Stanovenie vareniklínu v lieku Champix^® dvojdimenzionálnou kapilárnou elektroforézou v spojení s UV detekciou

Souhrn

Práca sa zaoberá vývojom analytickej metódy na báze dvojdimenzionálnej kapilárnej elektroforézy (spojenie CITP-CZE) s jednoduchou UV-detekciou pre stanovenie vysokoúčinného farmaka – vareniklínu s možnosťou spojenia vypracovanej metódy s pokročilou detekčnou koncovkou – hmotnostným spektrometrom. Na základe takto koncipovaných požiadaviek boli zvolené optimálne elektrolytové systémy pre CITP (LE = 10 mM NH₄Ac + 5 mM HAc + 0,05% m-HEC; TE = 10 mM HAc) a CZE (BGE = 20 mM HAc) separáciu vareniklínu. Detekcia bola uskutočnená pri vlnovej dĺžke 237 nm. Uvedené spojenie umožnilo rýchle a efektívne hodnotenie vareniklínu v jeho tabletovej liekovej forme s medzou dôkazu (LOD) na úrovni 5,92 ng/ml.

Kľúčové slová:
nikotín, vareniklín, dvojdimenzionálna kapilárna elektroforéza, liekové formy, farmácia

Úvod

Vstup tabaku do civilizovaného sveta koncom 15. storočia znamenal i vzostup kultúry fajčenia. Fajčenie tabaku sa stalo spoločnosťou akceptovanou závislosťou a v súčasnosti patrí medzi jeden z hlavných predispozičných faktorov, ktoré výrazne zhoršujú zdravie obyvateľstva a sú zodpovedné za jeho zvýšenú morbiditu a mortalitu, a to najmä z hľadiska ochorení ako sú rakovina pľúc, chronická bronchitída alebo ischemická choroba srdca¹⁾. Hlavnou obsahovou látkou v tabaku, ktorá zodpovedá za jeho účinky je nikotín – alkaloid odvodený od kyseliny nikotínovej²⁾. V organizme sa viaže na nikotínové receptory, a tak sa zúčastňuje cholinergnej transmisie. V nízkych dávkach pôsobí nikotín stimulačne, vo vyšších vyvoláva útlm parasympatikového nervstva. Na nikotín vzniká psychická i fyzická závislosť³⁾.

Odvykanie od fajčenia a liečba nikotínovej závislosti je veľmi náročný proces a veľa fajčiarov svoj cieľ nenaplní. Je možné ju uskutočniť aj farmakologicky. V praxi uplatnenie našla náhradná nikotínová terapia, kedy sa nikotín v odstupňovaných dávkach aplikuje vo forme liečivej žuvačky, pastilky alebo náplasti. Liečivo amfebutamón (bupropion) s antidepresívnym účinkom zvyšuje schopnosť pacientov abstinovať. Mechanizmus tohto účinku nie je známy, ale predpokladá sa zásah do dopaminergnej transmisie v mezolimbickom systéme⁴⁾. V prípade liečby nikotínovej závislosti sa uvažuje i o použití tricyklického antidepresíva nortriptilínu alebo centrálneho antihypertenzíva klonidínu⁵⁾. Perspektívu vo farmakoterapii nikotínovej závislosti predstavuje i liečivo vyvinuté cielene pre tento účel – vareniklín.

Liečivo vareniklín je odvodené od alkaloidu cytizínu⁷⁾ získavaného z Cytisus laburnum L. (Fabaceae), ktorý pôsobí ako agonista na nikotínových cholinergných receptoroch. Vareniklín (8,9,10-tetrahydro-6,10-metano--6H-pyrazino[2,3-h][3]benzazepín) vo forme soli s tartarátom (obr.1) bol schválený pre terapiu nikotínovej závislosti a v roku 2006 registrovaný americkou FDA pod ochranným názvom Chantix, v Európe bol registrovaný úradom EMA pod ochranným názvom Champix⁸⁾. Vareniklín pôsobí ako parciálny agonista α4β2 nikotínových acetylcholínových receptorov situovaných vo ventrálnej tegmentálnej oblasti mozgu. Obsadenie α4β2 receptorov spôsobí ich čiastočnú aktiváciu a spúšťa sled biochemických procesov, ktoré vedú k čiastočnej stimulácii dopaminergnej transmisie v mezolimbickom systéme. Samotnému dopamínu a dopaminergnej transmisii v tejto časti mozgu je prisudzovaná hlavná úloha a zodpovednosť za určitý pocit odmeny, blaha a slasti u fajčiara po vyfajčení cigarety⁹⁾.

