Molekulární metody v diagnostice trombofilních stavů

Overview

Molekulárně genetické metody pronikly do oblasti vyšetřování trombofilních stavů v 90. letech minulého století s prvními objevy inhibitorů koagulace – antitrombinu III (AT III), proteinu C (PC) a proteinu S (PS). Velkého rozšíření dosáhly s objevem molekulární příčiny APC rezistence v roce 1994 prof. Bertinou. V současné době je využívána celá skupina molekulárně genetických markerů s jasně prokázaným rizikem trombofilie – mutace F V Leiden 506R/Q, mutace protrombinu (F II) 20210G/A, mutace metylentetrahydrofolát reduktázy (MTHFR) 677C/T v homozygotní formě, mutace inhibitoru plazminogen aktivátoru (PAI‑1) 4G/5G, mutace jednotlivých inhibitorů koagulace a pak řada polymorfizmů, jejichž riziko je diskutováno – F XIII Val34leu, destičkové glykoproteiny, endoteliální protein C receptor a trombomodulin. Z metodologického hlediska jsou všechny metody postaveny na bázi polymerázové řetězové reakce (PCR), nicméně v poslední době prošly překotným vývojem, který umožnil značné snížení jejich pracnosti. V současné době se používá štěpení produktů PCR pomocí restrikčních endonukleáz, real time PCR a také multiplex PCR metod. Druhou oblastí, kde se využívá molekulárně genetických metod, je studium patofyziologie jednotlivých procesů. Zde byl v poslední době učiněn největší pokrok na poli rezistence na aktivovaný protein C (APC rezistence). Ačkoli se v 90. letech minulého století podařilo jednoznačně prokázat genetickou příčinu APC rezistence, stále se nezdařilo vysvětlit klinickou různorodost exprese tohoto stavu. Obdobná situace byla u protrombinové mutace, kde až poslední výzkumy nastínily možný mechanizmus exprese genetických změn do samotného koagulačního mechanizmu. Z hlediska dalšího vývoje molekulárně genetických metod je jasný příklon ke komplexnímu porozumění patofyziologických stavů a odklon od hledání jednotlivých defektů se stále menším relativním rizikem vzniku trombózy.

Klíčová slova:
trombofilie – genetické příčiny trombofilie – F V Leiden – protrombinová mutace

Úvod

Molekulárně genetické metody dovolují objasnit genetické příčiny v tomto případě trombofilních stavů. Již od samotného počátku diagnostiky trombofilních stavů, který vycházel ze studia rodin s vysokým výskytem trombotických komplikací, bylo zřejmé, že se jedná v řadě případů o geneticky podmíněné hereditární dominantně dědičné stavy. Již u prvních rodin s výskytem deficitu AT III byly popsány genetické příčiny tohoto defektu. Takto bylo u AT III popsáno na 150 příčinných mutací.

Molekulárně genetické metody pronikly do oblasti screeningového vyšetřování trombofilních stavů v 90. letech minulého století s prvními objevy inhibitorů koagulace (AT III, proteinu C a proteinu S). Velkého rozšíření dosáhly s objevem molekulární příčiny APC rezistence v roce 1994 prof. Bertinou.

Přes veškeré rozšíření těchto metod byly v následujících letech objevovány defekty na molekulární úrovni se stále menším rizikem pro vznik trombózy, což je patrné z obr. 1. Přesto až do konce minulého století existovala jasná představa, že pouze zjištění veškerých genetických příčin trombofilie povede k celkovému objasnění genetického rizika trombofilie.

V současné době je patrný odklon od této představy a stále větší pozornost je věnována objasnění komplexní patofyziologie koagulace na molekulární úrovni.

F V Leiden

Mezi bílou populací je faktor V Leiden (faktor V 1691G-A) nejčastější genetický defekt způsobující trombózu [1–6]. Mutace faktoru V byla poprvé popsána v roce 1994 Bertinou a spolupracovníky na univerzitním pracovišti v Leidenu [7], na základě nálezu rezistence na aktivovaný protein C (APC), která byla poprvé popsána v roce 1993 [8]. Frekvence výskytu kolísá v bílé populaci mezi 2 a 15 % [1]. Heterozygotní forma faktoru V Leiden zvyšuje riziko trombózy 3–8krát [1,9,10], naproti tomu homozygotní postižení představuje až 80násobné riziko [11] žilní trombózy.

