na zvířecích modelech prokázána podpůrná funkce stromálních nik pro hematopoetické kmenové buňky (34). Nika představuje funkční jednotku.

Ve dřeňové dutině existují minimálně 2 druhy nik kmenových krvetvorných buněk: osteoblastická a vaskulární nika. Malá populace kmenových krvetvorných buněk kostní dřeně lemovaná osteoblasty přiléhá k vrstvě endostu kosti. Část těchto osteoblastů („SNO“ buňky, spindle-shaped (vřetenovité), N-cadherin-pozitivní, CD45 negativní) spolupracuje s krvetvornými kmenovými buňkami a pravděpodobně řídí jejich aktivitu a osud. Osteoblasty tvoří krvetvorné růstové faktory, pro které jsou cílem právě kmenové krvetvorné buňky (35). Poslední výzkumy ukazují, že tzv. klidové hematopoetické kmenové buňky přiléhající k osteoblastické nice podstupují buněčné dělení, v němž jedna z dceřiných buněk slouží sebeobnově a zůstává nediferencovaná a druhá dceřiná buňka diferencuje v progenitorové buňky, které se posouvají směrem do centra dřeňové dutiny do oblasti blízké cévní zóně. Tyto progenitorové buňky se vzdalují od periferní endostální oblasti. Cévní zóna ve středu dřeňové dutiny se skládá z tenké sítě fenestrovaných sinusoidálních cév. Toto je v současné době považováno za oblast takzvané vaskulární niky (36). Současné znalosti podporují teorii, že osteoblastická nika udržuje nezralé kmenové krvetvorné buňky v klidovém stadiu a odpovídá za tvorbu progenitorových buněk, zatímco vaskulární nika slouží jako „úložiště“ diferencujících se progenitorových buněk předtím, než jsou uvolněny do periferní cirkulace. Další studie na zvířecích modelech ukazují, že hematopoetické kmenové buňky nemusejí být pouze v oblasti endostu kosti, jsou také nacházeny v blízkosti endoteliálních buněk v kostní dřeni a ve slezině (37). Endotelie krevních sinusoid podporují vyzrávání hematopoetických kmenových buněk a produkují signály nutné pro přežití a rozvoj dřeňových kmenových buněk sloužících k repopulaci (37, 38).

Mikroprostředí kostní dřeně u chronické lymfocytární leukemie

Chronická lymfocytární leukemie (CLL) je onemocnění charakterizované dynamickou rovnováhou mezi buňkami cirkulujícími v periferní krvi a buňkami umístěnými v permisivním mikroprostředí lymfatických orgánů (39). Cirkulující buňky CLL jsou malé zralé lymfocyty odolné proti apoptóze, zatímco buňky umístěné v nikách permisivního mikroprostředí zahrnují prolymfocyty a paraimunoblasty, které mohou proliferovat. Mikroprostředí hostitele ovlivňuje rovnováhu mezi odolností buněk k apoptóze a aktivní proliferací buněk vytvářením různých signálních drah (obr. 1).

Pro pochopení patogeneze CLL a následně její správnou léčbu je nutné znát molekulární mechanismy a interakce probíhající mezi buňkami CLL, krví, mikroprostředím kostní dřeně, lymfatických uzlin a sleziny. Níže jsou popsány a schematicky zachyceny některé solubilní a buněčně vázané signály regulující interakce mezi buňkami CLL a mikroprostředím (obr. 1).

Receptor CXCR4 je exprimován většinou cirkulujících buněk CLL, nezávisle na molekulárních znacích, klinickém stadiu či procentu infiltrace kostní dřeně. Stromální buňky kostní dřeně a podpůrné (nurse-like) buňky secernují chemokin CXCL12 neboli ligandu CXCR4 receptoru. Osa CXCL12/CXCR4 hraje klíčovou roli v přestupu neoplastických buněk do oblastí pro růst výhodného mikroprostředí (40). Nicméně odpověď vyvolaná vazbou ligandu na CXCR4 receptor se významně liší napříč pacienty s CLL a zdá se, že má vztah k přítomnosti ZAP70 a pozitivitě znaku CD38 (41). Další známou signální drahou je vazba CXCL13 ligandu produkovaného makrofágy kostní dřeně k receptoru CXCR 5 na povrchu CLL buněk (41). Exprese CXCR3 receptoru na povrchu CLL buněk je značně variabilní, ale dlouhodobě stabilní. Pacienti s CLL CXCR3+ mají většinou při stanovení diagnózy pokročilejší stadium choroby, častěji difuzní infiltraci kostní dřeně a tendenci k expresi molekulárních markerů spojených se špatnou prognózou. Buňky CLL jsou značně senzitivní k ligandům receptorů CCL19 a CCL21, jejichž vazba způsobuje zvýšenou transendoteliální migraci oproti normálním B-lymfocytům. CCL19 a CCL21 jsou exprimovány endoteliemi venul v lymfatických uzlinách a celý systém slouží k usnadnění přechodu buněk CLL z cirkulace do lymfatických orgánů (41, 42).

Buňky CLL mohou aktivně secernovat chemokiny, které lákají podpůrné buňky, čímž modifikují mikroprostředí a zlepšují podmínky pro růst buněk.

