Kvantitativní stanovení hemoglobinu ve stolici -
preanalytické a analytické aspekty

Souhrn

Preanalytické a analytické aspekty kvantitativní metody stanovení hemoglobinu ve stolici mají podstatný význam na vyhodnocení testu, jehož pozitivita je indikací ke kolonoskopii při screeningu kolorektálních nádorů. Požadavky na kvalitu laboratorní analýzy vyžadují podle normy ČSN EN ISO 15189, aby byla hodnocena variabilita ve všech fázích procesu zkoušky. Preanalytickým aspektem je odběr a transport vzorku zahrnující odběrovou kazetu (množství stolice, objem a složení extrakčního pufru), konzistenci stolice, stabilitu vzorku (doba a teplota transportu). Analytickým aspektem je především variabilita imunochemické technologie, rozdílné protilátky, pufry, standardy a kalibrace analyzátorů. Harmonizace a standardizace stanovení hemoglobinu ve vzorcích stolice je tématem pracovní skupiny IFCC - WG-FIT (Working Group for Fecal Immunochemical Testing).

Klíčová slova:

kolorektální karcinom – screening – stanovení okultního krvácení – imunochemická detekce hemoglobinu ve stolici – analytická a preanalytická variabilita

Úvod

Kolorektální karcinom (KRCA) je třetí nejčastější příčinou úmrtí na rakovinu na celém světě a předpokládá se, že počet případů vzroste z 1,850 milionů nyní na 3,093 milionu v roce 2040 [1]. KRCA je jedním z nejvíce preventabilních karcinomů, a screeningové programy vedou k významnému snížení úmrtnosti na KRCA. Optimalizací screeningu se zabývá většina zemí a zahrnuje řadu důležitých aspektů, jako je místní infrastruktura zdravotní péče, dostupnost lékařských zdrojů, incidence KRCA a kvalita screeningových procesů. V České republice se screening KRCA provádí buď v jednom nebo ve dvou krocích. Dvoustupňové programy vyžadují před kolonoskopií pozitivní test na okultní krvácení ve stolici - FIT (Fecal Immunochemical Test). Kvantitativní imunochemická detekce hemoglobinu ve stolici ve většině zemí již nahradila dříve používaný guajakový test (g-FOBT). Úhrada ze zdravotního pojištění vyžaduje od ledna 2020 provedení FIT pouze kvantitativní analýzou hemoglobinu ve stolici provedené na přístroji v režimu POCT nebo laboratorním analyzátorem s limitem detekce 15 μg/g stolice a požadavkem je zapojení do systému externí kontroly kvality [2].

Kvantitativní imunochemická detekce hemoglobinu ve stolici nabízí mnohem širší využití při screeningu, a to nejen u asymptomatických jedinců s průměrným rizikem, ale FIT lze použít v primární péči a může se stát nedílnou součástí hodnocení všech pacientů s gastroenterologickou symptomatologií v primární péči [3, 4]. Významné jsou nejen pozitivní hodnoty, nad definovanou cut-off indikující kolonoskopii, ale rovněž hodnoty nižší - negativní. Po osmi letech sledování měli účastníci s výchozími koncentracemi hemoglobinu 8-10 µg/g vyšší kumulativní výskyt pokročilých neoplázií (33 %) než účastníci s nulovou hodnotou hemoglobinu – 5 % (p < 0,001) a účastníci se dvěma po sobě následujícími koncentracemi 8-10 µg/g měli 14násobné zvýšení rizika pokročilé neoplázie ve srovnání s účastníky se dvěma po sobě jdoucími nulovými koncentracemi hemoglobinu ve stolici (p < 0,001) [5]. Kumulativní součet dvou po sobě následujících negativních FIT s výsledkem nad 20 μg/g stolice výrazně zvyšuje záchyt pokročilých neoplázií [6]. Inteligentní vyhodnocování FIT indikující kolonoskopii a především nízkých hodnot FIT předpokládá velmi přesnou analýzu a vyžaduje, aby lékaři získali mnohem hlubší znalosti o preanalytických a analytických podmínkách pro stanovení Hb ve stolici (obr. 1). Podstatným aspektem jsou znalosti konkrétního analyzátoru, jeho limity detekce (LoD), limity kvantifikace (LoQ) [7] a zajištění externí kontroly kvality [8].

Významným preanalytickým vlivem je odběr a transport vzorku stolice, analytická variabilita je dána technologií imunoanalytického stanovení (rozdílné protilátky, pufry, kalibrace systému). Problematika variability stanovení markerů ve stolici z pohledu preanalytiky a imunochemické analytiky je řešena velmi detailně nejen pro hemoglobin [9], ale také pro stanovení kalprotektinu [10]. Harmonizace a standardizace stanovení hemoglobinu ve vzorcích stolice je tématem pracovní skupiny IFCC - WG-FIT (Working Group for Fecal Immunochemical Testing) [11].