Faktor V Leiden se vyskytuje u 20 % pacientů s žilní trombózou [2,9] a u více než 1/2 probandů u vybraných rodin s trombofilií. To znamená, že představuje nejčastější genetickou abnormalitu u pacientů s trombózou.

Protrombin 20210A

Mutace v 3’-nepřepisované oblasti protrombinového genu v pozici 20210 G-A je spojena se zvýšenou hladinou pro­trombinu a současně představuje zvýšené riziko vzniku trombózy [12]. Tato mutace byla popsána ve vysoké prevalenci (18 %) v rodinách s trombózou a v 6,2 % u pacientů s první trombózou [12].

Mechanizmus působení mutace v pozici 20210 G-A protrombinového genu je vysvětlován tím, že tato mutace podmiňuje zvýšení hladiny protrombinu, což vede ke zvýšení rizika trombózy [12]. Výskyt mutace v bílé populaci kolísá okolo 2 % s mnoha geografickými variacemi, přičemž výskyt mutace je vyšší v jižní než v severní Evropě [13]. To způsobuje značné rozdíly mezi pracemi udávajícími výskyt této mutace v populaci a relativní riziko mutace pro vznik trombózy. Např. v severní Evropě je výskyt 2 % (obdobně jako v české populaci) [14] s relativním rizikem okolo 2, zatímco v katalánské oblasti Španělska je prevalence 6,5 % [15] a relativní riziko 2, což představuje více než 6 % všech trombotických příhod.

Hyperhomocysteinemie

Lehce zvýšené hladiny homocysteinu jsou spojeny se zvýšeným rizikem trombózy [16–18]. Dvě studie prováděné na nerozdělené skupině pacientů ukázaly, že hladina 18,5 μmol/l u 5 % (resp. 10 %) jedinců vede k dvojnásobnému zvýšení rizika trombózy [17–19]. Z toho plyne, že hyperhomocysteinemie představuje 5–10 % všech trombotických příhod.

Hyperhomocysteinemie může vzniknout na základě genetických nebo získaných dispozic [20]. Mezi získané dispozice patří zejména nízký příjem vitaminů (B6, B12, kyseliny listové), který vede ke zvýšení hladiny homocysteinu [21,22]. Mezi genetické můžeme počítat velmi raritní deficit cystathion-b-syntetázy, jejíž homozygotní forma představuje klasickou hyperhomocysteinemii s velmi vysokými hladinami [23], a naopak velmi častou variantu genu metyltetrahydrofolátreduktázy (MTHFR), která vede k termolabilní variantě enzymu s lehce zvýšenou hladinou homocysteinu [24–26]. V současné době není jednoznačně stanovena přímá spojitost mezi variantou MTHFR 677TT, zvýšenou hladinou homocysteinu a rizikem vzniku trombózy [27].

Antitrombin III

Familiární deficit antitrombinu III po­-prvé popsal Egeberg v roce 1965 [28–30]. Již tato první práce ukázala, že defekt antitrombinu III je podstatně závažnější rizikový faktor pro vznik trombózy než defekty proteinů C a S, přičemž většina pacientů má manifestaci klinických projevů do 25 let věku [29,31]. To se netýká změny he­pa­rinového vazebného místa, která se vyskytuje často, ale v heterozygotní formě nepředstavuje riziko [31].

Na základě rozsáhlé studie bylo stanoveno trombotické riziko deficitu antitrombinu III jako 5násobné, což vychází z 1,1% výskytu deficitu ve skupině pacientů s žilní trombózou oproti 0,2% výskytu v kontrolní skupině [32]. Další práce uvádí výskyt deficitu antitrombinu III v rozmezí 1–0,5 % [28]. Mezi 4 000 zdravými dárci byl deficit anti­trombinu III nalezen v 0,02 % [33]. Tato data ukazují, že defekt antitrombinu III je velmi raritním postižením, nicméně je možné konstatovat, že se jedná o vysoce rizikový faktor pro vznik trombózy, což je patrné ze srovnání prevalence tohoto defektu u pacientů s žilní trombózou a u zdravých dárců (1 % oproti 0,02 %), což ukazuje na 50krát vyšší riziko u pacientů s deficitem antitrombinu III. I přes toto vysoké riziko představuje deficit antitrombinu III pouze 1 % všech trombotických stavů.

