Význam acidolabilní podjednotky (ALS) v etiologii a v diagnostice malého vzrůstu

Souhrn

 * Toni L., Pádrová K. - obě autorky přispěly k této práci stejným dílem

Cíl studie: Acidolabilní pojednotka (ALS) jako glykoproteinová součást ternárního komplexu IGF-1/IGFBP-3/ALS reguluje bioaktivitu a prodlužuje poločas IGF-1, čímž přispívá k řízení tělesného růstu. Proteinovou složku ALS kóduje gen IGFALS. Zkoumali jsme vliv růstového hormonu (GH) na hladiny ALS a dalších složek ternárního komplexu a možnost identifikovat podle nízkých hladin ALS pacienty s patogenními variantami genu IGFALS.

Metody: U 511 dětí s deficitem GH (GHD) a/nebo u dětí s poruchou růstu navazující na malou velikost při narození (SGA-SS) jsme při léčbě GH analyzovali hladiny a vzájemnou korelaci všech tří složek ternárního komplexu. U tří dětí s nízkou hladinou ALS jsme následně sekvenovali gen IGFALS. Vliv podání GH na složky ternárního komplexu jsme studovali u 23 dětí s GHD nebo SGA-SS neurčené etiologie.

Výsledky: U 511 dětí s GHD a/nebo SGA-SS na dlouhodobé léčbě GH byla hladina ALS 8750 µg/l (medián; Q1-Q3: 6353–10 963), hladina IGF-1 233 µg/l (Q1-Q3: 147–329), což odpovídalo +1,21 SD (Q1-Q3: -0,11 až +2,45), a hladina IGFBP-3 5660 µg/l (Q1-Q3: 4668–6800), což odpovídalo +3,65 SD (Q1-Q3: +1,81 až +5,97 SD). Hladiny ALS těsně korelovaly s IGF-1 (r = 0,70; p <0,0001) i s IGFBP-3 (r = 0,61; p <0,0001). Sangerova sekvenace IGFALS u dětí s nízkou hladinou ALS (369, 487 a 1490 µg/l) neprokázala patogenní ani jinou variantu genu. U 23 dětí s GHD nebo SGA-SS stoupla po 3–4 měsících podávání GH hladina ALS z 4859 (medián; Q1-Q3: 4176–6240) na 6681 (5413–8332) µg/l (p = 0,0004), hladina IGF-1 z 68 (46–114) na 146 (84–178) µg/l (p <0,0001) a hladina IGFBP-3 z 3390 (2820–4030) na 4700 (3940–5300) µg/l (p <0,0001). Vliv GH na IGF-1 (213 % výchozí hodnoty) je výraznější než na IGFBP-3 (132 %; p <0,0001) a ALS (139 %; p <0,0001).

Závěry: Měření hladin ALS není efektivní pro detekci mutací IGFALS. GH zvyšuje hladiny ALS, ale biochemické stanovení ALS má jen nevýznamnou přidanou hodnotu pro diagnostiku a sledování dětí s malým vzrůstem.

Klíčová slova:

acidolabilní podjednotka – IGF-1 – IGFBP-3 – ternární komplex – růstový hormon – IGFALS

ÚVOD

Inzulinu-podobné růstové faktory IGF-1 a IGF-2 (insulin-like growth factor-1 a -2) hrají klíčovou roli v růstu a vývoji. Oba IGF se syntetizují v játrech v endokrinně aktivních hepatocytech, odkud přecházejí do cirkulující krve a působí na cílové buňky ve vzdálených tkáních. Vedle toho se část IGF-1 a IGF-2 produkuje lokálně v řadě typů buněk a působí autokrinně a parakrinně. Oba IGF ovlivňují lineární růst, proliferaci a diferenciaci buněk a apoptózu [1].

