Antiadhezívna, antibiofilmová a disperzná aktivita biosurfaktantov izolovaných z Bacillus amyloliquefaciens 3/22

Souhrn

Cieľom práce bolo sledovanie potenciálnych antibiofilmových vlastností biosurfaktantov (BS) izolovaných z kmeňa Bacillus amyloliquefaciens 3/22 voči tvorbe biofilmu indikátorového kmeňa Staphylococcus aureus CCM 4223. V práci bol sledovaný účinok BS 3/22 na rast biofilmu počas spoločnej inkubácie, inhibícia adhézie biofilm tvoriacich buniek a disperzia biofilmu. BS 3/22 inhibovali tvorbu biofilmu, pričom sa jeho tvorba s rastúcou koncentráciou BS signifikantne (p < 0,05; p < 0,01; p < 0,001) znižovala. BS 3/22 preukázali aj antiadhezívnu aktivitu, ktorá korelovala s použitou koncentráciou. Detegovaný bol taktiež disperzný efekt izolovaných BS 3/22 na 24-hodinový biofilm S. aureus CCM 4223. BS 3/22 boli pri disperzii biofilmu účinné aj pri nižších koncentráciách v porovnaní s antiadhezívnou aktivitou a inhibíciou tvorby biofilmu.

Klíčová slova:

biofilm – biosurfaktanty – inhibícia – disperzia

Úvod

Biosurfaktanty (BS) sú povrchovo aktívne amfifilné molekuly získavané z rôznych mikroorganizmov¹⁾. V oblasti medicíny majú potenciál využitia v boji proti agresívnym patogénom vďaka ich cytotoxickým, antimikrobiálnym, antiadhezívnym, či antibiofilmovým vlastnostiam²⁾. Baktérie patriace do rodu Bacillus sú osvedčenými producentmi lipopeptidov, veľkej skupiny BS, ktorých molekula pozostáva z aminokyselinového reťazca a rôznej dĺžky mastných kyselín³⁾. Lipopeptidy produkované kmeňmi Bacillus možno kategorizovať do rodín surfaktínu, iturínu a fengycínu s dobre definovanou všeobecnou štruktúrou⁴⁾.

Biofilm je spoločenstvo mikroorganizmov adherujúce na rôzne povrchy uložené v matrici zloženej z extracelulárnych polymérnych látok. Prítomnosť biofilmov môže spôsobiť vážne problémy v oblasti zdravia ľudí. Biofilmy môžu viesť k rozvinutiu infekcií u pacientov s medicínskymi pomôckami, ako sú močové, endotracheálne, intravenózne a iné typy katétrov a implantátov zavedených u viac ako 25 % hospitalizovaných pacientov⁵⁾. V súčasnej dobe pretrváva problém s rezistenciou biofilmov na bežné antibiotiká a dezinfekčné prostriedky z dôvodu ich špecifických rastových podmienok a transformácie rezistentných génov⁶⁾. Významným patogénom tvoriacim biofilmy je aj Staphylococcus aureus. MSSA (meticilín-senzitívny S. aureus) aj MRSA (meticilín-rezistentný S. aureus) sú mimoriadne úspešné a adaptabilné patogény spôsobujúce závažné nozokomiálne infekcie⁷⁾. Preto sa biosurfaktanty dostávajú do popredia ako zaujímavé natívne antibiofilmové zlúčeniny vďaka svojej povrchovej aktivite a antimikrobiálnym vlastnostiam^{8, 9)}.

Práca poukazuje na potenciálnu inhibičnú aktivitu lipopeptidových biosurfaktantov produkovaných kmeňom Bacillus amyloliquefaciens 3/22 voči adhézii a tvorbe biofilmu u Staphylococcus aureus CCM 4223.