Z hlediska příčin mohou být deficity antitrombinu III klasifikovány do 2 skupin: vrozené a získané. Vrozené deficity jsou charakterizovány sníženou hladinou antigenu antitrombinu III, sníženou aktivitou antitrombinu III nebo kombinací obou těchto parametrů. Tyto deficity mají příčinu v dědičné poruše syntézy antitrombinu III nebo v syntéze mutantní molekuly antitrombinu. Poruchy jsou autozomálně dominantně dědičné.

Vrozené deficity antitrombinu III jsou rozděleny do dvou základních typů. Typ I, kvantitativní nedostatek antitrombinu III, je charakterizován paralelním snížením aktivity i antigenu antitrombinu III. Porucha je tedy ve snížené rychlosti syntézy antitrombinu III. Tento defekt představuje 80–90 % všech defektů antitrombinu III, přičemž hladiny antitrombinu III jsou sníženy na 50–70 % normálních hodnot. Typ II, funkční defekt antitrombinu III, je charakterizován nesouladem mezi koncentrací antigenu a funkční aktivitou antitrombinu III. Hladina antigenu je tedy normální, ale je porušena funkčnost molekul. Zde můžeme zařadit typy antitrombinu se sníženou afinitou k he­pa­rinu (AT III „Budapešť“, AT III „Milano“, AT III „Tokyo“), dále typy se sníženou schopností inaktivace serinových proteáz (AT III „Northwick Park“, AT III „Glasgow“) a také typy s porušenou schopností vazby na he­pa­rin (AT III „Tours“, AT III „Rouen“). Typ III je charakterizován syntézou abnormálních molekul antitrombinu III, kdy je snížena hladina pod fyziologickou mez (AT III „Johanesburg“, AT III „Budapest 2“, AT III „Utah“).

Do dnešní doby bylo popsáno okolo stovky mutantních forem molekul AT III [34,35]. Zavádění podrobnější klasifikace deficitů antitrombinu III naráží na velmi nízkou frekvenci tohoto postižení.

Získané deficity se mohou vyskytovat jednak u fyziologických stavů (např. u novorozenců, v pokročilém těhotenství) a dále u řady onemocnění a představují závažný problém. Příčinou deficitu může být snížená syntéza antitrombinu III (u jaterní cirhózy, léčby asparaginázou), zvýšené ztráty AT III (gastrointestinální choroby, nefrotický syndrom) a v neposlední řadě zvýšená konzumpce AT III (disseminovaná intravaskulární koagulace u traumat, sepsí, popálenin, úžehu a pooperačních stavů).

Protein C

V roce 1981 upozornily první práce na zvýšené riziko vzniku trombózy u pacientů s heterozygotním deficitem proteinu C [36,37]. Nebyl stanoven rozdíl mezi pacienty s různým typem deficitu (I nebo II) a základní mutací. Tyto studie upozornily, že velká většina pacientů má manifestaci klinických projevů trombózy již v mladém věku [38]. Současně je pozoruhodné, že u ně­kte­rých nemocných se vyskytuje i APC resistence jako další faktor zvyšující riziko trombózy [39].

Výskyt deficitu proteinu C u pacientů s trombózou analyzovaly 3 velké studie [40–42]. Ve všech byl stanoven výskyt deficitu proteinu C 3 %. Při srovnání s kontrolní skupinou bylo stanoveno také relativní trombotické riziko deficitu proteinu C, které činí 6,5 [42]. Prevalence 0,2% výskytu ve zdravé populaci byla stanovena na základě obsáhlé studie [36]. Tato prevalence v populaci, kombinovaná však s vysokým rizikem trombogenicity, znamená 1–2% podíl deficitů proteinu C na všech trombofilních stavech.