Fig 1: Overview of pre-analytical, analytical and post-analytical variables associated with the quantitative determination of haemoglobin in stool.

Vyjadřování koncentrace Hb ve stolici

Prvním krokem ve standardizaci FIT byla změna jednotek pro vyjádření výsledku z ng/mL - odpovídající koncentraci ve vzorkovacím pufru na μg/g stolice, což eliminuje variabilitu vzorkovacích kazet [12]. Odběrové kazety pro jednotlivé laboratorní analyzátory se liší v objemu extrakčního pufru a množství odebírané stolice více než 10x  (Tabulka 1). Expertní skupina WEO (World Endoscopy Organization) pro screening KRCA navrhla v roce 2012 [13] jednoduchou strategii pro vyjadřování koncentrace Hb ve stolici přepočítáním hodnoty na koncentraci v μg/g stolice, které umožní srovnávat FIT testy provedené s rozdílnou odběrovou kazetou, a která je dnes již většinově akceptována.

Diskutována je pouze otázka, zda by pomocí převodu na objem stolice, nikoli na její hmotnost, nebyly získány ještě přesnější výsledky [9]. Studie prokazuje rozdíl mezi výrobci deklarovanou hodnotou a metrologicky ověřenou hmotností odebrané stolice v rozsahu od 56 %do 121 %. Nicméně relativní hustota stolice je obvykle blízká 1,00, takže doporučený převod na koncentraci Hb v µg/g stolice umožňuje racionální hodnocení FIT.

Česká společnost klinické biochemie (ČSKB) v roce 2015 doporučila z hlediska kvality a vyhodnocování péče o pacienty a epidemiologické srovnatelnosti výsledků, prováděných v České republice jednotný postup - stanovení okultního krvácení ve stolici provádět výhradně kvantitativními FIT testy a výsledky vyjadřovat koncentrací Hb ve stolici, v jednotkách μg/g stolice [14, 15].

Odběr stolice a transport vzorku

Odběr vzorku stolice a jeho transport do laboratoře zahrnuje výrazné riziko preanalytické chyby. Návody - pokyny na provedení odběru vzorku stolice se značně liší mezi devíti testovanými výrobci odběrových zkumavek a zahrnují tři klíčové komponenty:

a) počet vložení odběrové tyčinky do vzorku stolice

b) vizuální kontrola zářezů odběrové tyčinky pro úplné naplnění stolicí

c) jednorázové zasunutí odběrové tyčinky naplněné stolicí do zkumavky. Porušení pokynů k odběru vzorků stolice může vést k nezanedbatelnému ovlivnění následujícího měření koncentrace hemoglobinu ve stolici. Nedodržením podmínek a) a b) dochází k variabilnímu snížení výsledné hodnoty, efekt na diagnostický přínos je relativně nízký. Nedodržení podmínky c) - přeplnění odběrové zkumavky vede k podstatnému nadhodnocení naměřené koncentrace hemoglobinu [16, 17]. Variabilita pokynů k odběru vzorku stolice uváděná v našich, českých laboratořích, často překladem z anglických originálů, je uvedena v Příloze 1. Váha odebraného vzorku a způsob odběru byly testovány na čtyřech nejpoužívanějších analyzátorech - HM-JACKarc/Kyowa, OC-sensor DIANA/Eiken, SENTiFIT 270/Sentinel a NS-Prime/Alfresa a výsledná hodnota koncentrace hemoglobinu nebyla signifikantně ovlivněna váhou odebraného vzorku stolice, protože odběrové zkumavky uvedených analyzátorů mají integrované septum zachycující nadbytečnou stolici [18].

Preanalytickým aspektem, který může ovlivnit výsledek FIT, mohou být varianty lidského hemoglobinu. Imunochemické testy pro FIT používají k detekci krve ve vzorcích stolice polyklonální protilátky vytvořené na globinovou část lidského hemoglobinu. Lidský dospělý Hb je tvořen čtyřmi globinovými řetězci, dvěma alfa-řetězci a dvěma beta-řetězci. Tato struktura může být ovlivněna řadou poruch charakterizovaných syntézou abnormálního globinového řetězce (varianty Hb), sníženou syntézou jednoho nebo více globinových řetězců (thalasemie) nebo jejich kombinací. Je důležité si uvědomit, že existuje více než 1700 různých identifikovaných variant Hb [19], a uvedená studie zkoumala pouze 20 nejčastěji se vyskytujících variant Hb v současné populaci (HbF, HbC, HbD, HbE, HbS, varianty při β-talasémii major, srpkovité anémii). FIT byl vyhodnocen na čtyřech analyzátorech - HM-JACKarc/Kyowa, OC-sensor Pledia/Eiken, SENTiFIT 270/Sentinel a NS-Prime/Alfresa. Tři varianty hemoglobinu (Hb při β-talasémii major a dva vzorky fetální pupečníkové krve) vykazovaly pouze 50% hodnotu FIT ve srovnání s očekávanou pro všechny čtyři testované analyzátory [20].

