Michael Stuart Brown (1941–) a Joseph Leonard Goldstein (1940–)

V roce 1985 získali Nobelovu cenu za fyziologii nebo lékařství dva američtí genetici a internisté Michael Stuart Brown (na fotografii vlevo) a Joseph Leonard Goldstein (1).

18. dubna 1940 přišel v jihokarolínském Sumteru na svět Joseph Leonard, jediné dítě v židovské rodině Goldsteinů (2–4). Otec Isadore, potomek přistěhovalců z Litvy a Ruského Polska (5), a matka Fannie, rozená Alpertová, vlastnili a v nedalekém městečku Kingstree provozovali oděvní obchod (2).

Do prvních narozenin chybělo malému Goldsteinovi pět dní, když se 13. dubna 1941 v newyorském Brooklynu narodil jiný židovský chlapec (6) Michael Stuart Brown jako první dítě (7) v rodině, kterou otec Harvey Brown živil jako prodejce textilu, zatímco domácnost vedla matka Evelyn, rozená Katzová (6). Tři roky po chlapci přišla na svět jeho sestra Susan (7).

Filadefie (1952–1966 Brown): radioamatér, chemik, novinář, medik

Roku 1952 se Brownovi přestěhovali do obce Elkins Park na severním předměstí pensylvánské Filadelfie; Mike tam navštěvoval Cheltenhamskou střední školu. Od zisku licence k provozu amatérské vysílačky ve 13 letech rostlo jeho celoživotní zaujetí vědou i žurnalistikou (7). Roku 1958 dokončil Cheltenhamskou střední školu (6), na Fakultě přírodních věd Pennsylvánské univerzity získal roku 1962 bakalaureát chemie a na téže univerzitě pak vystudoval lékařství, přestože většinu času věnoval práci redaktora a posléze šéfredaktora studentských novin Daily Pennsylvanian. V roce 1964 se stihl oženit s kamarádkou od dětství Alicí Lapinovou (7).

Lexington (–1962 Goldstein): chemik summa cum laude

Joe Goldstein vychodil základní a střední veřejnou školu v Kingstree, místě pracoviště obou rodičů, načež ve virginském Lexingtonu vystudoval Washingtonovu a Leeovu univerzitu; roku 1962 tam dosáhl bakalaureátu chemie stupně summa cum laude, načež odešel do texaského Dallasu studovat medicínu (2).

Dallas (1962–1966 Goldstein): studium lékařství, Seldinova nabídka

V Jihozápadním lékařském středisku Texaské univerzity v Dallasu ho přednosta oddělení vnitřního lékařství, nefrolog, budovatel Střediska a výborný učitel Donald Wayne Seldin podněcoval k volbě akademické dráhy; v posledním ročníku studia mu nabídl místo budovatele oddělení lékařské genetiky na dallaské katedře vnitřního lékařství, pokud se v tomto oboru předem někde vyškolí (2).

Boston (1966–1968): zrod badatelské dvojice

Absolventa z Filadelfie Browna a absolventa z Dallasu Goldsteina svedl osud dohromady, když po dosažení doktorátu medicíny v roce 1966 začali oba pracovat jako lékaři-absolventi a praktikanti na interním oddělení Massachusettské všeobecné nemocnice v Bostonu (2, 7). Ihned se tam spřátelili (2, 7, 8) a po skončení bostonské průpravy v roce 1968 spolu odešli do marylandské Bethesdy (9). Zrodila se tak badatelská spolupráce na celý život.

Bethesda (1968–1970 Goldstein, 1968–1971 Brown): enzymologie, familiární hypercholesterolemie

Oba přátelé byli přijati v Národním kardiologickém, pneumologickém a hematologickém ústavu tamních Národních ústavů zdraví (NIH) (9). Brown zpočátku jako klinický spolupracovník v oblasti gastroenterologie a dědičných nemocí, načež si v biochemické laboratoři vedené průkopníkem odhalování mechanismů regulace enzymů Earlem Reecem Stadtmanem osvojil techniky enzymologie a základní principy metabolické regulace a odvděčil se cenným příspěvkem ke Stadtmanovu úsilí (7), když s kolegou Amielem Segalem objevil, že regulační enzym v syntetické dráze glutaminu je kontrolován kovalentní vazbou nukleosidu uridinu (Brown MS, Segal A, Stadtman ER. Modulation of glutamine synthetase adenylylation and deadenylylation is mediated by metabolic transformation of the P_II-regulatory protein. Proc Natl Acad Sci USA 1971; 68(12): 2949–2953).

