Endogenně produkovaná chemiluminiscence vnitřních a povrchových struktur zubu: pilotní studie

Souhrn

Úvod: V důsledku metabolických dějů dochází v živých strukturách k endogenní produkci chemiluminiscence, kterou také označujeme jako biologickou autochemiluminiscenci (BAL). Generování BAL je úzce spojeno s oxidačními procesy, tvorbou volných radikálů a obecně oxidačně-redukční homeostázou zkoumaného biologického materiálu. BAL byla již dříve studována v savčích buněčných modelech a tkáních. Doposud ovšem nebyl tento jev popsán v případě struktur zubní tkáně. Kromě endogenně generované BAL lze BAL indukovat i exogenně, a to jak fyzikálními (UV záření, mechanické poškození, teplo), tak i chemickými (oxidační činidla, např. H₂O₂) a biotickými (patogeny) faktory.

Metodika: V předložené práci byla zkoumána endogenně produkovaná i exogenně indukovaná BAL v povrchových a vnitřních strukturách semiretinovaných a retinovaných třetích molárů, které byly indikovány k extrakci zubním lékařem pro jejich nevhodné uložení v čelisti u dvou pacientů (žena, 21 let, muž, 22 let). Detekce BAL byla provedena po mechanickém odstranění zubního plaku rotačním kartáčkem. Pomocí piezoelektrické pily byly připraveny podélné řezy vedené tak, aby došlo k odhalení všech vnitřních částí zubu. Takto připravené vzorky – celého vnitřního řezu a vnější části celého zubu – byly podrobeny detekci BAL ve světlotěsné komoře za použití fotonásobičového modulu. Následně byly vzorky ošetřeny roztokem oxidačního činidla 3% H₂O₂ a redukčního činidla 10 mM TCEP (tris(karboxyethyl)fosfin).

Výsledky: U obou vzorků zubu bylo prokázáno, že produkují BAL. Produkce endogenní chemiluminiscence byla pozorována ve vnitřních strukturách zubu (18 600 pulzů/600 s), která byla přibližně 2,7krát vyšší než BAL detekovaná na povrchových strukturách zubu (6 900 pulzů/600 s).
Po ošetření H₂O₂ došlo k významnému (až 14násobnému) nárůstu BAL pro vnitřní struktury zubu ve srovnání s bazální intenzitou endogenně produkované BAL. Aplikace TCEP (negativní kontrola) vedla k mírnému potlačení produkce BAL.

Závěr: Výsledky této pilotní studie ukazují, že BAL může být produkována nejenom měkkými tkáněmi, ale i tvrdou zubní tkání. Získané výsledky by mohly být využity k výzkumu metabolické aktivity a reaktivity vnitřních i vnějších částí zubu, a to především v kontextu výzkumu oxidačněredukční homeostázy. Detekce BAL by také mohla být aplikována pro vývoj nových zobrazovacích technik.

Klíčová slova:

biologická autochemiluminescence, struktury zubu, oxidační stres

ÚVOD

V biologických systémech, kde dochází k oxidačním procesům, vzniká takzvaná biologická autochemiluminiscence (BAL) [1]. Je taktéž běžně používán pojem ultra slabá emise fotonů [2]. Oxidační děje probíhající v biologických vzorcích navozují tvorbu elektronově excitovaných stavů molekul, které poté mohou vést k emisi fotonů (obr. 1). Jev probíhá endogenně bez nutnosti vnějších vstupů či zásahů. Jedná se o proces, který byl pozorován u mikroorganismů, rostlin i živočichů a dá se pozorovat na různých strukturálních úrovních – buňkách, orgánech i jednotlivých organismech [4].

Elektronově excitované stavy molekul vznikají v průběhu oxidačních metabolických procesů a při podmínkách, které jsou spojeny s produkcí reaktivních forem kyslíku (ROS), viz obr. 1 [3, 5]. BAL tedy vzniká endogenně v důsledku metabolických dějů, které představují základní biochemické reakce, jako je buněčné dýchání nebo oxidační vzplanutí buňky. Exogenně indukovaná BAL může být podmíněna biotickými faktory, jako jsou viry, houby a bakterie, nebo faktory abiotickými. Abiotické faktory můžeme rozdělit na chemické a fyzikální. Mezi fyzikální řadíme UV záření, mechanické poškození a teplo. Mezi chemické činitele řadíme např. toxiny, cigaretový kouř a oxidační činidla, především H₂O₂ [6]. Tyto faktory mohou vést k nadměrné produkci ROS, navození oxidačního stresu a ovlivnění oxidačněredukční homeostázy [7].

