Vztah sekrece a působení inzulínu – studium genetické determinace

Souhrn

Východisko.
Dispoziční index vyjadřuje sekreci inzulínu vztaženou na stupeň inzulínové senzitivity a je pro daný stupeň glukózové tolerance konstantní. Cílem studie bylo odhalit genetické determinanty ovlivňující hodnotu dispozičního indexu, tedy predispozici ke glukózové intoleranci.

Metody a výsledky.
Celkem 204 nediabetických jedinců s různou glukózovou tolerancí bylo rozděleno do skupin podle hodnot dispozičního indexu. Byly sledovány parametry glukózového a lipidového metabolismu, antropometrické parametry a údaje o rodinné anamnéze diabetu 2. typu. Mezi skupinami byly porovnány frekvence genotypů kandidátních genů. Skupiny jedinců v nejnižším (Q1) a nejvyšším (Q4) kvartilu hodnot dispozičního indexu se mezi sebou nelišily ve věku ani v poměru muži/ženy. Ve skupině Q1 byly zjištěny zhoršující se lačné i stimulované parametry glukózového metabolismu a lipidového profilu ve srovnání se skupinou Q4. Skupina Q1 je charakteristická vyšším počtem jedinců s metabolickým syndromem a lidí s rodinnou anamnézou diabetu. Rozdíly ve frekvencích genotypů kandidátních genů mezi skupinami Q1 a Q4 byly nalezeny u genů B2AR (rs1042714), PPARA (rs1800206), KCNJ11 (rs5219) a SLC30A8 (rs13266634).

Závěry.
Nízká hodnota dispozičního indexu je spojená se zhoršenou glukózovou tolerancí i dalšími projevy metabolického syndromu. Je asociována s geny ovlivňujícími sekreci inzulínu a geny souvisejícími s obezitou a energetickým metabolismem.

Klíčová slova:
diabetes mellitus 2. typu, dispoziční index, inzulínová senzitivita, sekrece inzulínu, kandidátní geny pro diabetes 2. typu.

ÚVOD

Udržení hladiny glykémie v přísném koncentračním rozmezí je předpokladem metabolické homeostázy. Glukózová tolerance je dána vztahem mezi sekrecí inzulínu pankreatickými beta buňkami a inzulínovou senzitivitou cílových tkání. Jakmile dojde k nerovnováze mezi sekrecí a účinkem inzulínu a jedinec již není schopen kompenzovat sníženou senzitivitu tkání zvýšením sekrece inzulínu či naopak snížení sekrece zvýšením senzitivity, dochází ke zhoršování glukózové tolerance, které může vést až ke vzniku diabetes mellitus 2. typu (DM2). Stále není jasné, zda v patogenezi DM2 je primární příčinou inzulínová rezistence, nebo zhoršená funkce beta buněk. Pro dysfunkci beta buněk svědčí výsledky recentních celogenomových asociačních studií, kdy DM2 asocioval především s geny s potvrzeným či předpokládaným vlivem na funkci beta buněk (1). Nicméně geny ovlivňující inzulínovou senzitivitu, zejména ve vzájemné interakci a v interakci s vnějšími faktory (dietetické vlivy, fyzická aktivita, stres aj.) hrají jistě také důležitou roli (2, 3).

Ve většině studií jsou parametry inzulínové senzitivity a sekrece inzulínu hodnoceny empirickými metodami, nebo jsou založeny na matematickém modelování kinetiky glukózového metabolismu během funkčních testů. Jednoduchý a v diagnostice často využívaný je orální glukózový toleranční test (OGTT). Z hodnot glykémie a inzulínu po stimulaci glukózou lze spočítat indexy popisující inzulínovou senzitivitu, resp. rezistenci. Funkci beta buněk pankreatu lze z OGTT vyjádřit pomocí inzulinogenního indexu. Tento index detekuje abnormality v sekreci inzulínu (4), i když nevypovídá o mechanismech sekrece, např. o pulzní sekreci inzulínu. Inzulinogenní index silně koreluje s indexem odvozeným z intravenózního glukózového testu (5).