Joe Goldstein tehdy v laboratoři šéfa biochemické genetiky a čerstvého laureáta Nobelovy ceny Marshalla W. Nirenberga (2) zkoumal proteosyntézu: v letech 1968–1970 s C. Thomasem Caskeyem izoloval a purifikoval bílkoviny potřebné k dokončení proteosyntézy a objevil mechanismus jejich působení (Goldstein JL, Caskey CT. Peptide chain termination: effect of protein S on ribosomal binding of release factors. Proc Natl Acad Sci U S A 1970 Oct; 67(2): 537–543). Vedle toho sloužil u klinického ředitele ústavu a proslulého znalce poruch metabolismu lipidů Donalda S. Fredricksona jako lékař pacientů, z nichž někteří trpěli homozygotní formou familiární hypercholesterolemie s vysokou hladinou cholesterolu v krvi a těžkými změnami v cévní stěně vedoucími k velmi časným infarktům myokardu.

Zejména tyto případy Joe zaníceně probíral v rozhovorech s Mikem Brownem, sdílejícím jeho zaujetí; posléze příteli navrhl, aby se připojil k jeho zamýšlenému návratu na texaskou alma mater i k jeho budoucímu výzkumu genetické regulace metabolismu cholesterolu. Mike neváhal (2). Goldsteina však od návratu do Dallasu tehdy dělily ještě plánované dva roky Seldinem požadovaného studia lidské genetiky; roku 1970 zamířil do Seattlu na Washingtonskou univerzitu (9).

Seattle (1970–1972 Goldstein): frekvence monogenní hyperlipidemie a familiární hypercholesterolemie

Přednostou oddělení lékařské genetiky Washingtonské univerzity v Seattlu byl jeden ze zakladatelů genetiky člověka jako lékařského oboru Arno Gunther Motulsky (2). U něho Goldstein podnítil a s kolegy provedl populační genetickou studii frekvence dědičných poruch metabolismu lipidů v namátkovém souboru přeživších infarktu myokardu: u 20 % přeživších nalezl některý ze tří typů monogenní hyperlipidemie a u každé 500. osoby v populaci a každého 25. přeživšího infarktu zjistil heterozygotní formu familiární hypercholesterolemie (Schrott HG, Goldstein JL, Hazzard WR, Mcgoodwin MM, Motulsky AG. Familial hypercholesterolemia in a large kindred. Evidence for a monogenic mechanism. Ann Intern Med 1972 May; 76(5): 711–720).

Dallas (1971–1972 Brown): HMG-CoA reduktáza

Goldsteinem vyzvaný Mike nakonec přítele do Dallasu nenásledoval – on ho tam totiž dokonce o rok předešel: v roce 1971 nastoupil v Jihozápadním lékařském středisku Texaské univerzity v Dallasu (7) jako výzkumník (10) v oddělení gastroenterologie katedry vnitřního lékařství, jejímž přednostou byl Donald Wayne Seldin. Brzy nato Brown úspěšně solubilizoval a částečně purifikoval 3-hydroxy-3-methylglutaryl-koenzym A reduktázu (HMG-CoA reduktázu), do té doby neprobádaný enzym biosyntézy cholesterolu (Brown MS, Dana SE, Dietschy JM, Siperstein MD. 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A-reductase. Solubilization and purification of a cold-sensitive microsomal enzyme. J Biol Chem 1973 Jul 10; 248(13): 4731–4738). S Goldsteinem mezitím stanovil hypotézu, že příčinou familiární hypercholesterolemie jsou abnormality v regulaci tohoto enzymu (9).