S vareniklínom ako vysokoúčinným liečivom je spojené i riziko vzniku závažných nežiaducich účinkov, ktoré sú charakterizované zmenami v správaní a/alebo myslení, depresiami, agresívnym správaním, nestabilitou nálady, suicídnymi myšlienkami a dokonca i pokusmi o samovraždu. Z tohto dôvodu je potrebné dôkladné sledovanie pacientov v priebehu ich odvykacej liečby. V takýchto prípadoch sa nápomocnými na klinických pracoviskách stávajú separačné analytické metódy umožňujúce rýchle monitorovanie hladín liečiv v biologických tekutinách. Okrem biomedicínskej aplikácie je možné dané analytické metódy implementovať i do prostredia samotnej výroby a prípravy liečiv a liekov, kde efektívny proces separácie v kombinácii s vhodnou detekčnou technikou prispieva k zabezpečovaniu ich najvyššej akosti. Dominantnými sa vo farmaceutickej oblasti stali chromatografické metódy, a to na základe ich jednoduchosti a kváziuniverzality. Podnetnými a v súčasnosti stále viac sa rozvíjajúcimi sú elektromigračné metódy v kapilárnom prevedení – najmä kapilárna elektroforéza (CE), ktorá sa v spojení s vysokocitlivými a selektívnymi detekčnými technikami môže stať alternantívou k bežným konvenčným chromatografickým systémom.

Na hodnotenie liečiva vareniklínu a jeho nečistôt v liekovej forme tabliet boli použité viaceré analytické metódy, predovšetkým však chromatografické^10–16). Technikami HPLC a RP-HPLC v spojení s UV-detekciou boli dosiahnuté medze dôkazu (LOD) na úrovni 0,003 μg/ml¹¹⁾; 0,11 μg/ml¹²⁾; resp. 0,31 μg/ml¹³⁾. LC v spojení s tandemovou hmotnostnou spektrometriou (MS/MS) bola zase použitá pre stanovenie vareniklínu v ľudskej plazme a liekovej forme, pričom vypracovaná metóda poskytovala LOD 6,0 ng/ml¹⁵⁾. Rovnaké spojenie bolo použité i pri bioekvivalenčnej štúdii dvoch komerčných prípravkov s obsahom vareniklínu v krvnej plazme¹⁶⁾. Popísané bolo i spojenie CE s DAD detekciou pre stanovenie obsahu vareniklínu v tabletách, pričom medza dôkazu sa pohybovala na úrovni 0,2 μg/ml¹⁷⁾. Aleksic a kol.¹⁸⁾ použili voltametrické techniky pre stanovenie vareniklínu v roztokoch a vzorkách plazmy.

Z uvedených faktov z odbornej literatúry vyplýva, že okrem jedného prípadu¹¹⁾ doteraz nebola prezentovaná taká analytická metóda, ktorou by bez použitia vysokocitlivej detekčnej techniky bolo možné dosiahnuť mimoriadne nízke (jednotky ng/ml a nižšie) LOD pre vareniklín. Perspektívnou sa v tomto ohľade stáva dvojdimenzionálna (2D) CE kombinujúca v sebe techniky kapilárnej izotachoforézy (CITP) a kapilárnej zónovej elektroforézy (CZE). Použitie CITP ako predseparačnej techniky umožňuje zvýšenie dávkovaného množstva do elektroforetického analyzátora až na 30 μl, odstránenie nežiaducich makrokomponentov matrice a z toho vyplývajúce prečistenie a predúpravu vzorky. CZE v ďalšom kroku plní vlastnú analytickú úlohu s prepojením na vhodnú detekčnú koncovku. Takéto 2D usporiadanie umožňuje niekoľkonásobné zníženie medze dôkazu, a to už pri použití jednoduchej UV detekcie v porovnaní s CZE v jednokolónovom usporiadaní. Naviac významne zvyšuje separačné možnosti (separačnú selektivitu) v porovnaní s jednokolónovou ITP¹⁹⁾. Preto cieľom našej práce bolo vyvinúť CITP-CZE metódu pre ultrastopové stanovenie vareniklínu. Z dôvodu zvýšenia aplikačného potenciálu navrhnutej metódy bolo vybrané kritérium jej kompatibility nielen s UV absorpčnými detektormi, ale aj s detektormi na báze hmotnostnej spektrometrie, ktoré vďaka ich priamej identifikačnej schopnosti patria ku kľúčovým detekčným systémom súčasnosti. Toto kritérium bolo zohľadnené pri optimalizácii separačných podmienok pre CITP-CZE.