V cirkulující krvi jsou téměř všechny molekuly IGF-1 a IGF-2 vázány v ternárním komplexu o velikosti 150 kDa, který se skládá z molekuly IGF, z molekuly vazebného proteinu pro IGF (IGF-binding protein; IGFBP), nejčastěji zastoupeného IGFBP-3 a v menším rozsahu IGFBP-5, a z acidolabilní podjednotky (acid-labile subunit; ALS) – glykoproteinu o velikosti 85 kDa [2]. Vedle IGFBP-3 a IGFBP-5 jsou v omezeném množství přítomny další vazebné proteiny – IGFBP-1, 2, 4 a 6, které mají menší molekulovou hmotnost 50 kDa. Zatímco binární komplex tvořený IGF a některým z IGFBP může pronikat přes endoteliální bariéru, navázání ALS a vytvoření ternárního komplexu prodlužuje dobu, kdy je IGF přítomen v cirkulující krvi a zároveň chráněn před destrukcí [3] (obr. 1). Poločas volně cirkulujícího IGF-1 je pouhých 10 minut; binární komplex IGF-1 – IGFBP-3 přetrvává v krvi 30–90 minut a ternární komplex s ALS prodlužuje poločas na více než 12 hodin [3].

ALS je kódována genem IGFALS [4]. Patogenní varianty IGFALS snižují nebo zvyšují stabilitu ternárního komplexu a způsobují růstovou poruchu, která je závažná zvláště v případě homozygotních mutací, delecí nebo duplikací. U heterozygotních patogenních variant je porucha růstu mírnější [5–8].

I když brzy po objevu ALS v 90. letech 20. století proběhlo několik in vitro studií u různých živočišných druhů a později i některé klinické studie [9], zatím není jasný diagnostický význam stanovení hladiny ALS u dětí s růstovou poruchou ani u dětí s poruchou růstu na podkladě patogenních variant IGFALS genu [10].

Cílem naší studie bylo:

(1) Stanovit hladiny složek ternárního komplexu IGF-1/IGFBP-3/ALS v periferní krvi v rozsáhlé skupině 511 dětí dlouhodobě léčených růstovým hormonem (GH) a klasifikovaných jako deficit GH (GHD) nebo jako porucha růstu navazující na malou velikost při narození (small for gestational age – short stature; SGA-SS). Cílem tohoto vyšetření bylo nalézt dosud neznámé nositele homozygotních nebo heterozygotních patogenních variant genu IGFALS a ověřit hypotézu, že nízká hladina ALS při léčbě růstovým hormonem může predikovat nerozpoznanou patogenní variantu genu IGFALS.

(2) Formou semilongitudinální studie s párovým měřením posoudit vliv zahájení léčby GH na hladiny složek ternárního komplexu IGF-1/IGFBP-3/ALS v periferní krvi u nově diagnostikovaných dětí s GHD a u dětí SGA-SS.

SOUBOR PACIENTŮ A METODIKA

Všichni pacienti zařazení do studie jsou dlouhodobě sledováni na Pediatrické klinice 2. lékařské fakulty UK a Fakultní nemocnice v Motole a jsou léčeni růstovým hormonem z indikace GHD nebo SGA-SS.

Studie 1 – Stanovení složek ternárního komplexu u velké kohorty dětí s GHD a SGA-SS léčených GH

V této studii jsme vyšetřili jednotlivé složky ternárního komplexu během dlouhodobé léčby GH u 511 dětí (321 chlapců, 190 dívek) ve věku 2–18 let (medián 10 let). V případě nízké hladiny ALS bylo pacientům nabídnuto molekulárně genetické vyšetření genu IGFALS. Po podpisu informovaného souhlasu byla odebrána krev na izolaci DNA. Studie byla schválena Etickou komisí Fakultní nemocnice v Motole.

Studie 2 – Semilongitudinální studie vlivu GH na vývoj hladin složek ternárního komplexu

U 23 dětí (18 chlapců, 5 dívek) ve věku 3–15 let (medián 7 let) s GHD (n = 19) nebo SGA-SS (n = 4) jsme vyšetřili hladiny IGF-1, IGFBP-3 a ALS před zahájením léčby a po 3–4 měsících podávání GH, který byl aplikován v přesně definované dávce 0,033 mg/kg/den v každodenní s.c. injekci.