Mezi solubilní faktory, které řídí rovnováhu mezi stabilitou choroby a progresí, patří malé molekuly s proangiogením potenciálem. Zvýšená angiogeneze je trvale spojována s pokročilejší fází choroby a je známo, že samy buňky CLL mohou secernovat proangiogenní faktory [fibroblastový růstový faktor (FGF), vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF) a angiopoetin (Ang)] a řídit tak novotvorbu cév. Tyto nově vytvořené cévy jsou charakterizovány zvýšenou permeabilitou, čímž přispívají k diseminaci choroby. Buňky CLL mohou také exprimovat receptory pro některé proangiogenní faktory [zahrnující VEGF receptory (VEGFR) 1 a 2 a Tie 2, ligand pro Ang receptor]: převedené signály významně prodlužují buněčné přežití (43).

Buňky CLL ve slezině, lymfatických uzlinách či kostní dřeni nacházejí ideální mikroprostředí pro růst. Antigeny jsou zde přítomny spolu s příslušnou řadou přídatných signálů. Příkladem je CD40L, hojně exprimován T-lymfocyty uvnitř pseudofolikulů, přispívající k proliferaci CD40+ CLL buněk (44). Další signální drahou účastnící se migrace a proliferace CLL buněk je dráha CD31/CD38/ZAP70. Ukazuje se, že CD38 není jen prognostickým ukazatelem u CLL, ale adhezní molekulou a receptorem (s ligandem CD31) prodlužujícím přežití maligních lymfocytů. ZAP-70 je funkčně spojen se systémem DC38. ZAP70+/CD38+ lymfocyty mají zvýšenou tendenci k migraci do výhodného mikroprostředí po stimulaci CXCL12. Zdá se tedy, že v signální dráze CD31/CD38/ZAP70 se spojují proliferační a migrační signály. K aktivaci ZAP70 vedou také signály z B-buněčného receptoru (BCR) po stimulaci (auto)antigenem. Molekula CD49d se váže na VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) v proliferačních centrech, což vede ke zvýšení viability CLL buněk (45).

Mikroprostředí kostní dřeně, lymfatických uzlin a sleziny hraje zásadní roli v patogenezi CLL. Interakce leukemických buněk s T-lymfocyty, stromálními buňkami, endoteliemi a dendritickými buňkami pomocí přímých mezibuněčných kontaktů či solubilních signálních molekul usnadňují migraci CLL buněk do prostředí, v němž jsou chráněny proti apoptóze a zvýšeně proliferují. Angiogeneze se podílí na rozvoji a progresi onemocnění zajištěním dostatečného přísunu živin, ochranou proti apoptóze i dalšími mechanismy (46).

Mikroprostředí kostní dřeně u chronické myeloidní leukemie

Chronická myeloidní leukemie (CML) je onemocnění hematopoetické kmenové buňky charakterizované přítomností Filadelfského chromozomu.

Na Filadelfském chromozomu se nachází BCR-ABL onkogen. Chromozom vzniká reciprokou translokací chromozomu 9 a 22 (t(922)(q34q11)) (47,48), je typickou cytogenetickou abnormalitou CML a je identifikován u více než 90 % případů tohoto onemocnění. Expresí BCR-ABL onkogenu vzniká chimerický bcr-abl protein s deregulovanou tyrozin kinázovou aktivitou, který je nezbytný a dostačující pro patogenezi CML (49). Onkoprotein bcr-abl je rozšířen v cytoplazmě a interaguje s různými proteiny zahrnutými v procesu přenosu signálů, což vede k deregulaci proliferace, diferenciace a přežívání (50).

Tyrozin kinázové inhibitory (TKI) jsou velmi účinnými léčivými přípravky v terapii CML schopnými navodit hematologickou a cytogenetickou remisi onemocnění. Neúspěch TKI v eliminaci minimální zbytkové choroby (MRD) je přisuzován přítomnosti tzv. „kmenových buněk CML“ v kompartmentu kostní dřeně, které vedou k relapsu onemocnění (51). Kmenové buňky CML jsou rezistentní k TKI proto, že jsou převážně ve fázi klidového stavu v rámci buněčného cyklu a TKI potřebují k navození buněčné smrti aktivně probíhající buněčný cyklus (52). Tento mechanismus byl demonstrován in vitro studií, kdy u klidových imatinib mesylát (IM) rezistentních CML buněk byla navozena citlivost k IM indukcí buněčného cyklu (53). U kmenových CML buněk byla prokázána snížená hladina transportéru OCT-1 (organic cation transporter-1), který aktivně vychytává molekuly IM do intracelulárního prostředí, a naopak zvýšená hladina povrchových molekul odpovídajících za zvýšené vylučování léčiv z intracelulárního prostředí včetně transportérů MDR1 (mnohočetná léková resistence 1) (54, 55), což jsou další mechanismy zvyšující rezistenci CML kmenových buněk vůči TKI. V průběhu léčby TKI dochází i ke vzniku mutací v BCR-ABL onkogenu, které dávají vzniknout bcr-abl kinázám rezistentním k TKI. Tyto rezistentní bcr-abl kinázy jsou selektovány v CML kmenové buňce, což vede k následné rezistenci CML kmenových buněk k TKI. Ito a kol. prokázali zlepšení ve výsledcích léčby CML navozením buněčného cyklu u klidových nádorových buněk oxidativním stresem způsobeným užitím oxidu arzenitého (As₂O₃) (56). V této studii se počet klidových leukemických buněk signifikantně snížil a navíc do buněčného cyklu vstoupila většina kmenových buněk ve srovnání s normálními kmenovými buňkami podstupujícími léčbu oxidem arzenitým. Oxidativní stres nerozlišuje mezi normálními kmenovými hematopoetickými buňkami a kmenovými buňkami CML. Proto je do budoucna příslibem cílená léčba zahrnující konjugaci oxidativního stresu s protilátkami specificky rozpoznávajícími kmenové buňky CML. Kandidáty této cílené terapie by mohly být receptory interleukinu 3 (IL-3), které jsou vysokou měrou exprimovány na leukemických kmenových buňkách, zatímco na povrchu normálních hematopoetických kmenových buněk jsou detekovány velmi zřídka (57).