Molekula hemoglobinu je sférického tvaru a skládá se ze čtyř podjednotek. Každá podjednotka je tvořena bílkovinnou částí – globinem a prostetickou (nebílkovinnou) částí – hemem - tvořené tetrapyrolovým kruhem (protoporfyrin IX) s centrálním atomem železa. Stanovení okultního krvácení ve stolici založená na gujakové pryskyřici detekovalo hem, který je výrazně termostabilnější než bílkovinný globin. Detekci krvácení v horní části zažívacího traktu nelze metodou FIT, na rozdíl od guajakového FOBT, prokazovat. Degradací hemoglobinu během střevní pasáže může docházet k falešné FIT negativitě u proximálních lézí a navrženým řešením je kombinovaná detekce hemoglobinu s termostabilnějším transferinem. Pozitivita kombinovaného testu 10,1 %,oproti 6,7 % pro hemoglobin byla vyšší především u žen s konstipací [21]. Preanalytickým faktorem je proto kombinace teploty a času transportu vzorku stolice. Stabilitu hemoglobinu v extrakčním pufru výrobci odběrových kazet stále zvyšují [22,23], a při transportu do laboratoře (průměrná doba do analýzy je 6 dní) klesá senzitivita FIT pro detekci pokročilých neoplazií (cut-off 15 µg/g) z hodnoty 50,8 % při teplotě < 10 °C na 42,4 %při 10 až 19 °C a 40,0 % při 20 až 24 °C [24]. Nejvyšší stabilita testovaná pro kvantitativní analyzátory NS Plus -  OC Diana byla v rozmezí 32 až 60 dnů (pokles koncentrace Hb do 20 % výchozí hodnoty) při teplotě 2 až8 °C, zmražení a rozmražení stabilitu snížilo, při uchování v pokojové teplotě 20 až 22 °C je stabilita pouze 3 až 7 dnů a při zvýšené teplotě 45 °C je stabilita téměř nulová 0 až 1 den [25]. Vzorky stolice uchovávané v laboratoři při teplotě 5 °C, 20 °C a nebo 35 °C po dobu 1 až 7 dnů byly analyzovány 10 kvantitativními analyzátory laboratorními i POCT. Signifikantní pokles koncentrace Hb a pozitivity testu byl prokázán pro několik analyzátorů již během čtyř dnů [26]. Inverzní sinusoidu mezi průměrnou denní teplotou a pozitivitou FIT demonstruje sedmiletá studie na souboru 510 922 nemocných s 1 429 089 FIT vzorky, které byly analyzovány do tří dnů na systému OC-Diana. Průměrná denní teplota je v rozmezí 0 až 32 °C a senzitivita FIT je 2,6 % až 8,0 % (medián 4,4 %). Inverzní sinusoidu vykazuje nejnižší FIT senzitivitu během letních měsíců při nejvyšších denních teplotách [27].

Variabilita imunochemických analyzátorů

Kvantitativní analýza hemoglobinu ve stolici je řešena pomocí laboratorních i POCT analyzátorů. Variabilita zahrnuje různé analytické technologie, použité protilátky, pufry a kalibrátory. Analytickou evaluaci čtyř analyzátorů pro kvantitativní stanovení Hb ve stolici (HM-JACKarc, NS-Prime, OC-sensor PLEDIA a SENTiFIT 270) zahrnující např. limity detekce (LoD), limity kvantifikace (LoQ), linearitu, efekt hook/prozone popisuje studie z NHS Bowel Cancer Screening Programme Southern Hub v Guildfordu – England [28]. Výsledná hodnota FIT analýzy je kritériem indikujícím kolonoskopii při screeningu KRCA. Rozdílná pozitivita FIT ve vztahu k technologii analytického procesu je podrobně popsána v německé studii [29] porovnávající devět různých kvantitativních metod pro stanovení hemoglobinu ve stolici. Autoři porovnali tři varianty pro stanovení cut-off kritéria. Pozitivita testu je 6,8 %; 6,2 %; 12,3 %; 6,8 %; a 5,7 % pokud je nastavena mezní hodnota cut-off podle doporučení výrobce - OC-sensor 10 µg/g, SENTiFIT FOB Gold 17 µg/g, CAREprime Hb 6,3 µg/g, QuikRead Go iFOBT 15 µg/g a test Eurolyser FOB 8,04 µg/g. Při shodně nastaveném cut-off na 15 µg/g, tj. hodnota doporučená nyní pro screening v České republice, bude pozitivita pro tyto analyzátory 3,4 %; 6,6 %; 5,6 %;5,9 % a 4,0 %. Optimálním řešením je nastavit cut-off tak, aby byla zjištěna shodná specificita testu 96,7 %, pozitivita je téměř identická v rozmezí 5,9 % - 6,1 %. Odpovídají cut-off pro uvedené analyzátory - OC-sensor 6,6 µg/g, SENTiFIT-FOB Gold 17,68 µg/g, CAREprime Hb 12,35 µg/g, QuikRead Go iFOBT 15 µg/g a Eurolyser FOB test 6,11 µg/g.