Dallas (1972–1976): role, receptory a degradace LDL

Když po splnění podmínky Seldinovy nabídky nastoupil navrátilec ze Seattlu Goldstein v roce 1972 v Dallasu jako assistant professor na katedře vnitřního lékařství a historicky první přednosta nového oddělení lékařské genetiky Texaské univerzity (2, 9), začal s Brownem zmíněnou hypotézu testovat zkoumáním aktivity HMG-CoA reduktázy v kulturách kožních fibroblastů jedinců zdravých i trpících familiární hypercholesterolemií, a to bez přidání i s přidáním krevního séra (a tím cholesterolu) ke kultivační půdě (11). Tak spolu v buňkách zdravých lidí objevili negativní regulaci aktivity HMG-CoA reduktázy přítomností lipoproteinu o nízké hustotě (LDL) v kultivační půdě (Brown MS, Dana SE, Goldstein JL. Regulation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase activity in human fibroblasts by lipoproteins. Proc Natl Acad Sci USA 1973 Jul; 70(7): 2162–2166), kdežto při homozygotní familiární hypercholesterolemií žádný útlum aktivity enzymu nenacházeli (Goldstein JL, Brown MS. Familial hypercholesterolemia: identification of a defect in the regulation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase activity associated with overproduction of cholesterol. Proc Natl Acad Sci USA 1973 Oct; 70(10): 2804–2808).

Zakrátko prokázali defekt vazby LDL na buňky z jedinců s homozygotní formou familiární hypercholesterolemie (12), čímž objasnili selhávání lipoproteinů v útlumu syntézy HMG-CoA reduktázy i nadprodukci cholesterolu v těchto buněčných kulturách (Brown MS, Goldstein JL. Familial hypercholesterolemia: Defective binding of lipoproteins to cultured fibroblasts associated with impaired regulation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase activity. Proc Natl Acad Sci U S A 1974; 71(3): 788–792).

Předpokládali existenci povrchové buněčné struktury prostředkující dopravu LDL do nitra buněk (13). Téhož roku pomocí značkování LDL radioaktivním jódem (¹²⁵I) zjistili u normálních fibroblastů vazebná místa s vysokou afinitou vůči ¹²⁵I-LDL, kdežto u buněk z homozygotů s familiární hypercholesterolemií zjistili absenci vazebných míst; Brown s Goldsteinem tak prokázali existenci receptoru LDL (9). Mezitím po 9 letech bezdětného manželství porodila Alice Brownová roku 1973 dceru Elizabeth (7), právě když Brown s Goldsteinem přiváděli svou studii k závěru. Publikaci v prestižním biochemickém periodiku pak zdržela předpojatá negativní recenze; posléze však byl článek přijat (9) a 25. srpna 1974 uveřejněn (Goldstein JL, Brown MS. Binding and degradation of low density lipoproteins by cultured human fibroblasts. Comparison of cells from a normal subject and from a patient with homozygous familial hypercholesterolemia. J Biol Chem 1974 Aug 25; 249(16): 5153–5162).

Roku 1974 pak jmenovaný associate professor vnitřního lékařství Goldstein (2) spolu s Brownem zjišťoval, kde v buňce je LDL degradován a jak tato degradace potlačuje aktivitu HMG-CoA reduktázy a syntézu cholesterolu. Jako jedinou buněčnou organelu schopnou úplné a rychlé degradace LDL předpokládali lyzosom, bohatě vybavený kyselými hydrolázami. A Goldstein s Brownem pak skutečně lyzosomovou degradaci LDL potvrdili pomocí inhibitorů jako např. chlorochinu zvyšujícího pH lyzosomů a inhibujícího lyzosomové enzymy (Goldstein JL, Brunschede GY, Brown MS. Inhibition of proteolytic degradation of low density lipoprotein in human fibroblasts by chloroquine, concanavalin A, and Triton WR 1339. J Biol Chem 1975 Oct 10; 250(19): 7854–7862) i studiem kultur fibroblastů z nemocných s genetickou deficiencí lyzosomové kyselé lipázy, vázajících a internalizujících LDL, ale v hydrolýze jeho cholesterylesterů selhávajících, přestože byly schopné degradovat jeho bílkovinnou složku (Goldstein JL, Dana SE, Faust JR, Beaudet AL, Brown MS. Role of lysosomal acid lipase in the metabolism of plasma low density lipoprotein. Observations in cultured fibroblasts from a patient with cholesteryl ester storage disease. J Biol Chem 1975 Nov 10; 250(21): 8487–8495).