Experimentálna časť

Materiál a metodika

Mikroorganizmy

Na produkciu biosurfaktantov bol použitý kmeň Bacillus amyloliquefaciens 3/22 izolovaný zo vzorky morských rias z Jadranského mora, identifikovaný pomocou sekvenčnej metódy 16S rRNA¹⁰⁾. Získané BS boli identifikované genotypicky ako lipopeptidy surfaktín, iturín a fengycín¹¹⁾. Ako indikátorový kmeň tvoriaci biofilm bol použitý Staphylococcus aureus CCM 4223 (Česká sbírka mikroorganismů, Brno, Česká republika).

Izolácia biosurfaktantov z B. amyloliquefaciens 3/22

Povrchovo aktívne BS boli izolované použitím modifikovanej metódy podľa Płaza et al.¹²⁾. 300 ml McKeen média bolo naočkovaných 3 % (v/v) štartovacej kultúry B. amyloliquefaciens 3/22 kultivovanej v BHI bujóne počas 18 hodín pri teplote 27 °C. Inokulované médium bolo potom inkubované 72 hodín pri 27 °C a 140 ot./min. (Shaker SKO-D XL, ARGOlab, Carpi, Taliansko). Po kultivácii sa bakteriálna kultúra centrifugovala (4754 g/65 min/4 °C) a supernatant sa okyslil pomocou 6 M HCl na pH 2. Precipitát vytvorený pri 4 °C počas noci sa znovu centrifugoval (4754 g/55 min/4 °C) a sediment bol rozpustený v 100 ml destilovanej vody. pH všetkých vzoriek bolo upravené pomocou 1 M NaOH na hodnotu 7. BS boli extrahované vytrepaním do organickej fázy v sústave pozostávajúcej z etylacetátu a metanolu v pomere 4 : 1 (v/v). Organické vrstvy boli spojené a vysušené síranom sodným. Po filtrácii bolo organické rozpúšťadlo odparené (IKA RV 10 Digital, IKA, Nemecko). Žltý olejovitý produkt sa na záver lyofilizoval a uskladnil pri –20 °C.

Antibiofilmová aktivita biosurfaktantov izolovaných z kmeňaB. amyloliquefaciens 3/22 počas ko-kultivácie

Jamky polystyrénovej mikrotitračnej platničky (Greiner ELISA 8 Well Strips, 350 μl, Flat Bottom, Medium Binding; Cruinn Diagnostics Ltd., Dublin, Írsko) boli naplnené 100 μl BHI média (mBHI; Brain Heart infusion broth; HIMEDIA) obohateného o 1 % glukózu a 2 % NaCl a obsahujúceho BS 3/22 s koncentráciami 30 – 0,058 mg/ml (dvojkové riedenie). Médium bolo naočkované indikátorovým kmeňom S. aureus CCM 4223 (McFarland 1; 15 μl na jednu jamku). Negatívnou kontrolou bolo mBHI s fyziologickým roztokom, resp. mBHI s príslušnými koncentráciami BS 3/22. Ako pozitívna kontrola slúžilo mBHI s indikátorovým kmeňom bez BS 3/22. Platničky boli inkubované pri 37 °C 24 hodín.

Tvorba biofilmu bola stanovená pomocou modifikovaného testu s kryštálovou violeťou¹³⁾. Supernatant bol z jamiek odstránený, jamky boli trikrát premyté deionizovanou vodou a sušené 40 minút pri izbovej teplote. Po vysušení sa jamky zafarbili 200 μl 0,1 % roztoku kryštálovej violeti a nechali sa inkubovať 30 minút pri izbovej teplote. Potom sa prebytočné farbivo odstránilo a jamky sa trikrát premyli deionizovanou vodou a nechali sa znova sušiť 30 minút pri izbovej teplote.

Kryštálová violeť naviazaná na adherujúce bunky (biofilm) bola extrahovaná 200 μl 30 % kyseliny octovej. Z každej jamky bolo prenesených 150 μl do novej platničky. Optická denzita bola meraná pomocou Synergy 4 Multi-Mode Microplate Reader (BioTek Instruments Inc., USA) pri vlnovej dĺžke 550 nm. Pokus bol uskutočnený trikrát a výsledky sú prezentované ako priemer ± smerodajná odchýlka. Percento inhibície bolo vypočítané ako % inhibície = [1–(ABS/A0)] x 100, kde A_BS predstavuje absorbanciu jamky s BS a A₀ absorbanciu kontrolnej jamky.