Pokusná časť

Inštrumentácia

Na prevedenie experimentálnej práce bol použitý elektroforetický analyzátor EA 102 (Villa Labeco, Spišská Nová Ves, Slovensko) v dvojkolónovom usporiadaní umožňujúcom CITP-CZE analýzu. CITP separačnú jednotku tvorila polytetrafluóretylénová kapilára s vnútorným priemerom 800 μm a dĺžkou 90 mm umiestnená v bloku so zabudovaným vodivostným detektorom. CZE separačná jednotka pozostávala z polytetrafluóretylénovej kapiláry s vnútorným priemerom 300 μm a dĺžkou 90 mm umiestnenej v bloku so zabudovaným vodivostným detektorom a UV koncovkou. Vzorka bola do analyzátora dávkovaná prostredníctvom dávkovacieho bloku so zabudovanou 30 μl vnútornou slučkou.

K analyzátoru bol prostredníctvom UV koncovky CZE bloku a optických vláken (J & M, Aalen, Nemecko) pripojený UV detektor (ECOM, Praha, Česká republika), ktorý bol nastavený na konštantnú vlnovú dĺžku (237 nm) zodpovedajúcu absorpčnému maximu analyzovanej látky. Údaje získavané z analyzátora boli zaznamenávané a vyhodnocované prostredníctvom softvérového programu Aces (Prírodovedecká fakulta UK, Bratislava, Slovensko).

Chemikálie a vzorky

Na prípravu roztokov elektrolytových systémov, ktoré boli volené tak, aby boli kompatibilné súčasne i s MS detekciou, sa použili octan amónny (NH₄Ac), mravčan amónny (NH₄Fo), kyselina octová (HAc) a kyselina mravčia (HFo) (Sigma Aldrich, Steinheim, Nemecko). Všetky uvedené chemikálie mali požadovanú p.a. analytickú čistotu. Elektrolytové systémy boli pripravené rozpustením uvedených chemikálií v demineralizovanej vode pripravenej pomocou deionizačného systému Millipore Simplicity 185 (Lambda Life, Bratislava, Slovensko). Roztoky elektrolytov boli pred ich použitím filtrované membránovými filtrami s veľkosťou pórov 0,45 μm (Millipore, Molsheim, Francúzsko). Referenčný štandard vareniklín tartarát s deklarovanou čistotou ≥ 98% bol získaný z firmy Sigma Aldrich (Steinheim, Nemecko). V prípade CITP separačného kroku bola do vodiaceho elektrolytu (LE) pridávaná metyl-hydroxyetylcelulóza (m-HEC) s koncentráciou 0,05% (w/v) (Fluka, Buchs, Švajčiarsko). Lieková forma (tablety Champix^®) s obsahom vareniklínu (výrobcom deklarovaný obsah 1 mg v jednej tablete) bola získaná z miestnej lekárne.

Príprava roztokov štandardov a vzoriek

Základný roztok štandardu vareniklínu sme pripravili rozpustením 5 mg štandardu v 10 ml demineralizovanej vody. Pracovné roztoky štandardov o požadovanej koncentrácii (koncentračný rozsah 20–500 ng/ml) sme pripravili riedením základného roztoku štandardu demineralizovanou vodou.

Pri príprave vzorky liekovej formy sme jednotlivo odvážili hmotnosť piatich tabliet lieku Champix^® a následne sme vypočítali priemernú hmotnosť jednej tablety (0,2092 g). Odvážené tablety sme rozpráškovali v trecej miske. Z takto homogenizovanej vzorky sme do 100 ml odmernej banky navážili hmotnosť zodpovedajúcu priemernej hmotnosti jednej tablety lieku Champix^®, ktorú sme doplnili po rysku demineralizovanou vodou a 10 minút mechanicky pretrepávali. Roztok vzorky sme potom počas 20 minút nechali v ultrazvukovom kúpeli, následne sme takto upravený roztok riedili demineralizovanou vodou tak, aby koncentrácia analytu zodpovedala úrovni 100 ng/ml a pred analýzou filtrovali membránovými filtrami s veľkosťou pórov 0,45 μm.

Príprava vzoriek pre hodnotenie výťažnosti

Pre hodnotenie výťažnosti sme do roztoku reálnej matrice so zodpovedajúcou koncentráciou analytu 100 ng/ml pridávali štandardný prídavok vareniklínu. Pripravili sme tri vzorky s koncentráciami pridaného roztoku štandardu vareniklínu na úrovni 20, 100 a 500 ng/ml a jednu vzorku bez prídavku štandardu. Všetky vzorky boli následne mechanicky pretrepávané počas 10 minút a pred vlastnou analýzou filtrované cez membránové filtre s veľkosťou pórov 0,45 μm.

