50 rokov od objavu hemoglobínu HbA_1c

Souhrn

V roku 1968 iránsky imunológ Samuel Rahbar publikoval náhodné zistenie minoritnej zložky ľudského hemoglobínu (HbA_1c) u diabetikov. Jeho nález otvoril široký priestor pre výskum s hlavnými výsledkami: glykohemoglobín HbA_1c sa stal v klinickej praxi objektívnym ukazovateľom metabolickej kompenzácie pri diabetes mellitus a štúdium zložitého procesu glykácie biomolekúl vyústilo do poznávania molekulového mechanizmu patogenézy chronických diabetických komplikácií a hľadania možností jeho ovplyvnenia.

Klíčová slova:

glykácia – hemoglobín HbA1c – patogenéza chronických diabetických komplikácií

Úvod

Uplynulo 50 rokov, keď Samuel Rahbar (obr. 1), imunológ univerzitnej nemocnice v Teheráne, uverejnil v medzinárodnom odbornom periodiku Clinica Chimica Acta prácu pod názvom „Abnormálny hemoglobín v červených krvinkách diabetikov“ [1]. V relatívne stručnej publikácii prezentoval náhodný laboratórny nález zistený pri rutinnej elektroforéznej analýze krvných vzoriek na prítomnosť patologických hemoglobínov v iránskej populácii. V súbore 1 200 vyšetrených pacientov sa mu ukázala v dvoch vzorkách výraznejšia, rýchlejšie sa pohybujúca „anomálna“ hemoglobínová zložka. V následnom pátraní zistil, že v obidvoch prípadoch išlo o pacientov s diabetes mellitus. Nevšedný nález si nechal pre istotu overiť v laboratóriu na Univerzite v Cambridge. V ďalšom, už cielenom výskume, ktorý realizoval v Department of Medicine na Albert Einstein College v USA (v spolupráci s prof. Helen M. Ranneyovou, odborníčkou v problematike patologických hemoglobínov), sa dokázal jednoznačný vzťah zisteného „anomálneho“ hemoglobínu k diabetu, ktorý sa potvrdil aj v experimentálnych podmienkach [2]. Existencia tejto zložky bola však konštatovaná už skôr ako minoritná, zapadajúca do „chromatografickej heterogenity“ normálneho adultného ľudského hemoglobínu HbA. Podľa vzdialenosti od štartu bola označená na chromatograme ako „c“, v súbore „1“ týchto minorít – HbA_1c [3].

Výskum štruktúrnej modifikácie HbA_1c

Výskumom štruktúrnej modifikácie HbA_1c sa zistilo, že vzniká chemickou (neenzýmovou) väzbou glukózy na molekulu hemoglobínu HbA. Kvantifikácia jeho tvorby závisí od koncentrácie a doby pôsobenia glukózy, preto je zrejmé, že sa nachádza v nízkom zastúpení aj v krvi nediabetikov. Reakcia prebieha ako dvojstupňový proces [4,5]. V prvom, rýchlejšom a vratnom stupni sa tvorí Schiffova zásada, ktorá prechádza Amadoriho molekulovým prešmykom na stabilnú aldimínovú (fruktozamínovú) formu (obr. 2):

Väzbovým miestom glukózy v tetramérnej molekule hemoglobínu sú N-terminálne aminoskupiny polypeptidových β-reťazcov [6]. Ide o funkčne významné miesta, v ktorých dochádza k iónovej interakcii s alosterickým efektorom 2,3-bisfosfoglycerátom (BPG), pri ktorej nastáva vratná konformačná zmena molekuly hemoglobínu z napnutého T-stavu (z angl. tight), na relaxovaný R-stav so slabšou afinitou ku kyslíku (posun oxygenačnej izotermy doprava). Výsledkom je uvoľnenie väčšieho množstva kyslíka do tkanív. Trvalé obsadenie väzbového miesta pre BPG glukózou znamená nepriaznivé zníženie transportnej schopnosti hemoglobínu [7,8].