Přestože má peroxid vodíku poměrně nízký redoxní potenciál, aby mohl přímo oxidovat biomolekuly, může se účastnit Fentonovy reakce nebo Haber-Weissovy reakce vedoucí ke vzniku hydroxylového radikálu (HO^•) [8], což je vysoce reaktivní a biologicky relevantní radikál schopný oxidovat biomolekulární struktury [9]. Hydroxylové radikály (nebo jiné sekundárně produkované radikály) mohou poté iniciovat řetězovou reakci, která se projevuje jako autooxidace [10]. Tento komplexní proces může vést k emisi BAL jak u živých, tak i neživých vzorků biologického původu. U živých organismů je udržována oxidačněredukční homeostáza, a tím i stabilní úroveň BAL. Nezbytnou součástí této homeostázy jsou antioxidanty, které pomáhají udržovat dynamickou rovnováhu v produkci reaktivních forem kyslíku (ROS) [7]. ROS vznikají v organismu přirozeně během metabolických procesů, ale jejich nadměrná produkce může vést k oxidačnímu stresu a způsobit nevratné poškození buněk a tkání. Mezi enzymové antioxidanty patří např. superoxiddismutáza, kataláza či glutationperoxidáza, zatímco mezi nízkomolekulární antioxidanty řadíme vitamíny C a E, karotenoidy, koenzym Q10 a další. Přítomnost těchto antioxidantů typicky snižuje intenzitu BAL.

BAL u lidských subjektů byla detekována pouze z povrchově přístupných častí těla, přičemž nejvíce studií bylo zaměřeno na výzkum kůže. Intenzita BAL u člověka závisí na různých faktorech [11], např. na teplotě (související s lokálním prokrvením a intenzitou metabolismu), kdy s poklesem teploty subjektu klesá i intenzita BAL [12]. Dále BAL vykazuje anatomickou asymetrii [13] a závislost na konkrétním místě měření [14]. Nejnižší intenzita byla naměřena na hrudníku, zatímco nejvyšší byla detekována na končetinách a hlavě. BAL také podléhá dennímu cyklu, kde nejnižší intenzita bývá ráno a postupně se zvyšuje během odpoledne [15, 16]. Kromě toho je BAL závislá na ročním období, kdy nejvyšší hodnoty byly naměřeny v létě a nejnižší na podzim [17]. Spontánní úroveň BAL přirozeně stoupá s věkem [18] nebo může krátkodobě vzrůst během fyzické aktivity [19]. Na intenzitu BAL má vliv i zdravotní stav, například u pacientů s hemiparézou dochází k nárůstu asymetrie BAL u horních končetin [20], zatímco při nachlazení dochází ke spektrální změně BAL [21]. Nedávná studie také naznačila, že BAL by mohla být využita při diagnóze diabetu [22]. Z toho plyne, že systémové nebo vnitřní stavy lidského těla mohou výrazně ovlivňovat procesy probíhající v kůži vedoucí ke změně v produkci BAL. Zobrazování BAL pomocí ultra senzitivních zařízení by tak mohlo potenciálně umožnit sledování oxidačního stresu v opticky přístupných oblastech lidského těla, jak bylo nedávno popsáno právě pro kůži [6].

Cílem této pilotní studie bylo zjistit, zda lidské zuby vykazují BAL a zda jsou rozdíly mezi endogenní produkci BAL a indukovanou BAL produkcí pomocí peroxidu vodíku (H₂O₂).

MATERIÁL A METODIKA

Pilotní studie byla prováděna se souhlasem Etické komise FN a LF UP Olomouc (č. j. 26/24) a podle stanov Helsinské deklarace z roku 1975, revidované v roce 2013. Pro účely studie byly extrahovány semiretinované a retinované třetí moláry, které byly indikovány k extrakci zubním lékařem pro jejich nevhodné uložení v čelisti u dvou pacientů (pacient A: žena, 21 let, zub 18; pacient B: muž, 22 let, zub 48, fotodokumentace uvedena na obrázku 2). Zuby byly chirurgicky extrahovány v lokální svodné a infiltrační anestezii s použitím 4 ml 4% artikainu s adrenalinem v koncentraci 1 : 200 000 (Supracain, Zentiva, Praha) a následně byly uloženy do 0,1 M fosfátového pufru (pH 7). V temném prostředí byly vzorky transportovány do laboratoře Ústavu fotoniky a elektroniky Akademie věd ČR (ÚFE AV ČR), kde probíhala příprava vzorku a samotné měření BAL. Od extrakce do provedení analýz BAL uběhlo šest hodin.