Stanovení acidolabilní podjednotky (ALS)

Stanovení ALS v séru bylo provedeno ELISA sendvičovou metodou za použití komerčního kitu (Human ALS, Mediagnost, Německo). Principem metody je vazba molekul ALS obsažených ve vzorku na protilátky, které jsou imobilizovány na povrchu jamek mikrotitrační destičky. Následně se k imobilizovaným molekulám ALS přidá biotinizovaná protilátka anti-ALS, která s nimi interaguje a vzniklý komplex následně váže konjugát streptavidin/peroxidáza, který v závěrečném kroku katalyzuje přeměnu přidaného substrátu. Enzymatická reakce dává vznik barevnému produktu, který je kvantitativně závislý na množství ALS ve vzorku a jehož množství se detekuje spektrofotometricky (450 nm). Linearita systému měření byla deklarována v rozsahu 0,5330 µg/mL ALS. Pro více koncentrované vzorky bylo měření opakováno po větším naředění. Analýza všech vzorků, kontrolních a kalibračních roztoků byla provedena duplicitně. Koncentrace ALS ve vzorku byla vypočítána z rovnice získané nelineární regresí kalibrační křivky.

Stanovení IGF-1 a IGFBP-3

Stanovení IGF-1 a IGFBP-3 v séru bylo provedeno pomocí automatického imunoanalyzátoru Immulite 1000 (Siemens Healthcare Diagnostics). Princip metody je založen na enzymatické chemiluminiscenční imunochemické reakci v pevné fázi.

Sekvenace genu IGFALS

DNA byla izolována pomoci QIAmp DNA Blood Mini kit, Sangerovo sekvenování genu IGFALS jsme prováděli s využitím metodiky publikované v naší předchozí studii [11].

Statistika

Ke statistickému hodnocení výsledků byl použit párový a nepárový t-test a test lineární regrese se stanovením korelačního koeficientu „r“. Za statisticky významné byly považovány výsledky s hodnotou p <0,05.

VÝSLEDKY

Studie 1 – Stanovení složek ternárního komplexu u velké kohorty dětí s GHD a SGA-SS na léčbě růstovým hormonem

U 511 dětí s GHD a/nebo SGA-SS na dlouhodobé léčbě GH jsme nalezli střední hladinu ALS 8750 µg/l (medián; Q1-Q3: 6353–10 963), střední hladinu IGF-1 233 µg/l (Q1-Q3: 147–329), což odpovídalo standardizované hodnotě +1,21 SD (Q1-Q3: -0,11 až +2,45), a střední hladinu IGFBP-3 5660 µg/l (Q1-Q3: 4668–6800), což odpovídalo standardizované hodnotě +3,65 SD (Q1-Q3: +1,81 až +5,97 SD).

Hladiny ALS těsně korelovaly s hladinami IGF-1 (r = 0,70; p <0,0001 – obr. 2) i s hladinami IGFBP-3 (r = 0,61; p <0,0001).

V tabulce 1 jsou uvedeny nálezy u 3 pacientů s mimořádně nízkými hodnotami ALS a současně s nenápadnými hodnotami IGF-1 a IGFBP-3 na léčbě GH. U těchto pacientů jsme provedli sekvenaci genu IGFALS. Sangerovým sekvenováním jsme nenalezli patogenní ani jinou variantu genu IGFALS.

Studie 2 – Semilongitudinální studie vlivu GH na hladiny složek ternárního komplexu

U 23 dětí stoupla během 3–4 měsíců léčby GH hladina ALS z 4859 (medián: Q1-Q3: 4176–6240) na 6681 (5413–8332) µg/l (p = 0,0004; obr. 3), hladina IGF-1 z 68 (46–114) na 146 (84–178) µg/l (p <0,0001) a hladina IGFBP-3 z 3390 (2820–4030) na 4700 (3940–5300) µg/l (p <0,0001). GH tedy ovlivňuje všechny složky ternárního komplexu, ale jeho vliv na IGF-1 (vzestup na 213 % výchozí hodnoty) je výraznější než vliv na IGFBP-3 (132 %; p <0,0001) a ALS (139 %; p <0,0001, obr. 4).