Jak LDL vytváří signál k potlačení HMG-CoA reduktázy, zkoumali pomocí jeho značkování radioaktivním jódem. Zjistili, že k povrchovému receptoru vázaný ¹²⁵I-LDL zůstává na buněčném povrchu po dobu kratší než 10 minut; do té doby většina k povrchu vázaných částeček vnikne do buňky, během dalších 60 minut je bílkovinná složka ¹²⁵I-LDL úplně rozložena na aminokyseliny a ¹²⁵I připojený k tyrosinovým zbytkům na LDL je uvolňován do kultivační půdy jako ¹²⁵I-monojódtyrosin (Goldstein JL, Basu SK, Brunschede GY, Brown MS. Release of low density lipoprotein from its cell surface receptor by sulfated glycosaminoglycans. Cell 1976 Jan; 7(1): 85–95).

Pomocí elektronmikroskopických analýz s užitím elektrondenzního ferritinu Goldstein a Brown s dallaským cytologem Richardem G. W. Andersonem objevili, že receptory LDL se u normálních lidských fibroblastů nacházejí v „povlečených jamkách“ buněčné membrány a účastní se pravděpodobně na adsorptivní endocytóze bílkovin, kdežto při homozygotní formě familiární hypercholesterolemie jsou receptory LDL nepřítomné (Anderson RG, Goldstein JL, Brown MS. Localization of low density lipoprotein receptors on plasma membrane of normal human fibroblasts and their absence in cells from a familial hypercholesterolemia homozygote. Proc Natl Acad Sci U S A 1976 Jul; 73(7): 2434–2438).

Dallas (1976): případ Despota, defekt internalizace

Uprostřed 70. let diagnostikoval kardiolog Neil Stone v Dětské nemocnici v Chicagu familiární hypercholesterolemií u 12letého chlapce trpícího krátkým dechem při mírné námaze, častou únavou a bolestí na hrudi při výsevu xantomů v kůži dolních končetin, 6násobné hladině celkového cholesterolu v krvi a pozitivní rodinné kardiovaskulární anamnéze léčeného po léta neúspěšně nízkotukovou dietou, cholestyraminem a kyselinou nikotinovou. Stone měl s hodinovou dialýzou 2× měsíčně poněkud lepší výsledky, posléze se však rozhodl přidat genetické vyšetření: pacientovi i jeho rodičům odebral vzorky kůže a poslal je do Dallasu Brownovi a Goldsteinovi, kteří u chlapce – označují jej iniciálami J. D., odjinud však známe plné jméno John Despota (13) – našli ve fibroblastech dva druhy mutací genu pro receptor LDL: jeden odpovědný za deficienci receptoru a druhý bránící jeho vstupu do buněk. Se zděděným matčiným nulovým genem a otcovým mutantním genem tvořily Johnovy fibroblasty receptor vázající LDL k buněčnému povrchu, avšak ten byl nezpůsobilý vstoupit s ním do nitra buňky. Brown s Goldsteinem tak objevili první případ defektu internalizace LDL (Brown MS, Goldstein JL. Analysis of a mutant strain of human fibroblasts with a defect in the internalization of receptor-bound low density lipoprotein. Cell 1976 Dec; 9(4 Pt. 2): 663–674).

S Andersonem pak na Despotových fibroblastech objevili příčinu selhávání internalizace v nahodilém rozptylu receptorů na buněčném povrchu namísto normálního shlukování v „povlečených jamkách“ vchlipujících se a uzavírajících se v měchýřky přepravující receptory s LDL do nitra buněk k lyzosomům, kde je LDL degradován a receptor se vrací pro další LDL (Anderson RG, Brown MS, Goldstein JL. Role of the coated endocytic vesicle in the uptake of receptor-bound low density lipoprotein in human fibroblast. Cell 1977 Mar; 10(3): 351–364).

Roku 1977 byl Goldstein jmenován přednostou dallaského Ústavu molekulární genetiky (9), Brown ředitelem dallaského Střediska genetických nemocí (7) a oba byli jmenováni profesory oboru (9). Tehdy s Andersonem prokázali chybění lipoproteinových receptorů v „povlečených jamkách“ těchto mutantních buněk (Anderson RG, Goldstein JL, Brown MS. A mutation that impairs the ability of lipoprotein receptors to localise in coated pits on the cell surface of human fibroblasts. Nature 1977 Dec 22–29; 270(5639): 695–699). Tímto nálezem potvrdili důležitost „povlečených jamek“ pro účinné vstřebávání molekul vázaných na receptory (Goldstein JL, Anderson RG, Brown MS. Coated pits, coated vesicles, and receptor-mediated endocytosis. Nature 1979 Jun 21; 279: 679–685).

