MikroRNA v predikci odpovědi na radioterapii u pacientů s nádory hlavy a krku – pilotní studie

MicroRNAs in Prediction of Response to Radiotherapy in Head and Neck Cancer Patients – Pilot Study

Background:
Radiotherapy plays a key role in the treatment of squamous cell head and neck cancers (HNSCC). The effectivity of radiation therapy is often limited by radioresistance of these tumours. microRNAs (miRNAs) are endogenous, evolutionary conserved, small non-coding RNAs involved in regulation of cellular processes associated with radioresistance. The objective of this study was to identify miRNA profile enabling to predict the radiation treatment outcomes in HNSCC patients.

Material and Methods:
The retrospective study included HNSCC patients who underwent a definitive radiotherapy. Patients were divided into two groups according to loco-regional control (LRC) as follows – short LRC (n = 22; median 5.1 months (min. 1.3, max, 18.6)) vs. long LRC (n = 21; 60.4 (min. 46.8, max. 98.8)) group. Global miRNA expression profiles were obtained by use of Affymetrix microarray technology (GeneChip miRNA 4.0 Array).

Results:
We identified 24 miRNAs to be significantly associated with LRC (p < 0.05), all of these miRNAs were upregulated in patients with short LRC. Out of these miRNAs, 12 miRNAs with p < 0.025 and 4 miRNAs with p < 0.01 have been identified.

Conclusion:
miRNAs seems to be promising as potential biomarkers predicting radiotherapy treatment outcomes in patients with HNSCC.

Key words:
microRNAs – radiotherapy – head and neck cancer

The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.

The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE recommendation for biomedical papers.

Supported by Ministry of Health of the Czech Republic, grant No. 15-31627A. All rights reserved.

Submitted:
19. 3. 2018

Accepted:
20. 3. 2018

Autoři: P. Ahmad ¹; M. Slavik ²; J. Šána ¹; M. Hermanová ³; P. Šlampa ²; P. Smilek ⁴; T. Kazda ^1,2; O. Slabý ¹
Působiště autorů: CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno ¹; Klinika radiační onkologie LF MU a Masarykův onkologický ústav, Brno ²; I. patologicko-anatomický ústav, LF MU a FN u sv. Anny v Brně ³; Klinika otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku LF MU a FN u sv. Anny v Brně ⁴
Vyšlo v časopise: Klin Onkol 2018; 31(Supplementum1): 137-139
Kategorie: Článek ve sborníku

Souhrn

Východiska:
V léčbě ORL malignit hraje významnou roli radioterapie. Její účinek je často limitován radiorezistencí některých nádorů. Důležitou roli v procesech souvisejících s radiorezistencí hrají mikroRNA (miRNA), jejichž hlavní funkcí je posttranskripční regulace genové exprese. Cílem této práce je stanovit profil miRNA umožňující predikovat odpověď na léčbu ionizujícím zářením u pacientů s nádory hlavy a krku.

Materiál a metody:
Do retrospektivní analýzy byli zařazeni pacienti se spinocelulárními karcinomy ORL oblasti léčení definitivní radioterapií (někteří v konkomitanci se systémovou léčbou). Pacienti byli rozděleni do dvou skupin dle délky trvání léčebné odpovědi – krátká (n = 22; medián 5,1 měsíce (min. 1,3; max. 18,6)) vs. dlouhá (n = 21; 60,4 měsíce (min. 46,8; max. 98,8)) doba do lokální recidivy/progrese onemocnění. Globální profilování exprese miRNA bylo provedeno pomocí čipové technologie společnosti Affymetrix (GeneChip miRNA 4.0 Array).

Výsledky:
Analýza globálních expresních profilů odhalila 24 miRNA, které byly asociovány s časem do lokální recidivy/progrese onemocnění (loco-regional control – LRC), všechny miRNA byly up-regulované u pacientů s krátkou LRC (p < 0,05), 12 miRNA bylo rozdílných mezi skupinami na hladině významnosti p < 0,025 a 4 miRNA na hladině p < 0,01.

Závěr:
Tkáňové miRNA se jeví jako možné biomarkery v predikci léčebné odpovědi na léčbu ionizujícím zářením u nádorů oblasti hlavy a krku.

Klíčová slova:
mikroRNA – radioterapie – nádory hlavy a krku

Východiska

Nádory ORL oblasti jsou heterogenní skupinou onemocnění zahrnující nádory horního aerodigestivního traktu a slinných žláz. V Evropě na ně umírá ročně přibližně 63 500 pacientů [1]. V ČR byly v roce 2012 6. nejčastějším nádorem u mužů a 17. u žen [2]. Dle studie Eurocare-5 se relativní 5leté celkové přežití (overall survival – OS) pro tyto nádory v Evropě pohybuje v závislosti od místa postižení v rozmezí od 25 (hypofarynx) do 59 % (larynx) [1]. OS ve srovnání s dřívějšími daty postupně narůstá zejména u orofaryngeálních karcinomů vlivem HPV etiologie části těchto nádorů, u jiných lokalit je však nárůst i přes pokroky v léčbě jen velmi pozvolný anebo má charakter plateau [1]. V terapii těchto malignit je kromě chirurgie základní léčebnou metodou i léčba ionizujícím zářením.