Vztah mezi inzulínovou senzitivitou a sekrecí není lineární, nejlépe ho vystihuje hyperbolická funkce (obr. 1). Pro daný stupeň glukózové tolerance platí, že násobek inzulínové senzitivity a sekrece je konstantní, tzn., že změna inzulínové senzitivity se projeví ve změně sekrece a naopak. Tento násobek se nazývá dispoziční index a jeho nelineární podstata byla popsána a publikována Kahnem et al. (6). Hodnota dispozičního indexu jedince je ovlivněna jak genetickými, tak vnějšími faktory. Výsledkem jejich interakcí může být změna hodnoty dispozičního indexu v průběhu života. Nižší hodnoty dispozičního indexu vypovídají o zhoršené glukózové toleranci a riziku DM2.

Cílem naší studie bylo odhalit genetické determinanty ovlivňující hodnoty dispozičního indexu, tedy predispozici jedince ke glukózové intoleranci. 

SOUBOR NEMOCNÝCH A POUŽITÉ METODY

Do studie bylo zařazeno 204 nediabetických jedinců starších 30 let s různým stupněm glukózové tolerance, kteří se v letech 1999–2010 účastnili výzkumu genetického pozadí diabetu 2. typu v Endokrinologickém ústavu v Praze. Všichni účastníci studie byli podrobně seznámeni s protokolem vyšetření a podepsali informovaný souhlas schválený etickou komisí.

Medián věku byl 41,6 let (39,3–43,6) a BMI 25,4 kg/m² (24,5–26,4). Rodinná anamnéza diabetu 2. typu byla zjišťována v dotazníku. Podle přítomnosti diabetu 2. typu v anamnéze rodičů byli jedinci rozděleni na potomky diabetiků, kde alespoň jeden z rodičů měl diagnostikovaný DM2 a na kontroly, jejichž oba rodiče byli zdrávi.

Antropometrické parametry byly měřeny za standardních vyšetřovacích podmínek. Měřena byla výška, váha, obvody pasu, boků a břicha (přes pupek) a ze zjištěných hodnot byl vypočítán index tělesné hmotnosti (BMI) a poměr pasu a boků (WHR). Množství podkožního tuku a celkové tělesné svaloviny bylo stanoveno podle Matiegkových rovnic (7).

U všech jedinců byly zjišťovány bazální parametry glukózového a lipidového metabolismu (glykémie, inzulín, triglyceridy, celkový cholesterol, HDL- a LDL-cholesterol, volné mastné kyseliny – postupy stanovení viz www.endo.cz, detailní popis metod k dispozici u autorů), dále byl proveden tříhodinový orální glukózový toleranční test s odběry krve v 30minutových intervalech. Ze stimulovaných hodnot glykémie a inzulínu byly vypočítány indexy funkce beta buněk (IGI), inzulínové senzitivity (ISIcomp) a plocha pod křivkou (AUC) glykémie.

Použitou empirickou metodou, vypočítávající inzulínovou senzitivitu z OGTT, byl index ISIcomp (8):

kde G₀ (mmol/l) a I (mIU/l) jsou bazální hladiny glykémie a inzulínu a G_m a I_m jsou průměry glykémie a inzulínu během OGTT. Vzorec je validován na protokol počítající s 0., 30., 60., 90. a 120. minutou testu. Index vypovídá o celotělové inzulínové senzitivitě, zahrnuje v sobě obojí, tj. jaterní inzulínovou senzitivitu i inzulínovou senzitivitu periferních tkání.

Funkce beta buněk pankreatu byla hodnocena pomocí inzulinogenního indexu (IGI). Je to poměr vzestupu inzulínu ke vzestupu glukózy po 30 minutách po podání glukózy: 

kde I₀ (mIU/l) a G (mmol/l) jsou bazální hodnoty inzulínu a glykémie a I₃₀ a G₃₀ jsou hodnoty inzulínu a glykémie ve 30. minutě OGTT.

