Metodické možnosti stanovení počtu CTG/CAGopakování v trinukleotidových repeticích lidskéhogenomu

Overview

Východisko.
Dynamické mutace lidského genomu jsou novou třídou genových mutací, reprezentovaných nestabilnímpočtem trinukleotidových opakování, způsobující závažná dědičná neuromuskulární a neurodegenerativníonemocnění u lidí. Identifikace patologických expandovaných alel na molekulární úrovni je důležitá pro klinickoudiagnózu.Metody a výsledky. Pro molekulární diagnostiku expandovaných tandemových repeticí trinukleotidových sekvencíjsme zavedli efektivní TP-PCR metodu podleWarnera et al. (13). Pro rychlou detekci expandovaných CTG alel genuDMPK (myotonická dystrofie –MD) jsme tutometodu modifikovali do dvoufázového protokolu; nejprve byly pomocíPCR selektovány vzorky DNA heterozygotů s využitím primerů P1 a P2, ohraničujících trakt s repeticemi, druhévyšetření metodou TP-PCR bylo zaměřeno především na identifikaci patologické alely. Fluorescenčně značenýspecifický primer v TP-PCR byl použit pro přesné určení počtu CAGopakování v genu IT-15 (Huntingtonova choroba– HD) v diagnosticky důležité oblasti šedé zóny (rozmezí 35–39 CAG). Reprodukovatelnost výsledků PCR bylaověřena na kontrolních vzorcích DNA o známém genotypu a v případě MD také Southernovou hybridizací. Zejménajsme ukázalimožnost levnějšího PCR-P1/P2 a TP-PCR protokolu, který využívá barvení PCRproduktů separovanýchna polyakrylamidových gelech stříbrem.Závěr. Naše zkušenosti se zavedenímvýše uvedených PCRmetod do laboratorní praxe dokumentují obecnémožnostijejich významného uplatnění pro molekulární diagnostiku dědičných chorob charakterizovaných nestabilitou v trinukleotidovýchtraktech.

Klíčová slova:
neurodegenerativní onemocnění, myotonická dystrofie,Huntingtonova chorea, genDMPK, genIT-15,trinukleotidové repetice, expenze trinukleotidů, Triplet Primed PCR.