Antiadhezívna aktivita biosurfaktantov izolovaných z kmeňa B. amyloliquefaciens 3/22

Na testovanie antiadhezívnej aktivity BS 3/22 bola použitá metodika podľa Madhu a Prapulla¹⁴⁾ s nasledovnými modifikáciami: jamky polystyrénovej mikrotitračnej platničky (Greiner ELISA 8 Well Strips, 350 μl, flat bottom, medium binding) boli naplnené 100 μl BS v PBS s koncentráciami 30 – 1,8 mg/ml (dvojkové riedenie) a inkubované 18 hodín pri 4 °C za účelom opracovania jamiek biosurfaktantom. Po inkubácii boli jamky premyté PBS a vysušené. Následne boli naplnené 100 μl mBHI naočkovaného indikátorovým kmeňom S. aureus CCM 4223 (1 % inokulum). Ako pozitívna kontrola bol použitý S. aureus CCM 4223 v jamkách neopracovaných BS a ako negatívna kontrola čisté mBHI médium bez pridania indikátorového kmeňa v jamkách opracovaných BS. Platničky boli inkubované 4 hodiny pri 37 °C. Po inkubácii sa kvantifikácia adhézie uskutočnila pomocou modifikovanej metodiky s využitím kryštálovej violete, ako je opísané vyššie. Pokus sa uskutočnil v troch nezávislých pokusoch a výsledky sú uvedené ako priemer ± smerodajná odchýlka. Percento antiadhezívnej aktivity bolo vypočítané obdobne ako percento inhibície tvorby biofilmu.

Disperzná aktivita biosurfaktantov izolovaných z kmeňa B. amyloliquefaciens 3/22

Disperzná aktivita BS 3/22 bola testovaná metódu podľa e Silva et al.¹⁵⁾ s nasledovnou modifikáciou: jamky polystyrénovej mikrotitračnej platničky (Greiner ELISA 8 Well Strips, 350 μl, flat bottom, medium binding) boli naplnené 100 μl mBHI naočkovaného indikátorovým kmeňom S. aureus CCM 4223 (1 % inokulum). Platnička bola inkubovaná pri 37 °C 24 hodín za účelom vytvorenia biofimu S. aureus CCM 4223. Po inkubácii sa jamky premyli roztokom PBS. Po vysušení boli jamky polystyrénovej mikrotitračnej naplnené 100 μl BS v PBS s koncentráciami 30 – 0,06 mg/ml (dvojkové riedenie) a inkubované pri 37 °C 24 hodín za účelom disperzie biofimu S. aureus CCM 4223. Pozitívnou kontrolou boli jamky s vytvoreným biofilmom opracované len PBS a negatívnou kontrolou boli jamky opracované roztokom BS bez predvytvoreného biofilmu. Po inkubácii sa kvantifikácia adhézie znova uskutočnila pomocou modifikovanej metodiky s využitím kryštálovej violete. Pokus sa uskutočnil v troch nezávislých pokusoch a výsledky sú uvedené ako priemer ± smerodajná odchýlka. Percento disperzie bolo vypočítané obdobne ako percento inhibície tvorby biofilmu.

Štatistické vyhodnotenie

Pre vyhodnotenie výsledkov bola použitá jednorozmerná analýza rozptylu (ANOVA) s doplnkovým Dunnettovým testom v štatistickom programe GraphPad Prism 6.01 software (GraphPad Inc., San Diego, CA, USA).