Dispoziční index (DI) byl vypočítán jako součin inzulínové senzitivity a funkce beta buněk, tedy v našem případě jako ISIcomp*IGI. Na základě hodnoty DI byli jedinci rozděleni do čtyř kvartilů (Q1, Q2, Q3 a Q4). Vzájemně byly porovnávány extrémní kvartily, tj. Q1 odpovídající 25 % nejnižších hodnot a Q4 odpovídající 25 % nejvyšších hodnot indexu.

Přítomnost metabolického syndromu byla zjišťována podle definice NCEP ATP III (2001) (9). Metabolický syndrom je detekován při přítomnosti 3 a více z 5 následujících znaků: obvod pasu ≥ 94 cm u mužů a 80 cm u žen, hladina triglyceridů ≥ 1,7 mmol/l nebo léčba hypolipidemiky, hladina HDL‑cholesterolu < 1 mmol/l u mužů a < 1,3 mmol/l u žen nebo léčba hypolipidemiky, krevní tlak  ≥ 130/85 mm Hg nebo léčba anti-hypertenzivy a hladina glukózy na lačno ≥ 5,6 mmol/l nebo léčba diabetu. Samostatně byla hodnocena vyšší lačná glykémie (IFG impaired fasting glucose), tj. glykémie ≥ 5,6 mmol/l a porušená glukózová tolerance (IGT impaired glucose tolerance), tj. glykémie ve 120. minutě OGTT 7,8 – 11 mmol/l.

Genetická část studie zahrnovala stanovení vybraných polymorfismů 19 kandidátních genů pro diabetes 2. typu. Stanovené polymorfismy uvádí tabulka 1. Z leukocytů periferní krve byla kitem QIAamp DNA Blood (Qiagene) vyizolována DNA, která byla amplifikována pomocí PCR (Biometra) a následně podrobena molekulárně genetické analýze. Ke genotypizaci bylo využito metod RFLP, SSCP (ALFexpres II, Amersham Pharmacia Biotech) nebo komerční TaqMan genotyping assays (Real-Time PCR LC-480 Roche, Applied Biosystems). Detailní popis jednotlivých metod je přehledně uveden např. v námi publikovaných kapitolách (10, 11).

Studované kandidátní geny lze rozdělit do následujících skupin:

1. MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young) geny a transkripční faktory (GCK, Ngn3, TCF7L2),
2. inzulínová sekrece a senzitivita (IL6, INS VNTR, KCNJ11, LRP5, SLC30A8),
3. lipidový metabolismus (FABP2, PPARA),
4. energetický metabolismus (ADIPOQ, B2AR, B3AR, FTO, NMB, PPARG2, PGC1a, UCP1, UCP2).

Statistická analýza

Výsledky jsou uváděny jako mediány s LCL (low confidental limit) a UCL (upper confidental limit). Získaná data nemají normální rozdělení, proto byl pro porovnání mezi skupinami zvolen neparametrický Mann-Whitneyův test (NCSS 2004, Utah, USA). Četnosti výskytu různých genotypových konfigurací pro jednotlivé polymorfismy byly porovnávány mezi skupinami Fisherovým exaktním testem. 

VÝSLEDKY

Ve sledovaném souboru bylo celkem 97 potomků diabetiků (63 žen a 34 mužů), medián jejich věku byl 41 let (38,9–45,1) a BMI 25,6 kg/m² (24,6–26,1). Kontrolní soubor tvořilo 107 osob (68 žen a 39 mužů) s mediánem věku 41,7 let (37,9–44,3) a BMI 24,9 kg/m² (23,7–26,4). Tyto skupiny se mezi sebou nelišily ve věku, BMI ani v zastoupení mužů a žen.