Paget ve své hypotéze „semínka a úrodné půdy“ navrhl koncept, že mikroprostředí rozvíjejícího se nádoru je zásadním regulátorem růstu tumoru (58). To platí i pro CML. U CML byly prokázány určité abnormality ve složení stromatu kostní dřeně, které má sníženou schopnost podporovat růst normálních progenitorů (59), zatímco růst CML progenitorů v kontaktu s tímto CML stromatem byl nepoškozený, což ukazuje, že abnormální interakce mezi buňkami CML a stromatem hrají zásadní úlohu v podpoře přežívání nádorových buněk a udržování minimální reziduální choroby. Leukemické buňky vytvářejí abnormální stromální niky vylučováním SCF (stromální buněčný faktor). Vysoké koncentrace SCF směřují normální hematopoetické kmenové buňky k uhnízdění do těchto abnormálních nik, což vede k narušení rovnováhy v udržování stabilní populace a sebeobnovy hematopoetických kmenových buněk (HSC) (60). Další typ niky je v kostní dřeni vytvořen díky stromálním buňkám (především mezenchymálním kmenovým buňkám), které vylučují chemokin CXCL12 (61). Cirkulující buňky CML včetně kmenových buněk CML exprimují molekulu CXCR4, která je receptorem pro ligandu CXCL12 (62, 63). Buňky CML využívají tento receptor pro usídlení v kostní dřeni, a takto obcházejí buněčnou smrt navozenou TKI. Důkaz o tom, že mezenchymální kmenové buňky v kostní dření chrání a zachovávají CML progenitory od buněčné smrti indukované IM cestou CXCR4-CXCL12 osy, podali Vianello a kol. (64). Přeměnou stromatu kostní dřeně kontrolují buňky CML populaci a osud normálních kmenových buněk.

Osa CXCR4-CXCL12 je hlavním migračním mechanismem buněk CML sloužící k uhnízdění v kostní dřeni. Užití antagonistů CXCR4 nabízí cestu jak mobilizovat CML buňky z kostní dřeně a tím je vystavit působení TKI. Jedním z těchto antagonistů je AMD3100, který obnovil citlivost progenitorových buněk CML k buněčné smrti navozené IM (65, 66). A navíc léčbou AMD3100 byla významně snížena masa CML progenitorů v kostní dřeni (65). Další studie zkoumající účinky kombinace TKI a inhibitorů osy CXCR4-CXCR12 ale musí být provedeny před zahájením užívání této kombinace v klinické praxi.

TKI jsou důkazem, že současná cílená molekulární terapie je účinná v navození kompletní hematologické a cytogenetické odpovědi u vysokého procenta pacientů, avšak existuje stále problém rezistence a intolerance k těmto preparátům (66). U většiny pacientů je možné i přes léčbu detekovat minimální zbytkovou chorobu v mikroprostředí kostní dřeně. Tato klinická pozorování svědčí o tom, že v mikroprostředí existují signální dráhy podporující přežití nádorových buněk. Experimenty ukazují, že působení solubilních faktorů kostní dřeně nebo extracelulární matrix může u nádorových buněk navodit vznik fenotypu mnohočetné lékové rezistence. Tato data vedou k úvahám, že zacílení léčby právě na tyto buněčné pochody by mohlo vést ke zvýšení účinku dosud používané chemoterapie.

Závěr

Porozumění roli mikroprostředí v patogenezi leukemií i dalších nádorových onemocnění by mohlo přispět k racionalizaci a individualizaci léčby a k pochopení výhod užívání kombinací určitých léčivých přípravků.

Poděkování

Autoři děkují panu Michalu Hodovskému za pomoc s přípravou obrázků.

Práce byla podpořena Českou leukemickou skupinou – pro život (CELL).

MUDr. Eva Létalová

Interní hematoonkologická klinika

LF MU a FN Brno

Jihlavská 20

625 00 Brno

Doručeno do redakce: 9. 6. 2011

Přijato po recenzi: 12. 9. 2011