Výsledky

Antibiofilmová aktivita biosurfaktantov izolovaných z kmeňa B. amyloliquefaciens 3/22 počas ko-kultivácie

BS mali inhibičný efekt na tvorbu biofilmu u testovaného indikátorového kmeňa S. aureus CCM 4223 (obr. 1). Jeho tvorba sa signifikantne znižovala (p < 0,05; p < 0,01; p < 0,001) v závislosti od zvyšujúcej sa koncentrácie 0,47 – 30 mg/ml BS 3/22. Koncentrácie nižšie ako 0,47 mg/ml nemali inhibičný efekt na tvorbu biofilmu. Najvyššie percento inhibície tvorby biofilmu (viac ako 89 %) bolo dosiahnuté pri koncentrácii 30 mg/ml BS 3/22 (tab. 1). Koncentrácie BS 3/22 od 15 do 3,75 mg/ml inhibovali tvorbu biofilmu viac ako 50 %. Percento inhibície tvorby biofilmu menej ako 50 % bolo pozorované pri koncentráciách BS 3/22 od 1,87 do 0,47 mg/ml.

Antiadhezívna aktivita biosurfaktantov izolovaných z kmeňa B. amyloliquefaciens 3/22

Antiadhezívny efekt BS 3/22 koreloval s jeho koncentráciou (obr. 2). Po opracovaní jamiek s koncentráciami BS 3/22 30 – 15 – 7,5 mg/ml bolo zistené signifikantné zníženie (p < 0,001; p < 0,01; p < 0,05) schopnosti indikátorového kmeňa S. aureus CCM 4223 adherovať na steny jamiek v porovnaní s kontrolou (S. aureus CCM 4223 bez opracovania jamiek BS 3/22). Ostatné testované koncentrácie (3,75 a 1,87 mg/ml) neovplyvňovali adhéziu indikátorového kmeňa. Viac ako 50% inhibícia adhézie bola pozorovaná pri najvyššej testovanej koncentrácii BS 3/22 (tab. 2). Koncentrácie BS 3/22 nižšie ako 30 mg/ml inhibovali adhéziu S. aureus CCM 4223 menej ako 50 %.

Disperzná aktivita biosurfaktantov izolovaných z kmeňa B. amyloliquefaciens 3/22

Ďalej bola testovaná schopnosť BS 3/22 redukovať (odlupovať) 24-hodinový predvytvorený biofilm S. aureus CCM 4223. Disperzný efekt BS 3/22 znova koreloval s jeho koncentráciou (obr. 3). Bola detegovaná signifikantná redukcia (p < 0,001; p < 0,05) predvytvotreného 24-hodinového biofilmu indikátorového kmeňa v porovnaní s kontrolou (predvytvorený 24-hodinový biofilm S. aureus CCM 4223 bez opracovania BS 3/22) pri koncentráciách od 30 – 0,11 mg/ml. BS 3/22 bol pri disperzii biofilmu S. aureus CCM 4223 účinný aj pri nižších koncentráciách v porovnaní s antiadhezívnou aktivitou, resp. inhibíciou tvorby biofilmu. Vysoké percento disperzie biofilmu (78 a viac %) bolo pozorované pri koncentráciách BS 3/22 od 30 do 3,75 mg/ml (tab. 3). Nižšie koncentrácie BS 3/22 stále účinne rozrušovali biofilm – percento disperzie sa postupne znižovalo v závislosti od koncentrácie BS 3/22 od 63 do 11,5 %.

Diskusia

Kmene patriace do rodu Bacillus sú bohatými zdrojmi biologicky aktívnych látok. Medzi ne radíme aj biosurfaktanty, povrchovo aktívne látky so širokým potenciálom využitia v boji proti patogénnym mikroorganizmom. Lipopeptidy a glykolipidy sú najbežnejšie uvádzanými triedami BS s antimikrobiálnou aj antibiofilmovou aktivitou¹⁶⁾. Z rodiny lipopeptidov sú najznámejšie polymyxín A a polymyxín B produkované Bacillus polymyxa¹⁷⁾; surfaktín, iturín, fengycín, mykosubtilíny a bacillomycíny produkované Bacillus subtilis¹⁸⁾; pumilacidín produkovaný Bacillus pumilus¹⁹⁾; lichenyzín z Bacillus licheniformis²⁰⁾; a viskozín z Pseudomonas fluorescens²¹⁾. Pokiaľ ide o glykolipidy, najlepšie sú preštudované rhamnolipidy z Pseudomonas aeruginosa²²⁾, soforolipidy z Candida bombicola²³⁾ a manozylerytritolové lipidy z Candida antarctica²⁴⁾.