Biochemické a antropometrické parametry byly porovnávány mezi skupinami s nejnižším (kvartil Q1) a nejvyšším (kvartil Q4) dispozičním indexem (obr. 2, tab. 2).

Skupiny osob v kvartilech Q1 a Q4 se nelišily ve věku ani v zastoupení mužů a žen, ale jedinci v kvartilu Q1, tj. s nejnižšími hodnotami dispozičního indexu měli vyšší hodnoty BMI. Výrazněji se rozdíly v antropometrických parametrech projevily u žen. S nadváhou, případně obezitou v kvartilu Q1, souvisí i vyšší hladiny triglyceridů, volných mastných kyselin a nižší hladiny HDL-cholesterolu. Jedinci s nízkými hodnotami dispozičního indexu měli signifikantně vyšší hladiny lačné i stimulované glykémie oproti lidem s vyššími hodnotami dispozičního indexu a bylo mezi nimi více lidí s porušenou glukózovou tolerancí (IFG i IGT) a přítomností metabolického syndromu. V kvartilu Q1 se také nachází signifikantně více jedinců s diabetickými rodiči než v kvartilu Q4.

Signifikantní rozdíly ve frekvencích genotypů kandidátních genů pro DM2 mezi skupinami v kvartilech Q1 a Q4 jsou uvedeny v tabulce 3. Jedná se geny související s energetickým metabolismem (B2AR), lipidovým metabolismem (PPARA) a se sekrecí inzulínu (KCNJ11 a SLC30A8).

DISKUZE

V celosvětovém měřítku narůstá počet lidí s DM2 a obezitou. Tato onemocnění představují významný medicínský problém, zejména proto, že jsou doprovázena závažnými zdravotními komplikacemi. Léčba diabetu či obezity je dlouhodobá a finančně nákladná. Alarmující je fakt, že kromě zvyšující se prevalence  DM2 se významně zvyšuje i prevalence prediabetu, tj. počtu lidí s dysglykémií. Dysglykémie zahrnuje samostatnou lačnou hyperglykémii, postprandiální hyperglykémii, nebo kombinaci obou poruch. Postprandiální hyperglykémie, tj. porušená glukózová tolerance, souvisí především se snížením sekrece inzulínu po jídle (stimulace glukózou) a/nebo s inzulínovou rezistencí periferních tkání. Lačná hyperglykémie vypovídá více o poruše citlivosti zejména jaterních buněk na působení inzulínu.

Specifické funkční testy, na rozdíl od parametrů získaných z bazálních hodnot jako je HOMA nebo QUICKI, vypovídají o dynamice vztahu inzulínové senzitivity a sekrece. Zlatým standardem pro měření inzulínové senzitivity je euglykemický hyperinzulinemický clamp. Clamp však neposkytuje údaje o sekreci inzulínu a tak je nutné využít další testy, např. intravenózní glukózový toleranční test (IVGTT) nebo argininový stimulační test. Funkční testy, které poskytují údaje o inzulínové senzitivitě i sekreci jsou intravenózní glukózový test  nebo orální glukózový toleranční test (12). V klinické praxi i v epidemiologických studiích se nejvíce používá OGTT, kdy je pacientovi podáno 75 g glukózy nalačno a v půlhodinových intervalech se po dobu 2–3 hodin měří hladiny glukózy a inzulínu, případně C-peptidu v krvi. Vztah inzulínové senzitivity a sekrece inzulínu popsaný dispozičním indexem je pro konkrétní stupeň glukózové tolerance konstantní veličina. Vypovídá o schopnosti organismu kompenzovat zhoršení sekrece inzulínu vyšší senzitivitou a naopak zvýšením sekrece vyrovnat nízkou senzitivitu tkání. Ztráta této kompenzační schopnosti vede ke snížení hodnoty dispozičního indexu.