Gen způsobující deficit proteinu C je děděn autozomálně dominantně. Defekt se klinicky projevuje tromboembolickou nemocí typu superfaciální tromboflebitidy a juvenilní žilní trombózy.

Z hlediska diferenciace jsou známy dva typy deficitů proteinu C: kvantitativní (snížení antigenu proteinu C) a funkční. Funkční deficity proteinu Cmohou být způsobeny řadou mutací. Do dnešní doby bylo popsáno na 160 rozdílných mutací [44]. Heterozygotní postižení defektem proteinu C je spojeno se 7násobně zvýšeným rizikem trombózy.

Protein S

Protein S je důležitým antikoagulačním proteinem, který působí jako neenzymatický kofaktor APC při inaktivaci faktorů Va a VIIIa. Laboratorní screening deficitů proteinu S je komplikován faktem, že protein S cirkuluje v krevním oběhu ve dvou formách [45]. Volný protein S, který působí jako kofaktor APC, představuje asi 40 % celkového množství proteinu S.

Deficity proteinu S můžeme rozdělit na 3 základní formy. Typ I je charakterizován snížením celkového proteinu S nejčastěji v důsledku snížené syntézy, typ II je charakteristický sníženým aktivity proteinu S a III typ se sníženou hladinou volného proteinu S s normální aktivitou celkového proteinu S.

Většinu deficitů představuje typ I nebo směs typů I a III. Do současné doby bylo popsáno velmi málo případů deficitů proteinu S typu II. Prevalence deficitů proteinu S představuje 1–2 % pacientů s hlubokou žilní trombózou a 6 % rodin s trombofilií. Z genetického hlediska bylo dosud popsáno 70 odlišných mutací v genu pro protein S.

Patofyziologie působení mutace F V Leiden

Z hlediska patofyziologie koagulačních reakcí hraje F V klíčovou roli jak v prokoagulační, tak antikoagulační kaskádě procesů. V aktivované formě slouží jako kofaktor F Xa v protrombinázovém komplexu, který takto katalyzuje přeměnu protrombinu na trombin. V neaktivované formě slouží F V jako kofaktor APC v regulaci aktivity F VIIIa. Tato dvojí role umožňuje F V při genetických a získaných defektech ovlivňovat manifestaci těchto poruch do hemoragické nebo trombotické formy [46,47]. Pro objasnění této manifestace je nutné přesně poznat prokoagulační a antikoagulační formu F V.

Gen kódující lidský faktor V má velikost přibližně 80 kb a je lokalizován na dlouhém rameni chromozomu I. Jak je patrné z obr. 2, gen sestává z 25 exonů a 24 intronů [46], které se transkribují do 6,8 kB mRNA, jež kóduje řetězec 2 224 aminokyselinových zbytků s 28 aminokyselinami signálního peptidu. Tento peptid je pak odstraněn při přechodu do endoplazmatického retikula.

Takto vzniklé molekuly F V jsou přítomné v plazmě jako jednořetězcový glykoprotein v koncentraci 21 nM [48] (20–25 % F V je dále skladováno v a granulích trombocytů) [49]. F V sestává z A1–A2–B–A3–C1–C2 domén s totožnou organizační strukturou, jako má F VIII. A domény F V a F VIII vykazují značnou homologii a mají přibližně ve 40 % totožné sekvence.

Maturace F V obsahuje extenzivní post‑ribozomální modulaci. V poslední době se studie zaměřily zejména na N-glykosylaci. Bylo studováno 37 glykosylačních míst a jejich vliv na strukturu a funkci kofaktorů. Rozdílná glykosylace C2 domény vede ke tvorbě dvou rozdílných variant F V, nazvaných FV1 a FV2. Obě varianty cirkulují v plazmě v poměru 33 : 67 (FV1/FV2). Tyto dvě varianty disponují rozdílnými vlastnostmi (pro‑ a antikoagulačními) a v modelových případech se také chovají rozdílně [50].

Prokoagulační funkce F Va

Neaktivovaný F V má malou prokoagulační aktivitu až do doby aktivace malým množstvím trombinu nebo F Xa prostřednictvím štěpení v místech Arg709, Arg1018 a Arg1545. Aktivací vzniklá molekula F Va je heterodimer [51].