Antibiofilmová aktivita izolovaných BS 3/22 voči biofilmu S. aureus CCM 4223 sa v tejto práci hodnotila tromi rôznymi spôsobmi: spoločnou inkubáciou, inhibíciou adhézie a disperzie biofilmu. Percento inhibície biofilmu bolo vzhľadom na kontrolu pri jednotlivých testoch odlišné. Ko-kultivačný test bol najefektívnejší, pretože pri použití 30 mg/ml BS 3/22 sa znížila tvorba biofilmu o viac ako 89 %. Percento inhibície sa s klesajúcou koncentráciou BS 3/22 znižovalo a pri koncentrácii nižšej ako 0,4 mg/ml inhibičný efekt nebol zaznamenaný. Inhibícia rastu S. aureus CCM 4223 v prítomnosti izolovaných BS 3/22 pri koncentráciách 30 – 7,5 mg/ml nebola zistená. Preto tento účinok pravdepodobne nesúvisí s antimikrobiálnou aktivitou. Podobné výsledky zistili aj Abdelli et al.²⁵⁾, kedy surfaktín získaný z kmeňna Bacillus safensis F4 v koncentráciách 5 a 10 mg/ml významne obmedzoval tvorbu biofilmu Staphylococcus epidermidis S61 s percentami inhibície 80 – 90 %. Zmes lipopeptidov (surfaktín, iturín a fengycín) izolovaných z B. subtilis preukázala dôležité antibiofilmové a antiadhezívne účinky na uropatogénne baktérie²⁶⁾. Liu et al.²⁷⁾ preukázali, že v podmienkach spoločnej inkubácie surfaktín produkovaný kmeňom Bacillus subtilis silne ovplyvňoval adhéziu S. aureus na niekoľkých materiáloch (sklo, polystyrén a nehrdzavejúca oceľ) a významne podporoval uvoľňovanie biofilmu.

Test na zistenie antiadhezívnej aktivity BS 3/22 odhalil, že najvyššia inhibícia adhézie 50,3 % bola dosiahnutá pri opracovaní povrchu BS 3/22 s koncentráciou 30 mg/ml. To naznačuje, že BS sú schopné modifikovať fyzikálno-chemické vlastnosti povrchu, čím znižujú adhéziu a inhibujú tvorbu biofilmu. Okrem toho BS menia hydrofóbnosť bakteriálneho povrchu a v dôsledku toho menia mechanizmus adhézie mikroorganizmov. Ich účinky závisia od počiatočnej bakteriálnej hydrofóbnosti, ako aj od typu BS a ich koncentrácie, ktorá môže zvyšovať alebo znižovať hydrofóbnosť bakteriálneho povrchu v dôsledku toho, že je viac alebo menej hydrofóbna28). Antiadhezívna aktivita BS už bola opísaná v predchádzajúcich prácach, napríklad Janek et al.²⁹⁾ prezentujú schopnosť pseudofaktínu II (0,5 mg/ml), cyklického lipopeptidu, brániť tvorbe biofilmu Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae, Staphylococcus epidermidis, Proteus mirabilis a Candida albicans na polystyrénovom povrchu. De Araujo et al.³⁰⁾ zistili, že surfaktín pri 0,50 % (w/v) významne znížil adhéziu Listeria monocytogenes na polystyrénový povrch, keď sa použil pri vyšších koncentráciách, pričom dosiahol hodnoty až 54 % inhibície. Giri et al.³¹⁾ skúmali antibiofilmový potenciál lipopeptidov produkovaných B. subtilis VSG4 a B. licheniformis VS16 proti S. aureus, Salmonella Typhimurium a Bacillus cereus. Prvotné opracovanie mikrotitračných doštičiek biosurfaktantmi významne inhibovalo tvorbu biofilmu a podporovalo eradikáciu biofilmu s percentom redukcie pri najvyššej testovanej koncentrácii (5 mg/ml) 65 – 82 %, resp. 61 – 76 %. Účinok surfaktínu na adhéziu a tvorbu biofilmu hodnotili aj de Araujo et al.³²⁾, kedy BS významne znížili adhéziu Pseudomonas fluorescens ATCC13525 na polystyrénové povrchy (54 % inhibícia) a tvorbu biofilmu (73 %) na povrchu z nehrdzavejúcej ocele.