Výsledky a diskusia

Optimalizácia separačných podmienok pre CITP-CZE experiment

Optimalizácia separačných podmienok v sebe zahŕňa voľbu elektrolytových systémov pre CITP a CZE a súčasne i nastavenie hodnôt vodiaceho prúdu pre jednotlivé kroky. Zloženie elektrolytov a veľkosť aplikovaných prúdov sú volené zo zreteľom na rýchlosť a účinnosť analýzy, minimalizáciu tepelných a elektromigračných disperzných procesov a kompatibilitu spájaných techník. Z pohľadu elektroforetickej separácie sme tak museli brať do úvahy vlastnosti jednotlivých kombinovaných techník (CITP, CZE), pričom optimalizácia separačných podmienok zohľadňovala i možnosť použitia CITP-CZE metódy v spojení s hmotnostnou detekciou (MS). V takomto prípade musela byť splnená podmienka prchavosti elektrolytových systémov. V našej práci sme testovali nasledovné elektrolytové systémy, ktorých zloženie je zhrnuté v tabuľke 1.

Z uvedených testovaných elektrolytových systémov sa ako optimálny ukázal CITP-CZE systém s nasledovným zložením: a) LE = 10 mM NH₄Ac + 5 mM HAc (pH 4,9), b) TE = 10 mM HAc (pH 3,1) a c) BGE = 20 mM HAc (pH 2,8). Súčasťou zvoleného vodiaceho elektrolytu bola i 0,05% m-HEC, ktorá zabezpečovala dynamické pokrytie CITP separačnej kapiláry, čím sa bránilo adhézii analytu na jej povrch a zároveň slúžila ako supresor elektroosmotického toku (EOF). Pre separáciu vareniklínu v CITP kroku sa ukázal byť vhodný vodiaci prúd 300 μA, v CZE kroku 40 μA. Takto zvolené separačné podmienky viedli k úspešnej separácii analytu z matríc testovaných vzoriek, a to s dostatočnou účinnosťou (N) v relatívne krátkom čase (viď Validácia metódy).

Validácia metódy

Validácia analytickej metódy predstavuje proces jej overovania, pri ktorom sa zisťuje vhodnosť zvolenej metódy pre daný zamýšľaný účel. Nami navrhnutú a optimalizovanú CITP-CZE metódu sme validovali na základe odporúčaní ICH smernice²⁰⁾. Hodnotené boli nasledovné parametre: linearita; presnosť (vyjadrená ako opakovateľnosť); medza dôkazu (LOD); medza stanovenia (LOQ); robustnosť; správnosť. Niektoré z uvedených validačných parametrov sú obsahom tabuľky 2.

Linearita navrhnutej CITP-CZE metódy bola hodnotená meraním piatich rôznych koncentrácií roztoku štandardu vareniklínu, a to v rozmedzí 20–500 ng/ml (obr. 2a). Každá z piatich vzoriek bola premeraná 6-krát, pričom s použitím nameraných výsledkov bola zostrojená kalibračná krivka vyjadrujúca závislosť plochy analytického signálu od koncentrácie {AU=f(c)}. Parametre kalibračnej krivky boli hodnotené s použitím softvérového programu Microsoft Excel 2007 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA). Rovnica kalibračnej krivky bola y = 26,39x–56,219, pričom hodnoty korelačného koeficientu (r) a koeficientu stanovenia (r²) hovoria o dobrej linearite kalibračnej krivky v zvolenom koncentračnom rozmedzí.

Medza dôkazu (LOD) ako najnižšia koncentrácia analyzovanej látky, ktorá je pri danej hladine spoľahlivosti ešte detegovateľná a medza stanovenia (LOQ) ako najnižšia koncentrácia analytu stanoviteľná s prijateľnou hodnotou presnosti boli vypočítané na základe stanovenia signálu slepej vzorky (demineralizovaná voda) pre desať meraní (n = 10). Z uvedených meraní bol určený priemerný signál slepej vzorky (x₀) a jeho smerodajná odchýlka (s), ktoré boli použité pri získaní veľkosti signálu detektora pre LOD {y(D)} a LOQ {y(Q)} na základe vzťahov: y(D) = x₀ + 3.s, resp. y(Q) = x₀ + 10.s. LOD a LOQ boli následne vypočítané z kalibračnej krivky. LOD na úrovni 5,92 ng/ml je približne na úrovni LOD, ktorý bol dosiahnutý s použitím HPLC v spojení s tandemovou hmotnostnou spektrometriou ako detekčnou koncovkou¹⁵⁾.