Fotodokumentace jednotlivých zubů a jejich řezů byla provedena před měřením BAL digitálním USB mikroskopem AM73915MZT (Dino-Lite, Taipei, Tchaj-wan). Nejprve byly mechanicky odstraněny periodontální ligamenta, zbytky gingivy, příměs krve, drobné kostní struktury a biofilm. Následoval oplach v ultračisté vodě (Merck, Darmstadt, Německo). Zuby byly očištěny pomocí jemných mechanických rotačních kartáčků (EVE Diacomp Plus Twist – Eve Ernst Vetter GmbH, Pforzheim, Německo) na chirurgickém motoru (Kavo MASTERsurg – KaVo, Biberach an der Riß, Německo), vždy za masivního chlazení (100 ml/min) fyziologickým roztokem (FR), aby nedocházelo k zahřívání povrchu zubu. Po měření BAL z povrchu zubu byl proveden vertikální řez zubem na dvě přibližně stejné poloviny piezoelektrickou pilou (Mectron Piezosurgery white – Caronno Pertusella, Itálie), opět za stálého chlazení FR. Mechanické očištění zubu bylo provedeno pouze na jeho povrchu, nikoli na povrchu vertikálních řezů.

Pro měření BAL byla použita světlotěsná komora (Bioelektrodynamika, ÚFE AV ČR, Praha) s fotonásobičovým modulem H7360-01 (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japonsko), viz obr. 3. Příprava vzorku probíhala v temné komoře, kde byl zub umístěn nejméně deset minut před měřením jako prevence před dosvitem. Zub byl měřen ve skleněné Petriho misce vzdálené 1 cm od detektoru při teplotě 23 °C. Kromě měření endogenně produkovaného BAL byl také aplikován 3% peroxid vodíku (Merck, Darmstadt, Německo) nebo redukční činidlo 10 mM TCEP.HCl (Merck, Darmstadt, Německo) po dobu deseti minut pro účely exogenní indukce či potlačení BAL. Obě látky byly aplikovány ve tmě na vnitřní strukturu zubu, resp. na separátní řez. Naměřené signály byly odečteny pomocí jednotky C8855 (Hamamatsu Photonics, Shizuoka, Japonsko).

Data byla zpracována v programu Matlab verze 9.12 (MathWorks, Natick, Massachusetts, USA).

VÝSLEDKY

U obou vzorků zubů bylo prokázáno, že produkují BAL, a to jak na vnějším povrchu, tak i v případě vnitřních struktur. Měření bylo prováděno po dobu 600 s. Produkce BAL byla pozorována ve vnitřních strukturách zubu (18 600 pulzů/600 s), kde byla přibližně 2,7krát vyšší než BAL detekovaná na povrchových strukturách zubu (6900 pulzů/600 s) – hodnoty jsou uvažovány po odečtení úrovně šumu (graf 1). Spojnicové grafy 1A a 1B zobrazují naměřená data, z jejichž sumy byla spočítána průměrná hodnota a směrodatná odchylka zobrazená ve výsledném sloupcovém grafu 1C. Po ošetření H₂O₂ došlo k významnému (až 14násobnému) nárůstu BAL pro vnitřní struktury zubu ve srovnání s bazální intenzitou endogenně produkovaného BAL.

DISKUSE

Výsledky této pilotní studie naznačují, že BAL není produkována pouze měkkými tkáněmi, ale i tvrdou tkání zubu. Zubní tkáň spontánně generuje BAL v podobných intenzitách, jaké pozorujeme například u lidské kůže [6]. Stejně jako u jiných biologických systémů jsme i u zubní tkáně zaznamenali efekt dosvitu po předchozí expozici běžnému laboratornímu (dennímu) osvětlení; data nejsou ukázána. U zkoumaných vzorků docházelo po expozici na denním světle k okamžitému zvýšení intenzity BAL. H₂O₂ je prekurzorem pro produkci ROS [23], což vede ke zvýšení BAL. Aplikace TCEP (negativní kontrola) vedla ke snížení produkce BAL. TCEP byl použit, protože vytváří redukující prostředí [24, 25], které potlačuje oxidační přeměny v tkáni zubu, jenž je během experimentu přirozeně exponován molekulárnímu kyslíku. Po umístění vzorku zpět do temné komory se BAL postupně snižovala na výchozí spontánní úroveň endogenně generovaného BAL. Intenzivnější produkce BAL na površích vnitřních řezů zubů koresponduje s přítomností živé tkáně a významně vyššího zastoupení organických sloučenin v dentinu a pulpě nežli ve sklovině [26]. V rámci interpretace výsledků je třeba zohlednit rozdíl ve velikosti zubního kazu mezi vzorky A a B, kde vzorek A, na kterém byl přítomný okluzální kaz většího rozsahu, vykazoval vyšší aktivitu BAL ve srovnání se vzorkem B. V dalším výzkumu by bylo vhodné použít intaktní zuby (retinované třetí moláry nebo zuby určené k extrakci z ortodontické indikace).