V práci sme BS 3/22 použili taktiež na rozrušenie už existujúceho biofilmu, pričom bola dosiahnutá viac ako 88 % disperzia pri najvyššej použitej koncentrácii BS 3/22 (30 mg/ml). Percento disperzie zostalo na úrovni 83 % pri ošetrení biofilmu koncentráciami medzi 15 a 3,7 mg/ml. Pri nižších koncentráciách úmerne klesala aj účinnosť disperzie biofilmu. Zistené výsledky sú v zhode so zisteniami iných autorov^{6, 31, 32)}. Surfaktín izolovaný z B. amyloliquefaciens NS6 preukázal disperznú aktivitu voči vytvorenému biofilmu Streptococcus mutans, kedy pri najvyššej koncentrácii 80 mg/ml bolo percento disperzie 62,2 ± 7,1 %6). Meena et al.³²⁾ udávajú, že biofilmy patogénnych bakteriálnych kmeňov S. aureus ATCC 6538, Pseudomonas sp., Klebsiella pneumoniae, E. coli NCTC 10418, Salmonella Typhi a S. Typhimurium NCTC74 boli po ošetrení surfaktínom izolovaným z B. subtilis KLP2015 (100 μg/ml) znížené o 58,10 %, 47,86 %, 14,83 %, 13,91 %, 11,01 % a 10,23 %. Lipopeptidy izolované z kmeňov B. subtilis VSG4 a B. licheniformis VS16 s najvyššou použitou koncentráciou 5 mg/ml eradikovali vytvorený biofilm kmeňov S. aureus ATCC 11778, E. coli MTCC65 a S. Typhimurium ATCC1943031). Disperzia biofilmu bola pravdepodobne vyvolaná odstránením extracelulárnych polymérnych látok (EPS) a deštrukciou mikrokolónií spôsobenou BS33). EPS zohrávajú dôležitú úlohu v rezistencii biofilmu, pretože bránia kontaktu mikroorganizmov s antimikrobiálnou látkou³⁴⁾.

Záver

Predkladaná práca dokazuje, že biosurfaktanty izolované z kmeňa B. amyloliquefaciens 3/22 majú potenciál inhibovať nielen tvorbu biofilmu S. aureus v ich prítomnosti, ale majú taktiež schopnosť brániť adhézii biofilm-tvoriacich buniek a dokážu aj rozrušiť vytvorený biofilm. Tieto výsledky naznačujú, že získané bioaktívne látky je možné využiť ako potenciálne antibiofilmové agens v boji proti patogénnym kmeňom S. aureus v biomedicínskej oblasti. Je potrebné ďalej preskúmať podrobnosti o aktivite izolovaných biosurfaktantov v podmienkach in vivo.

Práca vznikla za podpory Agentúry na podporu výskumu a vývoja na základe zmluvy č. APVV-15-0377 a č. APVV-16-0203 a projektu Ministerstva školstva, vedy, výskumu a športu Slovenskej republiky VEGA 1/0081/17.

Stret záujmov: žiadny.

PharmDr. Karolína Englerová • R. Nemcová
Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach
Komenského 73, 041 81 Košice, Slovenská republika
e-mail: karolina.englerova@gmail.com
Z. Bedlovičová
Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach
Katedra chémie, biochémie a biofyziky
E. Styková
Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach
Klinika koní