Na rozdíl od F V, F Va zvyšuje F Xa aktivovanou přeměnu protrombinu v protrombinázovém komplexu. Lze předpokládat, že vyštěpená B-doména alostericky inhibuje vazbu F V v aktivním místě F Xa [52].

Mechanizmus, jakým F Va působí na F Xa, není plně znám. Na základě posledních prací lze předpokládat, že F Va zvyšuje vazebnou afinitu F Xa k fosfolipidům přibližně 100krát. Současně se podařilo prokázat, že F Va v protrombinázovém komplexu nemění vazebné místo F Xa, ale že zvyšuje afinitu protrombinázového komplexu k protrombinu a zajišťuje nárůst vazebných míst.

F Va kofaktorová aktivita je balancována prostřednictvím APC, který F Va proteolyticky štěpí v místech Arg306, Arg506 a Arg679 těžkého řetězce, přičemž nejslabší inaktivace je prostřednictvím štěpení v místě Arg679. Dle posledních poznatků jsou navrženy 2 patofyziologické modely štěpení F Va. První model předpokládá preferenční štěpení v místě Arg506 následované štěpením v místě Arg306. Alternativně může být F Va inaktivován přímo štěpením v místě Arg306. Štěpení v místě Arg506 též snižuje afinitu F Va k F Xa, zatímco štěpení v místě Arg306 způsobuje plnou inaktivaci F Va [53].

Antikoagulační funkce F Va

Kromě prokoagulační funkce disponuje F Va i antikoagulační funkcí, a to v případě aktivace APC. V tomto případě stimuluje proteolytické štěpení F VIII [54]. Tento model dokazují poslední experimentální práce, kdy byla přídavkem čištěného F V obnovena funkce APC jak u zdravých pacientů, tak u rodin s Leidenskou mutací. Experimenty využívaly měření generace trombinu.

Pokud tedy požadujeme po F V antikoagulační funkci, musí být štěpen v pozici Arg506. Na rozdíl od APC zprostředkovaného štěpení v místech Arg306 a Arg679, které nevykazuje antikoagulační aktivitu.

F V a trombofilie

Takto popsané cesty aktivace F V nám ukazují na balancování pro antikoagulační aktivity faktoru V a její význam pro udržení hemostatické rovnováhy.

Vliv mutace F V Leiden na prokoagulační a antikoagulační formu F V

APC rezistence je in vitro popsaný fenomén, který je charakterizován slabou antikoagulační odpovědí na APC v plazmě. Takto snížená citlivost k APC vede k nedostatečné regulaci tvorby trombinu. Takto je APC rezistence asociována se zvýšeným rizikem vzniku trombózy. APC rezistence je až v 90 % případů spojována s mutací F V Leiden.

Mutace F V Leiden zásadně ovlivňuje pro‑ a antikoagulační rovnováhu F Va. Leidenská mutace, která je příčinou zániku štěpného místa Arg506, nám způsobuje nedostatečné snížení prokoagulační aktivity F Va, což nám vysvětluje prokoagulační stavy u nositelů Leidenské mutace [55]. Nicméně poslední práce ukázaly, že PS a F Xa mohou kompletně eliminovat vlivy APC zprostředkované inkativace F Va a F VIIIa. Takto lze uspokojivě vysvětlit účinek nízkomolekulárních he­pa­rinů v prevenci tromboembolické choroby u nosičů mutace F V Leiden.

Objevení druhé cesty působení F Va, kdy prostřednictvím APC slouží jako kofaktor při proteolytickém štěpení F VIII, nám pomůže vysvětlit vliv Leidenské mutace. Jelikož F V s leidenskou mutací nedisponuje štěpným místem v pozici Arg506, nemůže vznikat antikoagulační forma F Vac a takto je vykazována slabá kofaktorová aktivita APC při proteolýze F VIII.