Hodnota dispozičního indexu závisí na použitých indexech inzulínové sekrece a senzitivity. Je doporučováno počítat s indexy, které jsou na sobě co možno nezávislé, tzn. odvozené z různých funkčních testů. Prakticky se však běžně používají i indexy odvozené z jednoho testu, normy dispozičního indexu je třeba stanovit na základě kontrolní skupiny (13).

V této studii jsme na souboru nediabetických jedinců ukázali, že snižující se hodnota dispozičního indexu souvisí s vyšší hmotností, zhoršujícím se lipidovým profilem a vyšší lačnou i stimulovanou glykémií. Přestože se střední hodnoty sledovaných parametrů pohybovaly víceméně v normě, je jasné, že jedinci s nižšími hodnotami indexu jsou ve větším riziku rozvoje metabolického syndromu a  DM2, na což poukazuje i zcela recentní přehledový článek (14).

Důležitým zjištěním v této studii je fakt, že nižší hodnoty dispozičního indexu, které jsou odrazem zhoršující se inzulínové senzitivity a funkce beta buněk, jsou charakteristické pro jedince s pozitivní rodinnou anamnézou  DM2. Rodinné studie i studie dvojčat prokázaly heritabilitu jak indexu sekrece inzulínu (rozmezí stanovené heritability v různých studiích: 0,50–0,78), tak v menší míře i indexu inzulínové senzitivity (0,08–0,59) (15). V souladu s výsledky celogenomových studií zaměřených na DM2 jsme prokázali asociaci zhoršené glukózové tolerance (nízké hodnoty dispozičního indexu) s geny souvisejícími se sekrecí inzulínu, v našem případě KCNJ11 a SLC30A8.

Produkt genu KCNJ11 (Kir6.2 – potassium inward rectifier) je podjednotkou ATP dependentního draselného kanálu pankreatických beta buněk. Kanál je proteinovým komplexem složeným ze dvou podjednotek, podjednotky formující vlastní pór kanálu (Kir 6.2) a regulační podjednotky, která je sulfonylureovým receptorem (SUR 1). Je to kandidátní gen pro  DM2 (16, 17). Polymorfismus Glu23Lys (rs5219) zvyšuje prahovou koncentraci ATP potřebnou pro zahájení sekrece inzulínu, a hraje tak významnou roli v glukózovém metabolismu. V rozsáhlých celogenomových analýzách (18) byla u tohoto polymorfismu potvrzena asociace s  DM2.

Protein SLC30A8 je členem rodiny zinkových transportérů. Zinek je důležitý pro syntézu, skladování i sekreci inzulínu. Varianty v genu SLC30A8 mohou ovlivňovat akumulaci zinku v inzulínových granulích, a ovlivňovat tak stabilitu inzulínu a jeho uvolňování. Nezávisle na sobě potvrdilo několik studií silnou asociaci polymorfismu Arg325Trp (rs13266634) s  DM2 (18–20).

Další signifikantní asociaci s nízkou hodnotou dispozičního indexu jsme nalezli u genů působících v energetickém a lipidovém metabolismu – B2AR a PPARA.

Beta-2 adrenergní receptor (B2AR) je hlavní lipolytický receptor v lidských tukových buňkách. Gen pro B2AR je proto kandidátním genem pro obezitu. Kromě tukové tkáně je exprimován také v kosterních svalech a pankreatických beta-buňkách. Může tak ovlivňovat i citlivost tkání k inzulínu a inzulínovou sekreci. Polymorfismus Gln27Glu (rs1042714) je asociován s obezitou (21), metabolickým syndromem (22) a různými dyslipidémiemi (23, 24). Nicméně závěry studií nejsou vždy jednoznačné, např. dánská studie u téměř 8000 lidí neukázala jednoznačnou asociaci polymorfismu Gln27Glu s obezitou, hypertenzí ani s diabetem (25).