Presnosť vyjadrená ako opakovateľnosť bola určená ako relatívna štandardná odchýlka (RSD_plocha) plôch analytického signálu a migračných časov (RSD_tm) vzoriek s koncentráciou v rozsahu kalibračnej krivky, ktoré boli premerané šesťkrát (opakované meranie jednej koncentrácie roztoku štandardu). Dosiahnuté výsledky RSD hovoria o vhodne zoptimalizovanom analytickom systéme a jeho dobrej opakovateľnosti.

Robustnosť predstavuje mieru citlivosti a stability metódy voči malým zmenám v operačných parametroch. V našej práci sme pre test robustnosti menili koncentráciu základného (nosného) elektrolytu HAc v rozmedzí 18–22 mM. Zmena uvedeného parametra neviedla k výrazným zmenám v priebehu analýzy a k jej výsledkom a metóda bola osvedčená ako dostatočne robustná.

Správnosť CITP-CZE metódy sme hodnotili na základe výťažnosti, ktorá bola prevedená prostredníctvom štandardného prídavku roztoku štandardu vareniklínu o troch rôznych koncentráciách do roztoku matrice – tabletovej liekovej formy (viď časť Príprava vzoriek pre hodnotenie výťažnosti). Získané analytické signály (obr. 2b) zodpovedajúce fortifikovanej matrici boli konfrontované s matricou samotnou. Výťažnosť bola počítaná: výťažnosť (%) = {[c(prídavku v testovanej vzorke) – c(analytu v testovanej vzorke bez prídavku)] / c(prídavku v referenčnej vzorke)}.100. Získané výsledky indikujú akceptovateľnú správnosť použitej metódy.

Aplikácia CITP-CZE metódy vo farmácii pre hodnotenie kvality liečiv a liekov

Navrhnutú a validovanú CITP-CZE-UV metódu sme aplikovali pri hodnotení obsahu účinnej látky – vareniklínu v tabletovej liekovej forme Champix^® (obr. 3). Výrobca na náš farmaceutický trh dodáva liek s príslušným názvom v sile 1 mg (obsah liečiva v jednej tablete). Priemerný obsah vareniklínu v danej liekovej forme sa pohyboval na úrovni 1,008 mg, pričom RSD zo šiestich paralelných meraní bola 1,84 %. Výrobcom deklarovaný obsah je v zhode s nami dosiahnutými výsledkami, na základe čoho možno potvrdiť jednak kvalitu hodnoteného lieku a na strane druhej vhodnosť vypracovanej 2D-CE metódy pre tento účel.

Záver

Cieľom práce bolo navrhnutie, vypracovanie a validácia 2D-CE metódy s jednoduchou UV detekciou pre možnosti stanovenia obsahu liečiva vareniklínu v tabletovej liekovej forme dostupnej na európskom trhu s liekmi. Optimalizovaná CITP-CZE-UV metóda s použitím jednoduchých elektrolytových systémov bola validovaná s dobrou linearitou v rozsahu koncentrácií 20–500 ng/ml. Úplná separácia sa dosiahla v čase kratšom ako 10 minút. 2D-CE v spojení s UV detekciou tak predstavuje rýchlu a najmä lacnú analytickú metódu, ktorá sa na základe validačného procesu vyznačuje i vysokou účinnosťou, robustnosťou a citlivosťou. Zo získaných výsledkov vyplýva, že CITP-CZE je vhodnou alternatívnou a/alebo komplementárnou metódou v porovnaní s HPLC, ktorú predčuje najmä v jednoduchosti, ekologickosti, nákladoch na analýzu a separačnej účinnosti. Z pohľadu farmaceutického priemyslu a praxe tak do budúcnosti môže znamenať perspektívny prístup k hodnoteniu kvality liečiv a liekov, štúdiu ich farmakokinetiky a degradácie. Jednoduchosť použitých prchavých elektrolytových systémov 2D-CE zároveň vytvára reálny predpoklad pre jej on-line spojenie s MS detekciou, ktoré by z pohľadu vareniklínu mohlo viesť k efektívnemu hodnoteniu liečiva samotného, avšak i k detailnému popisu profilu nečistôt obsiahnutých v liečive, resp. jeho degradačných produktov.

Poďakovanie

Autori ďakujú PharmDr. Michalovi Piešťanskému za darovanie lieku Champix^®.

Stret záujmov: žiadny.

Došlo 15. oktobra 2013

Prijato 30. októbra 2013

PharmDr. Juraj Piešťanský (∗) • K. Maráková • L. Veizerová • J. Galba • P. Mikuš

Katedra farmaceutickej analýzy a nukleárnej farmácie FaF UK

Odbojárov 10, 832 32 Bratislava, Slovenská republika

e-mail: piestansky@fpharm.uniba.sk