Biologické chování nádorů ORL oblasti ovšem není na individuální úrovni charakterizováno a některé z nich se vyznačují velkou rezistencí vůči této léčbě. V souvislosti s radiorezistencí bylo studováno mnoho molekul s cílem najít relevantní prediktivní a prognostické faktory [3]. Dosavadní výsledky jsou rozporuplné a molekulární prediktory u nádorů ORL oblasti, kromě markerů asociovaných s HPV infekcí, nejsou rutinně stanovovány. Na vzniku radiorezistence se podílí celý komplex DNA reparačních procesů a molekul na úrovni nádorové buňky, a tak nádorového mikroprostředí. Recentní výzkumy ukazují, že mezi molekuly, které hrají důležitou roli v odpovědi na ionizující záření, patří také mikroRNA (miRNA) [4]. miRNA jsou krátké, jednořetězcové RNA (21–23 nukleotidů), jejichž hlavní funkcí je posttranskripční regulace genové exprese cestou potlačení translace cílové mRNA nebo iniciací její degradace [4]. miRNA se podílejí na všech důležitých procesech souvisejících s radiorezistencí, jako je reparace poškozené DNA, apoptóza, proliferace a angiogeneze. miRNA jsou navíc deregulovány u různých typů nádorů, ORL malignity nevyjímaje [4].

Cílem této práce bylo stanovit globální profily miRNA ve vzorcích nádorové tkáně pacientů s dlaždicovým karcinomem hlavy a krku (squamous cell head and neck cancers – HNSCC) a identifikovat miRNA umožňující dostatečně predikovat odpověď na léčbu ionizujícím zářením ve smyslu lokální kontroly onemocnění.

Soubor pacientů, materiál a metody

Do retrospektivní analýzy byli zařazeni pacienti s histologicky potvrzenými spinocelulárními karcinomy dutiny ústní (DU), orofaryngu (OF), hypofaryngu (HF) a laryngu (L) léčeni v naší instituci v období od 1. 1. 2007 do 31. 12. 2012. Podmínkou k zařazení do studie byla adekvátní lékařská dokumentace, podepsaný informovaný souhlas s léčbou a s využitím biologických vzorků. Studie byla zároveň schválená lokální etickou komisí. Stadium onemocnění bylo určeno dle 7. verze TNM klasifikace (AJCC – version 2007). Všichni pacienti byli léčeni primární kurativní radioterapií s modulovanou intenzitou svazku (intensity modulated radiation therapy – IMRT). Předepsaná dávka na tumor a postižené uzliny byla 70 Gy, na rizikové uzlinové oblasti 60, resp. 50 Gy nebo do biologických ekvivalentů těchto dávek. Konkomitantní podání chemoterapie na bázi platinového derivátu nebo cetuximabu bylo umožněno, ale nebylo podmínkou. V rámci poléčebného sledování bylo provedeno kontrolní CT nebo PET/CT v období 2–3 měsíce po ukončení IMRT a dále dle klinického stavu. Pravidelné ORL vyšetření probíhalo v intervalech 1–2 měsíce v prvním roce a min. 3–4 měsíce v dalším období.

U všech pacientů byla z iniciálních biopsií (ve formalinu fixovaných a archivovaných v parafinu (formalin-fixed paraffin-embedded – FFPE) vzorků) stanovena exprese p16, cut-off hodnota odpovídala difuzní nebo silné nukleární a cytoplazmatické pozitivitě v nejméně 70 % nádorových buněk. Exprese miRNA byla analyzována pomocí hybridizační technologie GeneChip^® miRNA 4.0 Array (Affymetrix). Všechna data byla předem zpracována a dále analyzována pomocí sady programů obsažených v bioinformatickém balíku R/Bioconductor^® a log2 transformována. Lokální kontrola onemocnění (loco-regional control – LRC) byla definována jako perioda od ukončení léčby do progrese/recidivy onemocnění v ozařované oblasti.

Výsledky

Do studie bylo zařazeno celkem 50 pacientů, u kterých byla pomocí hybridizační technologie analyzována exprese miRNA z FFPE tkáňových vzorků tumoru odebraných před zahájením léčby. Na základě následné kontroly kvality výstupních expresních dat bylo z finální statistické analýzy vyloučeno 7 pacientů. Zbylých 43 pacientů bylo dle času do lokální recidivy rozděleno do dvou skupin – krátká (n = 22; medián 5,1 měsíce (min. 1,3, max. 18,6)) vs. dlouhá (n = 21; 60,4 měsíce (min. 46,8, max. 98,8)) doba do lokální recidivy. Charakteristika skupin pacientů – 18 (82 %) mužů, 4 (18 %) ženy vs. 19 (90 %) mužů, 2 (10 %) ženy; věk v době diagnózy – medián 57,5 (42,9–70) vs. 58,3 (40,1–70,8) roku; postižené lokality – DU 3 (14 %), HF 3 (14 %), L 4 (18 %), OF 12 (54 %) vs. DU 3 (14 %), HF 3 (14 %), L 4 (19 %), OF 11 (53 %); stadium – IV 19 (86 %), III 3 (14 %) vs. IV 13 (62 %), III 7 (33 %), II 1 (5 %); p16 pozitivita – 6 (27 %) vs. 8 (38 %). Expresní analýza celkem 2 578 miRNA odhalila 24 miRNA rozdílně exprimovaných mezi oběma skupinami pacientů. Současně bylo 24 miRNA asociováno s časem do lokální recidivy (LRC), všechny up-regulované (p < 0,05) (tab. 1). Mezi nimi bylo identifikováno 12 miRNA s p < 0,025 a 4 miRNAs s p < 0,01.