Vzhledem k uvedené variabilitě nelze mezní kritéria stanovená metodou jednoho výrobce použít na výsledky získané metodou jiného výrobce. Kritérium cut-off 15 µg/g stolice bylo v Nizozemsku zvoleno na základě mnoha studií provedených s analyzátorem OC-sensor a očekávaná pozitivita měla být 6,3 %. Screening KRCA se však provádí testem FOB Gold, který byl vybrán pro populační screening v Nizozemsku na základě výběrového řízení, skutečná pozitivita po jednom roce (12,2 %) významně zvýšila potřebu kolonoskopií a vedla k nezbytnému zvýšení cut-off hodnoty na 47 μg/g z hodnoty 15 µg/g, při současném snížení citlivosti metody a pozitivity testu na očekávaných 6,3 % [30]. Na zasedání výboru pro screening WEO CRC v Barceloně porovnávala Lansdorp-Vogelaar variantu nejúčinnějšího screeningu (FIT ročně, 45 -  80 let, 10 µg/g) s aktuálně prováděným screeningem (FIT jednou za 2 roky, 55 - 75 let, 47 µg/g), odpovídající jedné třetině účinku ve srovnání s nejúčinnějším screeningem [31]. Výrobce testu FOB Gold nyní nabízí kalibrátory ve variantách “low” a “high”, a novější holandská studie prokazuje s novým kalibrátorem výsledky srovnatelné s OC-sensorem [32]. Ulrike Haug na zasedání výboru pro screening WEO CRC v Barceloně 2019 představila analýzu 2,8 milionu FIT provedených v Německu v roce 2018 pomocí technologií od 12 různých výrobců. Pro screening nebyl definován žádný cut-off, ale pro jednotlivé analyzátory byl stanoven požadavek 25% citlivosti k detekci pokročilé neoplazie a > 90% specificita testu FIT [33]. Cut-off a pozitivita pro jednotlivé laboratorní i POCT analyzátory byly pro OC-sensor (10 µg/g; 10,2 %), SENTiFIT-FOB Gold (17 µg/g; 7,9 %), CAREprime Hb (6 µg/g; 5,1 %), QuikRead Go (15 µg/g; 13,8 %), CerTest BIOTEC (8 μg/g; 21,1 %) a Eurolyser FOB (4 µg/g; 20,3 %).

Zcela shodné závěry lze vyvodit na základě výsledků kontroly EQA provedené u 175 účastníků pro analýzu FIT v České republice akreditovaným pracovištěm SEKK v dubnu 2020 [34]. Průměrná hodnota zkušebního vzorku Hb v µg/g, CV a počet účastníků pro nejčastěji používané analyzátory jsou následující: OC-sensor (93 µg/g; 34; 7,2 %), SENTiFIT-FOB Gold (162 µg/g; 46; 10,0 %) a QuikRead Go (138 ug/g; 61; 24,0 %). Ve srovnání s analýzou OC-sensorem jsou hodnoty QuikRead Go 1,48krát vyšší, hodnoty FOB Gold 1,74krát vyšší, což zcela odpovídá německému doporučení pro OC-sensor 10 µg/g; FOB Gold 17 µg/g a QuikRead Go 15 µg/g.