Receptor aktivovaný peroxizomovými proliferátory alfa (PPARA) je exprimován zejména v játrech, ledvinách, srdci a příčně pruhovaném svalstvu. Experimentální studie prokázaly, že PPARA působí jako transkripční regulátor genů zapojených do lipidového metabolismu. Dříve publikované klinické studie poukázaly na vztah polymorfismu Leu162Val (rs1800206) k inzulínové senzitivitě (26) a lipidovému metabolismu (27). Asociační studie s diabetem 2. typu však nejsou jednoznačné. Zatímco Andrulionyte et al. (28) potvrdil asociaci plymorfismu Leu162Val s diabetem, Silbernagel et al. (29) neprokázal asociaci s diabetem ani s obezitou.

Asociace kandidátních genů pro diabetes, souvisejících se sekrecí inzulínu, se zdají být konzistentnější napříč publikovanými studiemi, u genů pro inzulínovou senzitivitu a dalších genů tato jednota neplatí. V naší práci jsme potvrdili zhoršující se glukózovou toleranci se dvěma geny, které mají vliv na sekreci inzulínu (KCNJ11, SLC30A8). U dalšího kandidátního genu TCF7L2 jsme zaznamenali tendenci k vyššímu zastoupení rizikových genotypů ve skupině s nižším dispozičním indexem, i když rozdíly nebyly statisticky významné (data nejsou uvedena). Stejně tak byla zřejmá, ale statisticky nevýznamná tendence k vyššímu zastoupení rizikových genotypů polymorfismů v genu FTO ve skupině s nízkým dispozičním indexem (data nejsou uvedena), což souvisí s vyššími hodnotami BMI a obvodovými rozměry v této skupině. Zbylé dva geny, u kterých jsme potvrdili asociaci s nižším dispozičním indexem, jsou geny zúčastněné v energetickém a lipidovém metabolismu (B2AR, PPARA).

Genetická náchylnost ke komplexnímu onemocnění, jakým je diabetes 2. typu, nebo glukózová intolerance obecně, je mozaikou složenou z genů zúčastněných v mnoha vývojových a metabolických drahách, je kombinací genů kandidátních nejen pro diabetes, ale i pro další metabolická onemocnění, např. pro obezitu. Naše studie potvrzuje nejen genetickou determinaci a heritabilitu sekrece inzulínu, ale ukazuje, že dispoziční index je ovlivněn i geny spojenými s energetickým a lipidovým metabolismem. 

Zkratky

AUC       – plocha pod křivkou glykémie

BMI       – poměr tělesné hmotnosti vg a výšky v²

DI          – dispoziční index

DM2      – diabetes mellitus 2. typu

HDL       – vysokodenzitní lipoprotein

HOMA   – Homeostatic Model Assessment

IFG         – porušená lačná glykémie

IGI         – inzulinogenní index

IGT        – porušená glukózová tolerance

ISIcomp – index inzulínové senzitivity

IVGTT   – intravenózní glukózový toleranční test

LDL       – nízkodenzitní lipoprotein

MODY   – Maturity Onset Diabetes of the Young

OGTT    – orální glukózový toleranční test

PCR       – polymerázová řetězová reakce

QUICKI – Quantitative Insulin Sensitivity Check Index

RFLP     – polymorfismus délky restrikčních fragmentů

SSCP      – polymorfismus jednovláknových řetězců

UCL       – horní hranice konfidenčního intervalu

WHR      – poměr obvodu pasu a obvodu boků  

Podpořeno grantem IGA MZ ČR NS/10209-3/2009.

Všem lékařům a sestrám z oddělení funkční diagnostiky pod vedením prof. MUDr. K. Vondry, DrSc. děkujeme za technické zajištění funkčních testů. Děkujeme i všem dobrovolníkům za účast ve studii.

Adresa pro korespondenci

RNDr. Markéta Vaňková, Ph.D.

Endokrinologický ústav

Národní třída 8, 116 94 Praha 1

fax: +420 224 905 325, e-mail: mvankova@endo.cz