Avšak nejen genetické defekty mohou vysvětlovat patologické působení APC rezistence v ně­kte­rých případech. V poslední době byl popsán také výskyt inhibitorů proti F V, což také může zvyšovat expresi APC rezistence. K vývoji inhibitorů proti FV stačí malé množství bovinního trombinu, který je přidáván do derivátů fibrinogenu získaných z kryoprecipitátu [56].

Objasnění podrobné patogeneze působení F V Leiden vede k závěru, že pro vysvětlení klinické exprese trombofilního stavu je nejdůležitější ozřejmění interakce alespoň jedné geneticky podmíněné trombofilie s jedním a více získanými stavy.

F II 20210G/A

Trombin hraje klíčovou roli v regulaci koagulační kaskády, jelikož interaguje jako prokoagulační enzym a interaguje s aktivovanými faktory XII, XI, VIII, V a také trombinem aktivovaným inhibitorem fibrinolýzy (TAFI) a hlavně štěpí fibrinogen na fibrin.

Rozhodující role trombinu v regulaci hemostázy je ilustrována právě na případu protrombinové mutace 20210 G/A. Tato mutace je příčinou zvýšené koncentrace protrombinu v plazmě a takto predisponuje nosiče ke vzniku trombózy.

F II 20210A mutace je lokalizovaná v 3’netranslatované oblasti (3’UTR) do protrombinové mRNA, kde je většina těchto pozic pre‑mRNA endonu­kleolyticky štěpená a polyadenylovaná. Molekulární mechanizmus mutace byl dosud vysvětlován zlepšením funkce 3’ukončování, což zvyšuje rozpoznávání štěpného místa protrombinu a akumulaci 3’korektně ukončené mRNA v cytoplazmě a takto podpořenou syntézu proteinu [57,58].

Nicméně poslední práce zabývající se mutacemi v blízkosti místa 20210 ukázaly, že tento předpoklad ne zcela vysvětluje celou situaci. Danckwardtovi et al se totiž podařilo prokázat u 2 pacientů, kteří prodělali trombotickou komplikaci v mladém věku, mutaci F II 20221T. Při podrobném studiu modelů působení vlivu této mutace na štěpné místo v pozici 20210 autoři nejdříve prokázali, že mutace F II 20210G má největší pozitivní vliv na mRNA expresi (2,15krát násobek normálního stavu), dále mají pozitivní vliv i záměny F II 20210C a F II 20210T (1,4krát a 1,5krát). Z tohoto důvodu autoři provedli řadu experimentů k objasnění patofyziologické exprese těchto změn.

Po řadě experimentů se podařilo prokázat, že mutace F II 20221T je zajímavá, jelikož leží 11 párů bazí od místa 20210 v lemující oblasti genu (FS). Specifita a efektivita prodlužování 3’ konce mRNA je závislá na vazbě multiproteinového komplexu. Proto je důležité poznat funkci v těsné oblasti kolem štěpného místa. V kompetitivní studii byl porovnáván vliv mutací F II 20210C a F II 20210T s protrombogenní mutací F II 20210G a vliv mutace F II 20221T v oblasti blízké tomuto štěpnému místu.

Bylo prokázáno, že mutace F II 20221T (právě na modelech štěpného místa 20210 s mutací C a T) zvyšuje efektivitu prodlužování 3’ konce mRNA stejně jako mutace F II 20210A, což demonstruje, že mutace v FS oblasti může ovlivnit prodlužování 3’ konce F II.

Systematická analýza 3’ prodlužování F II odhalila neobvyklou strukturu pozměněné sekvence, která zajišťuje vyváženost tvorby F II. Autoři takto demonstrují, že poruchy F II jak ve štěpném místě, tak v blízké oblasti štěpného místa predisponují ke klinické manifestaci mutace. Takto ozřejměná funkce mutace F II 20221T představuje první mutaci spojenou s trombofilií v uridin bohaté oblasti, která není přepisována do mRNA. Tudíž pro její diagnostiku není možné použít RT PCR metod, ale musí být prováděna diagnostika na bázi genomické DNA.

Práce byla podpořena z grantu IGA MZ NR-9282/2007.

Doručeno do redakce: 5. 2. 2009

Mgr. Luděk Slavík, Ph.D.

www.fnol.cz

e‑mail: ludek.slavik@fnol.cz