Externí kontrola kvality

Požadovaná preciznost a přesnost měření koncentrace hemoglobinu ve stolici je zcela provázána s kontrolou kvality. Evropské směrnice pro zajištění kvality při screeningu karcinomu tlustého střeva proto doporučují pouze testy kvantitativní, kde lze kontrolu kvality spolehlivě zajistit. [35 - 38]. Spolehlivost kvantitativní analýzy zajišťuje v České republice systém externí kontroly kvality podle standardů definovaných v ISO 15189 provozovaný společností SEKK, která je řádným členem European Committee for External Quality Assurance Programmes in Laboratory Medicine (EQALM), a rozvíjí spolupráci s významnými zahraničními poskytovateli EQA. Testovací vzorky od deseti poskytovatelů EQAS byly analyzovány na čtyřech kvantitativních analyzátorech pro FIT - HM-JACKarc/Kyowa, OC-sensor Pledia/Eiken, SENTiFIT 270/Sentinel a NS-Prime/Alfresa [8]. Externí kontrola kvality může zahrnovat pre-analytickou i analytickou složku FIT. Pro EQAS prováděné v Anglii, Kanadě a Japonsku jsou uživatelům zasílány vzorky Hb v matrici odpovídající stolici buď jako vzorek stolice, nebo již výrobcem naplněné do odběrové zkumavky. EQAS v Německu, Itálii, Španělsku a SEKK v České republice zasílají vzorky Hb v tekuté, nebo lyofilizované formě. Variační koeficient (CV) byl vypočítán pro každý FIT analyzátor a hodnoty CV byly podstatně vyšší pro vzorky s matricí stolice (12,4-19,0 %) ve srovnání se vzorky Hb zasílané v tekuté formě (0,8-2,3 %).

Byly provedeny různé pokusy o vytvoření materiálů EQA vhodných pro hodnocení předanalytické fáze FIT. Lidská stolice se příliš liší texturou a obsahem vody a Hb je nestabilní proti teplu, proteinázám a peptidázám ve stolici a přežívajícím bakteriím. Řešení by mohlo být vytvoření umělé-arteficiální stolice jako matrix EQA pro FIT [39, 40]. Umělá stolice z centra HECTEF (HealthCare Technology Foundation, Tokyo) je založena na rýžové mouce a obsahuje lidský hemoglobin A0 (HbA0) a glycerol jako vnitřní standard. Stabilita Hb s poklesem < 2 % byla prokázána při uchování v teplotě při -80 °Cpo dobu čtyř měsíců, -20 °C po dobu dvou týdnů a 5 °C po dobu dvou dnů [39].

Post-analytická interpretace FIT

Inteligentní interpretace FIT testů [41] a personalizace screeningu kolorektálního karcinomu [42] není tématem tohoto přehledu. Koncentraci Hb ve stolici je nutno vyhodnocovat ve vztahu k věku, pohlaví a individuálnímu posouzení rizika vzniku KRCA na základě rodinné anamnézy, životního stylu, environmentálních a genetických faktorů. Perspektivou screeningu KRCA je personalizovaný, populační screening zahrnující inteligentní vyhodnocování FIT. Jediným aspektem, který lze řešit z pohledu laboratorní analytiky je variabilita FIT ve vztahu k věku a pohlaví. Tento aspekt je řešen pro mnoho analytů, kdy referenční meze jsou odlišné pro muže a ženy, nebo podle věku osob. Kritériem pro indikaci kolonoskopie je pozitivita FIT ve vztahu k definované cut-off koncentraci Hb.

V souboru 17 387 kolonoskopovaných osob byla pozitivita na FIT s cut-off 20 μg/g (OC-sensor Micro, Eiken) 8,3 % u mužů a 4,8 % u žen (p < 0,0001). Detekce záchytu pokročilých neoplázií (ANDR - Advanced Neoplasia Deetection Rate) byla 44,0 ‰ u mužů a 15,9 ‰ u žen (p < 0,0001) [43]. Při cut-off doporučené výrobcem (17 μg/g stolice - FOB Gold, Sentinel) byla citlivost pro detekci pokročilých neoplázií ve věku 65 - 79 let vyšší oproti věku 50 - 64 let (51,2 % oproti 34,7 %, p = 0,004) a specificita byla nižší (91,0 % oproti 94,8 %, p < 0,001) [44]. Studie provedená v Kaiser Permanente (USA) na souboru 640 859 osob [45] deklaruje doporučené cut-off při zvolené pozitivitě 8 % následovně: muži 20 µg/g, ženy 15 µg/g, ve vztahu k věku 50–59 let 15 µg/g, 60–69 let 20 µg/g, 70–75 let 25 µg/g.

Autor prohlašuje, že není ve střetu zájmů.

Do redakce došlo 9. 12. 2020

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Petr Kocna, CSc.

Laboratoř gastroenterologie

Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky, 1. LF UK a VFN Praha

Na Bojišti 3, 121 08 Praha 2

email: kocna@lf1.cuni.cz