Klinický význam HbA_1c

Objav HbA_1c otvoril priestor pre mimoriadne široký výskum zameraný spočiatku na jeho využitie v klinickej praxi ako objektívny ukazovateľ dlhodobej metabolickej kompenzácie a efektívnosti liečby u diabetikov. Hodnotu HbA_1c pri vyšetrení neovplyvňuje aplikácia inzulínu, príjem potravy, ani fyzická a psychická záťaž [9–11]. Neskôr sa ako krátkodobý ukazovateľ uplatnilo v klinickej praxi aj stanovenie glukózou modifikovaných plazmových proteínov s ich kratším polčasom obratu – fruktozamínový test [12].

Výskum pokročilej glykácie

Pribúdaním nových poznatkov sa výskum glykácie postupne sústredil na neenzýmovú (chemickú) väzbu glukózy aj na iné proteíny ako hemoglobín – všeobecne na jej vzťah k molekulovému mechanizmu patogenézy chronických diabetických komplikácií. Ukázalo sa, že sacharidová štruktúrna modifikácia postihuje patologicky nielen hemoglobín, ale aj ďalšie biomolekuly – proteíny, lipoproteíny, DNA a iné. Naviac, okrem glukózy sa týka aj ďalších redukujúcich monosacharidov (fruktóza, manóza a iné) a ich derivátov. Glykácia prebieha ako zložitý proces následných a paralelných chemických reakcií spojených s tvorbou reaktívnych voľných radikálov (oxidačný stres) a sekundárnych nesacharidových karbonylových štruktúr (karbonylový stres) vyúsťujúci do tvorby koncových produktov pokročilej glykácie (Advanced Glycation End products – AGEs) [13–20]. Ich patologické pôsobenie môže byť priame – trvalá modifikácia molekulových štruktúr a následná zmena funkčných vlastností extracelulárneho matrixu, alebo pôsobením špecifického receptora, ktorý zabezpečuje interakciu AGEs s bunkami organizmu. Identifikovalo sa viacero takýchto receptorov – AGE-R1, AGE-R2, AGE-R3, ale najviac je preskúmaný multifunkčný receptor RAGE, patriaci do veľkorodiny imunoglobulínov. Zistilo sa, že jeho aktiváciou sa realizuje účinok AGEs v patogenéze chronických diabetických komplikácií, vrátane oxidačného stresu a zápalových procesov (obr. 3) [21–23].

Na základe vyššie konštatovaných poznatkov výskumu sa ukazuje, že zložitý chemizmus glykácie je súčasťou molekulového mechanizmu patogenézy chronických diabetických komplikácií, a predpokladá sa jeho aktuálnosť aj v procese starnutia organizmu. Vychádzajúc z chemickej podstaty glykácie možno v jej procesoch predpokladať reálnosť biologickej aplikácie Maillardovej reakcie sacharidov s aminokyselinami a proteínmi, zistenej ešte v r. 1912 a označovanej aj ako „reakcia hnednutia“, ktorá je dlhodobo predmetom výskumu v odbore potravinárskej chémie [24–27].

Aktuálnosť HbA_1c a výskum glykácie na Slovensku

Na Slovensku iniciovala záujem o HbA_1c prof. MUDr. D. Michalková, DrSc. (1. detská klinika Detskej fakultnej nemocnice v Bratislave), obr. 4. Skoro po zverejnení prvých informácií v medzinárodných periodikách o predpokladanom klinickom význame HbA_1c [28–30], boli prezentované v spolupráci s Ústavom lekárskej chémie LF UK prvé vlastné výsledky klinickej aplikácie nového markera (už v r. 1980–1983) – na odborných seminároch a pracovných dňoch Slovenskej diabetologickej spoločnosti a Slovenskej lekárskej spoločnosti, a na Diabetologických dňoch v Luhačoviciach. Neskôr to boli aj Diabetologicko-biochemické dni v Bardejovských Kúpeľoch a Vedecké konferencie v Topoľčiankach venované pamiatke prof. MUDr. Rudolfa Korca, DrSc., veľkého propagátora HbA_1c. Prvé práce v domácich vedeckých periodikách vyšli v r. 1982 [31,32]. Výskum bol spočiatku zameraný na hodnotenie klinického významu HbA_1c s uplatnením, resp. modifikáciou laboratórneho fotometrického stanovenia založeného na meraní viazanej glukózy na hemoglobín [4], neskôr chromatografickej analýzy. Záujem o HbA_1c postupne prechádzal aj na iné klinické pracoviská – 1. a 2. internú kliniku a 1. neurologickú kliniku FN v Bratislave.