Za tyto objevy vedoucí k vývoji nových léčiv snižujících hladinu cholesterolu v krvi a nebezpečí chorob oběhové soustavy (12) se Goldstein a Brown v následujících letech společně dočkali mnoha poct: v roce 1980 byli přijati do Národní akademie věd USA, roku 1982 obdrželi Cenu Lity Annenberg Hazenové za klinický výzkum, v roce 1984 Cenu Louisy Gross Horwitzové za biologii nebo biochemii, roku 1985 Cenu Alberta Laskera za základní lékařský výzkum (2, 7). Téhož roku publikovali doklad tzv. míchání exonů (tj. výměny exonů mezi geny) (12) a usoudili, že proces podporuje evoluci (Südhof TC, Goldstein JL, Brown MS, Russell DW. The LDL receptor gene: a mosaic of exons shared with different proteins. Science 1985; 228: 815–822).

Stockholm (1985): Nobelova cena

Rok 1985 završili opět spolu Nobelovou cenou za fyziologii nebo lékařství, poděleni „za své objevy týkající se regulace metabolismu cholesterolu“ každý polovinou sumy. Ve Stockholmu měli 9. prosince 1985 společnou nobelovskou přednášku (Brown MS, Goldstein JL. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science 1986 Apr 4; 232(4746): 34–47) a 10. prosince 1985 je švédskému králi představil člen Královské švédské akademie věd, profesor biochemie Viktor Mutt (11).

Dallas (1985–dosud): regental proffesors, SREBP, „Brownstein“

Texaská univerzita udělila Goldsteinovi i Brownovi zvláštní výhradně pro tamní laureáty Nobelovy ceny zavedený titul regental professor (2, 7). Roku 1988 vyznamenal americký prezident oba Národní medailí za vědu (4, 10). A oba regental professors Texaské univerzity pokračovali v dallaském Jihozápadním lékařském středisku ve vedení společné pracovní skupiny (8) zkoumající v následujících letech, jak buňky udržují pozoruhodnou stálost hladin cholesterolu v membránách vzdor proměnlivému přísunu i proměnlivým požadavkům.

V průkopnických studiích publikovaných od října 1993 Brown s Goldsteinem a spolupracovníky objevili transkripční faktory se sterolovou regulací připojené k endoplazmatickému retikulu (SREBP), jejichž aktivní části jsou v buňkách chudých na cholesterol uvolňovány z membrán proteolýzou a vstupují do jádra, kde se vážou na regulační sekvence DNA pro metabolismus lipidů. SREBP posilují transkripci genů kódujících HMG-CoA reduktázu a jiné enzymy biosyntézy cholesterolu i receptor LDL. Cholesterol z LDL v buňce blokuje proteolytické uvolňování SREBP z membrán, transkripce cílových genů klesá a buňky tvorbu cholesterolu tlumí, čímž předcházejí jeho hromadění (Yokoyama C, Wang X, Briggs MR, Admon A, Wu J, Hua X, Goldstein JL, Brown MS. SREBP-1, a basic-helix-loop-helix-leucine zipper protein that controls transcription of the low density lipoprotein receptor gene. Cell 1993; 75(1): 187–197; Brown, Goldstein et al. The SREBP pathway: Regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell 1997; 89(3): 331–340).

Brownovo i Goldsteinovo potěšení z úctyhodného tempa technologického pokroku biologie na přelomu století kalil patrný ústup klinicky orientovaných lékařů z biomedicínského výzkumu. V rozhovoru pro tisk tehdy hovořili o složité rovnováze vědy, lékařství a vzdělávání nezbytné k nástupu další generace úspěšných badatelů (8).

Věrní přátelé si během půlstoletí zvykli přerušovat každodenní úzkou spolupráci jen odjezdem vždy pouze jednoho z nich na kongres či konferenci, aby ve společném díle mohl mezitím pokračovat druhý z nich. Přezdívku „Brownstein“ si ostatně vysloužili právě tímto bezmála splynutím v jednu badatelskou bytost (14). A životní téma – cholesterol – zůstává v Brownově-Goldsteinově laboratoři dodnes hlavním předmětem společného zájmu (10).

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Pavel Čech

Kabinet dějin lékařství 3. LF UK

Ruská 87, 100 00 Praha 10

e-mail: pavel.cech@lf3.cuni.cz