DISKUSE

Přestože zájem o ALS trvá již přes tři desetiletí, jsou údaje o jejím fyziologickém významu a o její patofyziologii fragmentární. Pro pochopení role ALS v organismu v roce 2001 Ueki se spolupracovníky [12] modelovali inaktivaci IGFALS genu u myši. Zjistili, že tato myš má jen mírnou růstovou retardaci, přestože cirkulující složky IGF systému jsou závažně alterované. O několik let později byl genový defekt IGFALS a jeho fenotyp poprvé popsán u člověka [6]. Byl identifikován u 17letého mladého muže s opožděným nástupem a pomalým průběhem puberty, ale jen s hraniční růstovou poruchou. Tento původní fenotyp byl na základě pozorování u dalších desítek nositelů mutace zpřesněn: Narušení pubertálního vývoje může být jedním z příznaků, ale porucha růstu je konzistentní, i když v jednotlivých případech různě závažná [8].

Identifikace chlapce s patogenní variantou IGFALS v naší předchozí studii [13] vzbudila náš zájem o ALS. Proto jsme se v několika dílčích studiích pokusili doplnit chybějící poznatky, které mohou mít význam pro klinickou praxi v dětské endokrinologii.

S cílem identifikovat patogenní varianty genu IGFALS jsme vyšetřili koncentraci ALS v cirkulující krvi u kohorty pacientů při léčbě GH. U tří z nich s nízkými hladinami ALS jsme sekvenovali gen IGFALS. U žádného z nich jsme neprokázali patogenní ani jinou variantu genu. K podobnému závěru dospěli i Renes se spolupracovníky [9], kteří sekvenovali gen IGFALS u 34 dětí s nízkou koncentrací ALS v séru a též nenašel patogenní variantu. Naše studie byla limitována chyběním pacientů s potvrzenou patogenní variantou IGFALS, u kterých bychom stanovili nativní hladiny ALS.

Je zajímavé, že většina dosud identifikovaných pacientů s patogenními variantami IGFALS nebyla zjištěna na základě měření ALS, ale na základě velmi nízkých hladin IGF-1 a IGFBP-3 v době diagnostiky – protože chybění aktivní ALS výrazně zkracuje jejich poločas. Teprve dodatečně byly u některých těchto pacientů změřeny nízké až neměřitelné hladiny ALS a následné sekvenování IGFALS prokázalo patogenní variantu [14–16]. V jiných případech byly varianty IGFALS nalezeny metodami celoexomového sekvenování dětí s malým vzrůstem, podobně jako v naší předchozí studii [13].

Vliv GH na všechny složky ternárního komplexu jsme jednoznačně prokázali v semilongitudinální studii u 23 dětí s GHD nebo SGA-SS. Působení na sekreci IGF-1 je výraznější (vzestup na 213 % výchozí hodnoty) než vliv na IGFBP-3 (132 %), což je v souladu s předchozími studiemi [17, 18].  Signifikantní byl i vzestup koncentrace ALS po zahájení terapie růstovým hormonem ALS (139 %), který dosud publikován nebyl a který prokazuje, že exprese genu IGFALS je řízena růstovým hormonem – ALS patří mezi tzv. „GH-dependentní peptidy“.

Měření hladin IGF-1, IGFBP-3 a ALS v početné skupině 511 dětí s GHD a/nebo SGA-SS dlouhodobě léčených GH ukázalo, že stanovení ALS nepřináší o diagnóze ani o průběhu léčby další významnou novou informaci v porovnání s měřením IGF-1, případně IGFBP-3, vzhledem k těsné korelaci mezi naměřenými hodnotami těchto peptidů.

Uvedené závěry naznačují, že laboratorní stanovení ALS má v současné době jen nevýznamnou přidanou hodnotu pro diagnostiku a další sledování dětí s malým vzrůstem.

Poděkování

Studie byla provedena s podporou grantu Agentury pro zdravotnický výzkum (AZV) č. 18-07-00283.

MUDr. Ledjona Toni

Pediatrická klinika 2. lékařské fakulty UK

 a FN Motol

V Úvalu 84

150 06 Praha 5

e-mail: ledjonatoni@gmail.com