Přidání peroxidu vodíku vedlo k nárůstu BAL, který interpretujeme jako důsledek zvýšené produkce hydroxylových radikálů v zubní tkáni, což iniciovalo reakce zvyšující množství elektronově excitovaných stavů. Protože byl peroxid vodíku přidán jednorázově a nedocházelo k jeho kontinuálnímu přísunu, pozorovali jsme v kinetice BAL postupný pokles intenzity, což odpovídá jeho spotřebování. Tento jev byl zaznamenán i u jiných systémů, například u lidské kůže [6], kde peroxid vodíku vykazoval podobný účinek na kinetiku BAL.

Z logistických důvodů byly výše popsané analýzy provedeny se vzorky zubů po šesti hodinách od extrakce. Pokud je zub uložen v prostředí podporujícím přežití buněk (například v transportním médiu, jako je Hank`s Banced Salt Solution (HBSS) nebo mléko), mohou buňky přežít až 24 hodin nebo déle, než začnou ztrácet schopnost regenerace [27]. V navazujících experimentech budeme cílit na kinetiku BAL, kterou budeme monitorovat ihned po extrakci, a sledovat tak odumírání zubní tkáně v reálném čase. Komplementární analýzy budou provedeny i se zuby s nedokončeným vývojem, u kterých předpokládáme vyšší metabolickou aktivitu.

Získané výsledky by mohly být využity k výzkumu metabolické aktivity a reaktivity vnitřních i vnějších částí zubu, a to především v kontextu výzkumu oxidačněredukční homeostázy a regulace. Detekce BAL by také mohla být aplikována pro vývoj nových (neinvazních) zobrazovacích technik. Taková řešení by přinášela možnost zobrazování oxidoredukční dynamiky zcela bez použití chemického značení, což by bylo výhodou zejména v klinických aplikacích in situ. V případě, že by byla provedena srovnávací analýza detekce BAL na mechanicky očištěném zubu a zubu, který je pokryt zubním kamenem, plakem nebo pouze pelikulou, bylo by možné zkoumat metabolickou aktivitu těchto entit či povrchových struktur, případně sledovat metabolickou aktivitu adherovaných bakterií či patogenů. Taktéž by bylo možné touto cestou srovnávat aktivitu a reaktivitu oblastí nativní skloviny a kariézní léze.

ZÁVĚR

Výsledky této pilotní studie ukazují, že BAL může být produkována vnitřními i vnějšími strukturami zubní tkáně. Pomocí aplikace peroxidu vodíku nebo TCEP je možné regulovat intenzitu BAL u zkoumaných vzorků zubní tkáně. Získané výsledky by mohly být využity k výzkumu metabolické aktivity a reaktivity jednotlivých částí zubu a pro vývoj nových zobrazovacích technik.

Poděkování

Autoři děkují dr. Vlastimilu Dorčákovi (Ústav lékařské chemie a biochemie, Lékařská fakulta Univerzity Palackého v Olomouci) za kritické posouzení textu a diskusi.
Za finanční podporu děkujeme Univerzitě Palackého v Olomouci, RVO 61989592. MP děkuje projektu L100672501 programu PPLZ AV ČR za podporu. MC a DH děkují
projektu GAČR č. 25-16700S. Dále za jazykovou úpravu anglických textů patří poděkování B. J. Watson-Jonesovi, MEng.

Prohlášení o střetu zájmů

Autoři deklarují, že nemají žádný konflikt zájmů týkající se tématu diskutovaného v tomto článku.

Podíl autorů na publikaci

Pavel Beneš a Petr Jirásek provedli odběr klinického vzorku, Pavel Beneš a Michaela Poplová přípravu vzorků a měření BAL. Michaela Poplová provedla zpracování a analýzu dat. Daniel Havelka se podílel na měření BAL a zpracování dat. Pavel Beneš, Michal Cifra, Michaela Poplová a Jan Vacek se podíleli na designu experimentu, vyhodnocení získaných výsledků a přípravě první verze rukopisu. Všichni autoři přispěli k sepsání rukopisu.

Korespondující autor

MDDr. Pavel Beneš
Klinika zubního lékařství
Lékařská fakulta Univerzity Palackého v Olomouci
Fakultní nemocnice Olomouc
Palackého 12
779 00  Olomouc
e-mail: pavel.benes@fnol.cz