Paralelne s uvedenými bratislavskými pracoviskami sa prejavoval klinický i výskumný záujem o HbA_1c aj na Lekárskej fakulte Univerzity P. J. Šafárika v Košiciach, ktorý bol koordinovaný na Ústave patologickej fyziológie pod vedením prof. MUDr. O. Rácza, CSc. Tento ústav sa zúčastňoval na organizovaní pravidelných (I.–IV.) „Diabetologicko-biochemických dní“ Slovenskej diabetologickej spoločnosti, ktoré sa konali v 2-ročných odstupoch v Bardejovských Kúpeľoch (v r. 1987–1993), na ktorých mala problematika glykohemoglobínu a glykácie plazmových proteínov (fruktozamínový test) významné zastúpenie. V r. 1983 zorganizoval tento ústav monotematické pracovné dni na tému Glykozylovaný hemoglobín a r. 2004 seminár Glykovaný hemoglobín – HbA_1c, pod záštitou viacerých odborných spoločností. Pod autorstvom košického kolektívu vyšlo v r. 1989 monografické spracovanie problematiky HbA_1c a glykácie proteínov [33].

Štúdium možnosti ovplyvnenia procesu glykácie

Záujem o glykovaný hemoglobín HbA_1c postupne prechádzal do základného výskumu glykácie – molekulového mechanizmu vývoja chronických diabetických komplikácií, s hľadaním možností jeho ovplyvnenia syntetickými alebo prírodnými látkami s antiglykačnými, antioxidačnými a chelátotvornými vlastnosťami (vychytávanie kovových iónov katalyzujúcich tvorbu voľných radikálov). Z tohto hľadiska bol medzinárodne mimoriadne intenzívne sledovaný aminoguanidín [34], u ktorého sa však zistili aj toxické vlastnosti [35]. K početným skúmaným inhibítorom glykácie prispel aj sám objaviteľ hemoglobínu HbA_1c S. Rahbar [36]. Na bratislavskom ústave LF UK sa venoval v tomto zameraní značný výskumný priestor – experimentálne testovanie kondenzačného derivátu aminoguanidínu – rezorcylidénaminoguanidín (RAG), ktorý vykazoval rovnaký antiglykačný potenciál ako voľný aminoguanidín, ale bez toxických účinkov, naviac s prejavom aj antioxidačných, chelátotvorných a iných pozitívnych vlastností [37,38]. Analogickým derivátom je pyridoxylidénaminoguanidín – kondenzát aminoguanidínu s pyridoxálom (zložkou vitamínu B₆), testovaný japonskými autormi [39].

Vyššie naznačený výskum, spojený s riešením početných výskumných úloh v širokej domácej a zahraničnej spolupráci, vyústil na Ústave lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie LF UK v Bratislave do vedeckej školy v danej problematike, ako základne pre školenie diplomandov a postgraduálnych doktorandov z viacerých fakúlt UK (aj zo zahraničia) a univerzitných kliník LF.

Z celkového počtu približne 100 prác venovaných HbA_1c a problematike glykácie, publikovaných v domácich a zahraničných odborných periodikách, k 10 najcitovanejším prácam (v r. 2018) podľa SCI patria [42–51].

Záver

Rahbarov objav sa považuje z hľadiska zdokonalenia diagnostiky a manažmentu diabetu za revolučný. Ako laboratórny test bol prvýkrát použitý v r. 1977. Komerčne vyrábaný (imunoanalytický test, RIA) bol dostupný v r. 1991.

Americká diabetologická asociácia (ADA) ocenila v r. 2012 Samuela Rahbara (krátko pred jeho smrťou) udelením, po ňom pomenovanej národnej ceny za vedecký prínos Samuel Rahbar Outstanding Discovery Award – objaviteľa hemoglobínu HbA_1c – markera monitorovania glykemického statusu, markera prevencie vzniku chronických diabetických komplikácií markera kvality manažmentu liečby miliónov diabetikov na celom svete.

Hemoglobín HbA_1c otvoril cestu k intenzívnemu výskumu neenzýmovej chémie v biologických systémoch, ktorý pokračuje doteraz [40,41].

Doručené do redakcie 7. 10. 2019

prof. RNDr. Jozef Čársky, CSc.,

emeritný profesor

jozef.carsky@fmed.uniba.sk

www.uniba.sk