**Tab. 1. Seznam mikroRNA (miRNA) rozdílně exprimovaných v tumorech pacientů s krátkou a dlouhou dobou do lokální recidivy.**

Diskuze

V naší pilotní studii jsme identifikovali 24 miRNA asociovaných s časem do progrese/LRC onemocnění. Tyto miRNA představují nadějné kandidáty vhodné k další nezávislé validaci. Zajímavým zjištěním bylo, že podíl p16 pozitivních pacientů v obou skupinách byl velmi podobný nejenom počtem, ale i napříč postiženými lokalitami (u obou skupin dva p16 pozitivní pacienti mimo orofarynx). Hlavní limitací naší pilotní studie je především nedostatečná velikost souboru pacientů a absence validační kohorty. Kromě velikosti vzorku vyplývají další omezení ze samotného retrospektivního charakteru studie. Na druhou stranu se jedná zatím o jedinou práci s designem zaměřeným na identifikaci miRNA spojených s LRC po kurativní radioterapii. Recentní podobná práce stanovila model pěti miRNA (miR-27b, -130b, -200b, -451 a -532-5p) signifikantně spjatých s OS po léčbě radioterapií s cisplatinou ve skupině 157 pacientů [5]. Další nezávislá studie posuzovala expresi miRNA a léčebnou odpověď po kombinaci chirurgie a adjuvantní radioterapie [6], jiná práce potom expresi miRNA u sinonazálních karcinomů po různých typech léčby [7]. Všechny studie identifikovaly rozdílné miRNA spojené s OS, ale ne v souvislosti s lokální kontrolou onemocnění po radioterapii. Řada publikovaných studií je založena na studiu mechanizmů radiorezistence na buněčných modelech [4]. V případě radioterapie nádorů ORL oblasti je zatím jen málo prediktivních markerů, podle kterých by se dala tato léčebná modalita s nezanedbatelnými vedlejšími účinky více přizpůsobit konkrétním pacientům. miRNA se jeví jako molekuly s potenciálem lepšího cílení léčby a v budoucnu snad i prolomení radiorezistence. Jejich význam si žádá ověření na větších klinických studiích.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Tato studie byla vypracována s grantovou podporou Ministerstva zdravotnictví České republiky, grant č. 15-31627A. Všechna práva vyhrazena.

MUDr. Marek Slávik

Klinika radiační onkologie LF MU a Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7 656 65 Brno

e-mail: slavik@mou.cz

Obdrženo: 19. 3. 2018

Přijato: 20. 3. 2018

Zdroje

1. Gatta G, Botta L, Sánchez MJ et al. Prognoses and improvement for head and neck cancers diagnosed in Europe in early 2000s: The EUROCARE-5 population-based study. Eur J Cancer 2015; 51 (15): 2130–2143. doi: 10.1016/j.ejca.2015.07.043.

2. Dušek L, Mužík J, Uher M et al. Epidemiologie nádorů hlavy a krku. In: Šlampa P, Smilek P (eds). Nádory hlavy a krku. Praha: Mladá fronta 2016: 17–27.

3. Begg AC. Predicting recurrence after radiotherapy in head and neck cancer. Semin Radiat Oncol 2012; 22 (2): 108–118. doi: 10.1016/j.semradonc.2011.12.002.

4. Ahmad P, Sana J, Slavik M et al. microRNAs involvement in radioresistance of head and neck cancer. Dis Markers 2017; 2017: 8245345. doi: 10.1155/2017/8245 345.

5. Hess AK, Müer A, Mairinger FD et al. MiR-200b and miR-155 as predictive biomarkers for the efficacy of chemoradiation in locally advanced head and neck squamous cell carcinoma. Eur J Cancer 2017; 77: 3–12. doi: 10.1016/j.ejca.2017.02.018.

6. Chen L, Wen Y, Zhang J et al. Prediction of radiotherapy response with a 5-microRNA signature-based nomogram in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Med 2018; 7 (3): 726–735. doi: 10.1002/cam4.1369.

7. Kovarikova H, Bubancova I, Laco J et al. Deregulation of selected microRNAs in sinonasal carcinoma: Value of miR-21 as prognostic biomarker in sinonasal squamous cell carcinoma. Head Neck 2017; 39 (12): 2528–2536. doi: 10.1002/hed.24930.